酵母发酵液催化不对称还原反应合成(S)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯的条件优化

目的:优化酵母发酵液直接催化4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)合成(S)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯((S)-CHBE)的反应条件. 方法:考察酵母发酵液催化该反应过程中基质变化的规律,研究底物和能源供体对反应的影响,并通过正交实验设计法优化反应条件. 结果:在酵母发酵液催化COBE不对称还原反应的过程中,底物和还原糖消耗、产物合成相对集中在反应的前期;反复分批式添加底物和蔗糖有利于反应效率的提高;正交实验优化反应条件的结果表明:酵母发酵液直接催化COBE不对称还原反应合成(S)-CHBE的最佳反应条件为:蔗糖添加方式Ⅱ(反应开始2 h后添加5 g/120 mL),底物添加方式Ⅳ[0.5(3)],缓冲剂添加量2 g/120 mL,β-环糊精添加量为2 g/120 mL,反应后测定产物的产率达96%,ee(对映体过量值)达100%. 结论:通过反应条件优化提高了酵母发酵液的催化效果.     

木瓜脂肪酶催化洛芬类药物的酶促拆分

利用木瓜脂肪酶(CPL)作为催化剂对布洛芬类药物进行手性拆分,建立了底物布洛芬、布洛芬乙酯及其他洛芬类底物的手性检测方法,重点研究了拆分过程中反应温度、有机溶剂、底物结构对拆分效果的影响,并结合动力学分析揭示了木瓜脂肪酶催化手性拆分的分子基础。动力学分析表明对同一底物的不同构型而言,反应速率常数k2S及k2R的差异是木瓜脂肪酶具有手性拆分能力的基础,而不是由于酶对不同构型的底物具有不同的Km值;对一系列化合物的拆分结果表明2芳基丙酸类手性化合物2位上空间位阻较大的底物比空间位阻小的化合物具有更好的拆分效果。实验表明CPL对洛芬类底物均具有拆分能力,对萘普生的拆分效果最好,经过30 h的反应转化率达到49%,反应的对映体选择值(E值)为173。     

酿酒酵母不对称合成(R)-(-)-扁桃酸甲酯

采用本实验室筛选到的酿酒酵母LH1催化苯甲酰甲酸甲酯不对称合成(R)-(-)-扁桃酸甲酯.在单相体系中考察了初始底物浓度、细胞浓度、pH、温度、辅助底物、葡萄糖浓度和反应时间等因素对产物得率和对映体选择性的影响,获得了较佳的还原条件.当细胞浓度75 g(干细胞)/L,葡萄糖浓度30 g/L,底物浓度100 mmol/L,pH 8.0,温度30℃,反应时间30 h时,产物扁桃酸甲酯的得率达94.3%,(R)-(-)-扁桃酸甲酯的对映体过量值(ee)达95.0%.在苯甲酰甲酸甲酯的转化反应中,酿酒酵母LH1菌株表现出非常好的对映体选择性,且ee值受环境因素的影响非常小.     

溶剂,酰化剂和底物浓度对手性氯醇酶促酯化的影响

利用脂肪酶在非水相体系中催化的对映选择性酯化反应,对外消旋手性药物中间体（±）－１－氯－３－（１－萘氧）－２－丙醇（简称萘氧氯丙醇）进行了拆分,考察了溶剂、酰化剂和底物浓度对酶活性和选择性的影响。结果表明,当溶剂为异辛烷,酰化剂为醋酸酐、底物浓度为氯醇１００ｍｍｏｌ／Ｌ、酸酐５０ｍｍｏｌ／Ｌ时,酶显示出最佳的催化活性和选择性,产物酶的光学纯度可达９０％。     

苯巴比妥诱导对普萘洛尔对映体的体外葡醛酸缀合反应立体选择性的影响

目的：探讨苯巴比妥诱导作用对鼠肝微粒体的体外葡醛酸结合反应立体选择性的影响。方法：用空白对照微粒体和垃苯巴比妥(PB)诱导的微粒体作酶源,用UDPGA启动葡醛酸结合反应,RP-HPLC法测定温育液中底物的浓度,观察苯巴比妥诱导作用对普摹洛尔对映体葡醛酸结合反应的立体选择性的彰响。结果：普萘洛尔R( )和S(-)两种对映体在两种鼠肝微粒体的体外孵育葡醛酸缀合代谢中,酶与底物亲和力、最大反应速度和内在清除率均表现出立体选择性。在酶与底物的亲和性和Clint参数方面,S(-)为优势对映体。诱导剂PB的处理使酶与S(-)对映体的亲和力和最大反应速度均显著增强,与R( )对映体的最大反应速度显著增强,但酶与R( )对映体的亲和力无显著变化,S(-)对映体的CUm值显著下降,而R( )对映体的Clint值则显著增大。酶源对普蓁洛尔对映体的葡萄糖醛酸化清除能力以S(-)型为优势对映体。结论：PB的诱导使鼠肝微粒体立体选择性差异缩小,但未改变其顺序,仍以S(-)型对映体占优势。     

脂肪酶催化新反应--酯氨解反应在制备光学纯药物中的应用

脂肪酶催化的新反应－酯氨解反应,不仅是合成手性酰胺的一个非常有用的方法,而且也是手性羧酸及手性醇动力学拆分的有效途径。通过比较脂肪酶催化几种外消是水解、转酯及氨解反应,得出脂肪酶催化酶氮解反应在制备光学纯化合物中将有广阔的应用前景这一结论。     

