铅对体外培养大鼠海马神经细胞生长和Oct-2蛋白表达的影响

目的　探讨铅对海马神经细胞生长发育和对Ⅱ型POU域蛋白Oct 2表达的影响。方法　采用大鼠海马神经细胞体外培养建立细胞模型 ,醋酸铅的染毒浓度分别为 10 -1、10 0 、10 1、10 2 、10 3μmol/L ,对照组给予等量培养液。染毒后 2 4h用免疫组织化学法检测神经细胞和神经胶质细胞的标志物神经丝 (NF)和神经胶质原纤维酸性蛋白质 (GFAP)以及Oct 2蛋白的表达。结果 10 μmol/L及 以上浓度醋酸铅组海马神经细胞胞体减小、轴突突起长度和细胞间连接减少。GFAP免疫组化结果发现1μmol/L醋酸铅即可使GFAP阳性细胞数明显增加 ,与对照组相比差异具有统计学意义。此外 ,1μmol/L的醋酸铅可导致神经元和神经胶质细胞Oct 2表达阳性面积比与对照组相比差异具有统计学意义 ,10 μmol/L以上浓度醋酸铅作用下 ,Oct 2表达阳性面积比和吸光度均高于对照组 ,差异具有统计学意义。结论　醋酸铅在抑制神经元生长和分化的同时可刺激神经胶质细胞增生 ,铅对中枢神经系统的部分毒作用至少与其导致的Oct 2表达增加有关     

铅对海马神经细胞Brn-3a表达的影响与致凋亡作用

目的　探讨体外条件下铅对神经细胞内转录因子Brn 3a的表达和致凋亡作用。方法　采用海马神经细胞体外培养建立细胞模型 ,醋酸铅的染毒浓度分别为 0 1、1、10、10 0、10 0 0 μmol L ,对照组给予等量培养液。染毒后 2 4h及 4 8h时MTT法测定各组细胞的存活率 ;免疫组织化学法测定Brn 3a的表达以及TUNEL法检测神经细胞凋亡。结果　引起海马神经细胞存活率明显下降的醋酸铅的最低浓度是 10 μmol L ,醋酸铅浓度越高 ,细胞存活率越低。1μmol L醋酸铅可引起Brn 3a阳性细胞积分光密度显著下降 (P <0 0 5 ) ,10 μmol L醋酸铅可引起Brn 3a阳性面积比的显著下降 (P <0 0 1)。 1μmol L是醋酸铅引起培养海马神经细胞凋亡的最低浓度 ,各组细胞凋亡程度呈现明显的浓度依赖效应。结论　铅对发育期海马组织的损害至少部分是与铅所致神经细胞凋亡相关联的 ,并且铅导致培养海马神经细胞Brn 3a的表达下降很可能是铅诱导神经细胞凋亡的原因之一     

一氧化氮合酶在氟致大鼠原代海马神经细胞氧化损伤及细胞凋亡中的作用

目的采用一氧化氮合酶(e NOS)抑制剂L-亚氨基乙基鸟氨酸(L-NIO)探讨一氧化氮合酶在氟致大鼠原代海马神经细胞氧化损伤及细胞凋亡中的作用。方法将体外培养的大鼠海马神经细胞分为对照(空白培养基)组和Na F(0.05、0.1、0.2、0.4、0.5、1、2、4 mmol/L)单独染毒组及L-NIO(1、2、3、4、5、10μmol/L)单独染毒组,染毒48 h后,采用CCK-8法测定细胞活性。将大鼠海马神经细胞分为对照(空白培养基)组、Na F(0.2、1 mmol/L)单独染毒组、Na F和L-NIO联合染毒组(0.2 mmol/L Na F+3μmol/L L-NIO和1 mmol/L Na F+3μmol/L L-NIO),染毒48 h后,检测细胞中e NOS蛋白和m RNA的表达水平及细胞凋亡情况以及细胞培养液中一氧化氮(NO)含量和NOS活力。结果与对照组相比,0.02~4 mmol/L Na F染毒组及4~10 mmol/L L-NIO染毒组大鼠海马神经细胞的存活率均较低,差异有统计学意义(P0.05)。与对照组相比,仅0.2、1 mmol/L Na F染毒组大鼠海马神经细胞中e NOS蛋白和m RNA的表达水平升高,除0.2 mmol/L Na F染毒组e NOS蛋白的表达水平外,差异均有统计学意义(P0.05)。与相同浓度Na F染毒组相比,0.2、1 mmol/L Na F+3μmol/L L-NIO染毒组大鼠海马神经细胞中e NOS蛋白和m RNA的表达水平降低,差异均有统计学意义(P0.05)。与对照组相比,仅1 mmol/L Na F染毒组大鼠海马神经细胞的凋亡率升高,差异有统计学意义(P0.05)。与相同浓度Na F染毒组相比,0.2、1 mmol/L Na F+3μmol/L L-NIO染毒组大鼠海马神经细胞的凋亡率较低,差异均有统计学意义(P0.05)。与对照组相比,0.2、1 mmol/L Na F染毒组大鼠海马神经细胞培养液中NO含量和NOS活力较高。与相同浓度Na F染毒组相比,0.2、1 mmol/L Na F+3μmol/L L-NIO组大鼠海马神经细胞培养液中NO含量和NOS活力较低,差异均有统计学意义(P0.05)。结论过量氟可致大鼠原代海马神经细胞NOS活力上升,NO合成增强,导致氧化损伤及细胞凋亡;L-NIO可以拮抗过量氟引起的原代海马神经细胞e NOS蛋白、m RNA表达及细胞凋亡率增高,起到一定的神经保护作用。     

铅对HK-2细胞转分化及纤维化相关因子表达的影响

目的 探讨铅在人肾小管上皮细胞表型转化中的作用及对纤维化相关因子的影响.方法 体外培养人类近端肾小管上皮细胞系(HK-2)细胞,以2.5、5.0、10.0μmol/L醋酸铅剂量染毒,以Oμmol/L醋酸铅剂量组为对照组,应用形态学、间接免疫荧光-流式细胞术、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)观察醋酸铅染毒72 h HK-2细胞形态、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和纤维连接蛋白(FN)表达的改变,以及对纤维化相关因子转化生长因子(TGF-β1)、结缔组织生长因子(CTGF)的影响.结果 5.0、10.0μmol/L醋酸铅可使肾小管上皮细胞形态发生明显改变.5.0、10.0μmol/L醋酸铅组α-SMA阳性细胞率分别为9.32%,和6.98%,明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01);与对照组比较,5.0、10.0μmol/L醋酸铅组FN蛋白表达增高,差异有统计学意义(P<0.01).与对照组比较,5.0、10.0μmol/L醋酸铅组细胞TGF-β1MRNA以及蛋白质表达明显增强,2.5、5.0、10.0μmol/L醋酸铅组CTGFmRNA以及蛋白质表达明显增强,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.05).结论 铅在体外可诱导肾小管上皮细胞转分化并能增强FGF-β1、CTGF、FN表达.     

铅对原代培养海马神经细胞DNA损伤作用

目的 通过检测细胞生长抑制和凋亡相关的DNA损伤蛋白在大鼠原代培养海马细胞中的表达与原代培养海马细胞DNA损伤的相关性,探讨铅的神经毒理作用机制.方法 原代培养的海马神经细胞,于培养7 d全量更换培养液后加入不同浓度醋酸铅0.2、1.0、10 μmol/L,置于37℃、5%CO2培养箱继续培养24 h;蛋白免疫印迹(western blot)方法检测生长抑制DNA损伤诱导因子(GADD 153)表达;彗星实验检测大鼠海马原代培养神经细胞DNA损伤程度.结果 与对照组比较,随着染铅浓度增高,原代培养的海马神经细胞中的DNA的尾距(OTM)和彗尾值增大,0.2、1.0μmol/L染铅组GADD 153蛋白表达较弱,染铅浓度为10 μmol/L时,表达明显增加.结论 细胞DNA损伤与GADD 153蛋白表达呈一定相关性.     

铅对大鼠脑细胞一氧化氮合酶表达的影响

目的观察实验性铅中毒对大鼠脑细胞一氧化氮合酶(NOS)表达的影响,为进一步揭示铅的神经毒作用机制提供科学依据。方法取健康成年雄性SD大鼠24只,随机分为4组,每组6只,经腹腔注射醋酸铅连续染毒5d,剂量分别为25、50、100mg/kg体重,分别取海马、皮层部位脑组织,用免疫组化方法分别测定海马、皮层组织中神经元型一氧化氮合酶(nNOS)和依赖型一氧化氮合酶(iNOS)的蛋白含量。结果各剂量染铅组皮层、海马组织中iNOS表达与对照组相比,明显升高(P均<0.05),并有良好的剂量-反应关系(r=-0.727,P<0.05)。各剂量染毒组海马nNOS表达明显升高(P均<0.05),并有良好的线性关系(r=0.847,P<0.05),皮层组织nNOS表达无明显变化(P均>0.05)。结论铅所引起的神经细胞毒性可能通过铅诱导NOS的高表达,使得NO生成过多进而造成神经损害。     

miR - 107在铝引起学习记忆下降及Aβ1 - 42沉积中的作用

目的 探讨miR - 107在麦芽酚铝染毒致大鼠学习记忆下降及Aβ1 - 42表达升高中的作用机制。方法 细胞实验:麦芽酚铝染毒HEK293细胞,对照组、低剂量组（100 μmol/L）、中剂量组（200 μmol/L）、高剂量组（400 μmol/L）染毒24 h, RT - qPCR检测 miR - 107表达水平,ELISA检测 BACE1、Aβ1 - 42表达量。动物实验:健康2月龄雄性SD大鼠,按体重随机分为对照组（生理盐水）、低剂量组（10 mM/kg）、中剂量组（20 mM/kg）、高剂量组（40 mM/kg）,采用腹腔注射染毒45 d,Morris水迷宫实验测定大鼠的学习记忆能力, RT - qPCR检测大鼠海马miR - 107的相对表达量。结果 不同剂量麦芽酚铝染毒HEK293细胞24 h后,与对照组相比,低、中、高剂量组miR - 107相对表达量降低（F = 11.385,P＜0.001）;中、高剂量组BACE1和Aβ1 - 42表达量均升高（P＜0.05）。Morris水迷宫实验结果:定位航行实验表明大鼠逃避潜伏期没有变化（F = 0.662, P＞0.05）;空间探索实验表明大鼠穿越平台次数（F = 0.069,P＞0.05）和目标象限停留时间(F = 0.779,P＞0.05)均没有变化。RT - qPCR结果:与对照组相比,中、高剂量组大鼠海马miR - 107相对表达量降低（F = 16.654,P＜0.01）。结论 麦芽酚铝染毒后,miR - 107相对表达量在染铝早期即出现降低:BACE1、Aβ1 - 42表达量升高,提示铝染毒致大鼠学习记忆能力下降及BACE1、Aβ1 - 42表达升高可能与早期miR - 107表达降低有关。     

微囊藻毒素-LR对原代大鼠肝细胞p-JNK1/2、p-P44/42、p-P38蛋白水平的影响

[目的]研究低剂量微囊藻毒素-LR(microcystin-LR,MC-LR)染毒原代大鼠肝细胞对细胞内磷酸化的c-jun氨基末端激酶(p-JNK1/2)、磷酸化的细胞外信号激酶(p-P44/42)、磷酸化的P38丝裂原活化蛋白激酶(p-P38)蛋白水平的影响。[方法]采用改良胶原酶灌流法建立的原代大鼠肝细胞培养模型,以MC-LR终浓度1×10-9、1×10-10、1×10-11、1×10-12mol/L 4个剂量染毒细胞,分别培养至3、6、12、24h 4个时间点后裂解细胞获取总蛋白,用Western法检测分析丝裂原蛋白激酶家族(MAPKs)磷酸化蛋白p-JNK1/2、p-P44/42、p-P38水平。[结果]染毒原代大鼠肝细胞3、6h后p-JNK1/2、p-P44/42、p-P38蛋白表达水平随染毒剂量降低而上升,在1×10-10或1×10-11mol/L剂量组蛋白水平达到峰值后随染毒剂量降低而蛋白水平增幅减小;染毒至12h除p-P38各剂量组蛋白水平升高外,其余目标蛋白各剂量组与对照组相比差异无统计学意义;染毒24h各目标蛋白各剂量组与对照组相比差异无统计学意义。[结论]低剂量微囊藻毒素可促进原代大鼠肝细胞p-JNK1/2、p-P44/42、p-P38水平升高且具有时间效应关系。     

铅抑制NF-kB、Bcl-2蛋白表达诱导人肾小管上皮细胞凋亡

目的 研究醋酸铅对人肾小管上皮细胞系HK-2细胞NFJeB、Bcl-2表达的影响及与细胞凋亡的关系.方法 体外培养HK-2细胞分为0、2.5、5、10、20 μmol/L醋酸铅组,分别染毒72 h,应用间接免疫荧光-流式细胞术检测HK-2细胞NF-kB、Bel-2蛋白表达的改变,用Annexin-V/PI双染法检测细胞凋亡.结果 随着染铅剂量增加HK-2细胞NF-KB、Bcl-2蛋白表达逐步降低,NF-kB与Bcl-2降低显著相关(r＝0.71,P＜0.01);细胞凋亡率随着铅剂量增加而增加,在5、10、20μmol/L铅组与对照组比较差别有统计学意义(P＜0.01);细胞凋亡率与NF-kB、BcI-2蛋白表达呈明显负相关(r＝-0.625,P＜0.01;r＝0.709,P＜0.01).结论 醋酸铅能下调HK-2细胞.NF-kB、Bcl-2基因的表达,这可能是其诱导HK-2细胞凋亡的途径之一.     

牛磺酸拮抗铅对原代培养皮层神经元的影响

目的:研究牛磺酸拮抗铅对原代培养的皮层神经元生长及存活的影响。方法:通过建立新生大鼠皮层神经元原代培养,用不同浓度醋酸铅染毒和给予牛磺酸干预,观察神经细胞的生长和存活情况。结果:终浓度为10-8mol/L的醋酸铅即可抑制神经元突起生长,导致细胞生长活力下降,终浓度为1.6×10-3mol/L的牛磺酸能够抑制这种损害作用,促进神经元生长。结论:牛磺酸能够拮抗铅抑制神经元生长和存活的毒性。     

铅对培养大鼠海马神经元mGluR5 mRNA和蛋白表达水平的影响

目的 研究铅暴露对海马神经元代谢性谷氨酸受体5亚型（mGluR5）mRNA和蛋白水平表达的影响。方法 对原代培养3d的胎鼠海马神经元分为4组,分别为加入氯化铅溶液终浓度为10^-8 mol／L、10^-6 mol／L、10^-4mol／L的各铅暴露组和空白对照组。用实时荧光定量RT—PCR和Westernblot方法检测每组神经元mGluR5 mRNA和蛋白水平的表达。结果 铅暴露组海马神经元mGluR5mRNA表达较正常对照组下调,且随铅暴露浓度升高下调越明显。10^-8mol／LPb^2＋ 组、10^-6 mol／LPb^2＋组、10^-4 mol／LPb^2＋组mGluR5 mRNA表达量与正常对照组比值分别为0．724、0．421、0．321。Westernblot结果显示铅暴露组mGluR5蛋白表达量低于正常对照组,同样呈剂量效应关系,差异有统计学意义（F=77．966,P〈0．001）。结论 铅暴露导致培养的大鼠海马神经元mGluR5基因mRNA和蛋白表达下降,且铅暴露剂量与下降幅度有一定相关性。     

核因子-κB、p53及Bcl-2在铅诱导PC12细胞凋亡中的作用

目的探讨核因子κB(NFκ-B),p53及Bcl-2在铅诱导PC12细胞凋亡中的作用。方法应用细胞培养、流式细胞术、RT-PCR、Western Blot的方法分析NFκ-B、p53、Bcl-2基因的表达情况,研究醋酸铅诱导PC12细胞凋亡及其分子机理。结果PC12细胞经不同浓度醋酸铅(100、200和400μmol/L)处理24h后,用流式细胞仪检测其凋亡率(n=3),铅组凋亡率明显高于对照组,改变呈剂量依赖性。差异有显著性(P<0.05)。RT-PCR结果显示NFκ-B p65 mRNA、p53 mRNA转录水平随铅剂量升高而升高(P<0.05),两基因表达的改变呈剂量依赖性。Western Blot结果显示,表明随着铅浓度的增加,Bcl-2蛋白表达逐渐降低。结论铅诱导PC12细胞凋亡的这种效应可能与增强NFκ-B及p53基因的活性、降低Bcl-2基因的活性有关。     

肝细胞生长因子对铅致人肾小球系膜细胞损伤的保护效应的机制

目的初步探讨肝细胞生长因子（HGF）防护铅处理致人肾小球系膜细胞（HMC）损伤的作用机制。方法将HMC分为对照组（C组）、Pb10μmol／L组和HGF＋Pb10μmol／L组,在6、12、24、48h分别通过噻唑蓝（MTY）法检测细胞存活率和用流式细胞仪检测凋亡率;实时荧光定量一PCR检测各组细胞中Caspase-3的表达水平。结果MTr检测结果显示。Pb10pμmol／L组HMC在6、12、24、48h细胞生长存活率均显著低于HGF＋Pb10μmol／L组（P〈0．01）;流式凋亡检测结果显示,HMC在10μmol／L醋酸铅染毒6、12、24和48h后,HGF＋Pb10μmol／L组在各个时间点细胞凋亡率显著低于Pb10μmol／L组（P〈0．01）。实时荧光定量-PCR检测结果显示,在HMC铅染毒48h后,HGF＋Pb10μmol／L组Caspase-3的表达量显著低于Pb10μmol／L组（P〈0．01）。结论铅促进HMC细胞的凋亡,而HGF通过降低Caspase．3的表达抑制HMC的凋亡,从而发挥对铅致HMC细胞损伤的保护作用。     

低剂量铅对海马神经元神经细胞黏附分子表达的影响

目的研究低剂量铅对原代培养的海马神经元神经细胞黏附分子(NCAM)表达的影响。方法将孕18dWistar大鼠麻醉后剖腹取出胎鼠,建立原代培养的海马神经元,与不同剂量的氯化铅(PbCl2)共孵育后,应用免疫印迹法技术检测培养第1至7天海马神经元NCAM的表达。结果正常条件下培养的海马神经元,第1天NCAM的表达极其微弱,积分吸光度值为14,NCAM表达的高峰时间在培养第3～5天,积分吸光度值为2542～2580;随培养时间的延长,NCAM表达逐渐降低。在铅的作用下,NCAM的表达在培养早期(第2～4天)受到抑制,且呈现明显的剂量效应关系,随时间延长,抑制程度逐渐减弱;培养至第5天,铅的抑制作用消失,10-2、10-3及10-4mmol/LPbCl2剂量组NCAM的表达甚至超出了对照组;此后,所有组的NCAM表达出现下降趋势,铅对NCAM表达的抑制又表现出剂量效应关系。结论低剂量铅暴露显著抑制了原代培养的大鼠海马神经元NCAM的表达,并造成了海马神经元NCAM表达时程上的延迟。     

醋酸铅对人股动脉内皮细胞超微结构及凋亡相关蛋白Caspase-3表达的影响

目的探讨醋酸铅对人股动脉内皮细胞超微结构及凋亡相关蛋白Caspase-3表达的影响。方法实验设染毒组,10、20μmol/L醋酸铅处理体外培养的人股动脉内皮细胞24 h后,用透射电镜观察细胞超微结构的变化;细胞免疫化学法、Western blot法检测Caspase-3的表达;流式细胞仪检测细胞凋亡率。设不加醋酸铅为对照组。结果经染醋酸铅24 h后电镜观察发现染毒组细胞染色质固缩、边移,核质间隙增宽,20μmol/L醋酸铅染毒组凋亡小体形成;细胞免疫化学、Western blot结果显示醋酸铅组的Caspase-3阳性表达较对照组明显升高;流式细胞仪检测发现醋酸铅染毒组细胞凋亡率较对照组显著升高（P〈0.05）。结论醋酸铅可诱发人股动脉内皮细胞凋亡,其机制可能与Capase-3的活化有关。     

热休克蛋白70的表达在苯并[a]芘致DNA损伤中的作用

目的　探讨苯并 [a]芘 (BaP)作用下人肺腺癌A5 4 9细胞热休克蛋白 70 (HSP70 )表达改变及其在DNA损伤中的作用。方法　离体培养A5 4 9细胞 ,以不同浓度的BaP(0、1.2 5、2 .5 0、5 .0 0、10 .0 0μmol L)染毒 6h或 10 μmol L的BaP染毒不同时间 (0、4、8、12、16、2 4、4 8h) ;分别以Western blot和单细胞凝胶电泳方法检测细胞HSP70表达和DNA损伤情况 ;并进一步分析HSP70表达和DNA损伤之间的关系。结果　 1.2 5、2 .5 0、5 .0 0、10 .0 0 μmol L的BaP作用 6h时 ,A5 4 9的HSP70积分光密度分别为4 9.6 3± 1.30、4 5 .72± 1.0 3、4 0 .5 3± 0 .95、37.5 0± 1.2 0 ,均低于对照组 (5 9.4 3± 1.17) ,差异均有显著性 (P <0 .0 5 ) ;10 μmol L的BaP作用 4、8、12、16h时 ,HSP70的积分光密度分别为 33.33± 0 .80、2 9.2 3± 0 .91、12 .5 1± 0 .96、9.5 0± 1.2 5 ,而在 2 4、4 8h时 ,HSP70的积分光密度分别为 2 0 .0 6± 1.38、2 4 .5 1± 1.39,与对照组 (5 6 .5 9± 0 .85 )比较 ,差异均有显著性 (P <0 .0 5 )。 1.2 5、2 .5 0、5 .0 0、10 .0 0 μmol L的BaP作用 6h时 ,在 10 6 个细胞中 ,DNA损伤积分分别为 10 0 82± 75 80、2 3718± 2 938、30 12 8± 2 937、4 4 2 31± 384 6 ,其中 2 .5 0～ 10 .