4-(4-氯苯基)-3-甲基-2,4-二酮基丁酸乙酯的制备

4-(4-氯苯基)-3-甲基-2,4-二酮基丁酸乙酯(1)是重要的医药中间体,其合成方法比较困难,现主要有以下几种方法:一是对氯苯丙酮与草酸二乙酯在六甲基双硅氨基锂的催化下制得[1],但反应需在-78 ℃的低温和无水无氧条件下进行,操作困难,而且六甲基双硅氨基锂价格比较贵.第二种为对氯苯丙酮与草酸二乙酯在乙醇钠催化下制得[2],但反应产物纯度不高,且后处理比较麻烦,不利于放大生产.第三种是对氯苯丙酮(2)先制成烯醇硅醚(3),然后与氯代乙醛酸乙酯反应制得[3],但反应产物纯度也不高,而且对操作要求也比较严格.     

新型脂肪酶LipB52催化生物柴油

一种来源于荧光假单胞菌的新型脂肪酶基因lipB52在大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达,并且利用Ni-NTA亲和柱时脂肪酶LipB52进行纯化.采用固定化脂肪酶LipB52催化大豆油与甲醇的转酯反应生产生物柴油.实验考察了温度、底物摩尔比、酶用量、有机溶剂、酶的种类以及油的类型对于反应的影响,结果表明:转酯反应的最佳反应条件为:m(酶):m(油)=20:80,n(油):n(甲醇)=1:4、正庚烷作为溶剂、反应温度为30℃,在此条件下脂肪酶LipB52表现出很高的催化活性,反应40 h后甲酯的产率高达92%.     

手性药物前体R(-)-扁桃酸的生物不对称合成

目的 研究生物不对称催化苯乙酮酸合成手性药物前体R(-)-扁桃酸.方法 通过对本实验室保存的12株酵母菌进行初筛,获得对底物苯乙酮酸具有较高催化活性的菌株S.c.1,S.c.3和S.c.10.进一步对其进行紫外与微波诱变,得到R(-)-扁桃酸高产菌株S.c.10.2.8.结果 在转化培养中,初始底物浓度为20 mmol·L-1,pH 6.6,温度34℃,R(-)-扁桃酸得率85%,对映体过量值(e.e)＞99%.结论 生物转化法在生产手性药物前体R(-)-扁桃酸中前景广泛.     

光学活性苯乙胺拆分D,L-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸

以光学活性苯乙胺(PEA)为拆分剂,在甲醇、乙醇和异丙醇溶液中,考察不同原料配比下D,L-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸(CPA)的手性拆分效果,确定了最佳的拆分条件,用1H-NMR表征了产物的结构特征。结果表明:以φ=0.70的乙醇溶液为溶剂,nCPA∶nPEA=1∶0.7,进行非对映体盐法拆分,产物(S)-( )-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸[(S)-( )-CPA]的收率达到68.0%,光学纯度达到97.6%。     

脯氨醇衍生物有机催化的不对称Oxaziridination反应

目的 筛选适用于不对称氧氮杂环丙烷化反应的有机催化剂体系.方法 将6种脯氨醇衍生物催化剂用于芳香醛亚胺为底物,间氯过氧苯甲酸(m-CPBA)为氧化剂的不对称氧氮杂环丙烷化反应,考察溶剂、催化剂用量、温度及浓度等因素对反应立体选择性的影响.结果 最佳催化条件为20 mmoL%催化剂1a,甲苯为溶剂,-40℃反应.用于10种不同取代芳香醛亚胺为底物的反应,得到了88%~95%的产率和最高达50%ee的立体选择性.结论 脯氨醇衍生物催化剂催化不对称氧氮杂环丙烷化反应,得到了高效的产率和中等的对映选择性.     

酶促萘普生酯的选择性水解拆分

柱状假丝酵母脂肪酶可以选择性催化S－萘普生甲酯、乙酯和乙氧基乙基酯发生水解,从而对化学合成的混旋萘普生进行拆分,制备具有高光学纯度的S－对映体。利用中等极性大孔吸附树脂HZ－806作为固定化载体,可在酶分子周围营造一个有利于反应的微环境,有效地提高酶的催化活力及解决酶的回收。在中等极性大孔吸附树脂固定化酶填充床反应器中,混旋乙氧基乙基萘普生酯可被连续水解拆分,当流量为72mL/h时,酯的水解率为17％,光学纯度为89．1％。     

(2S,3R)-1-二甲氨基-3-(3-甲氧基苯基)-2-甲基戊-3-醇的合成工艺研究

目的 对(2S,3R)-1-二甲氨基-3-(3-甲氧基苯基)-2-甲基戊-3-醇合成工艺进行研究。方法 以3-戊酮为起始原料,经Mannich反应、手性拆分、Grignard反应等步骤合成(2S,3R)-1-二甲氨基-3-(3-甲氧基苯基)-2-甲基戊-3-醇,并对化学拆分进行工艺优化。结果 合成(2S,3R)-1-二甲氨基-3-(3-甲氧基苯基)-2-甲基戊-3-醇,总收率为30.6%。结论 工艺改进后提高了目标产物的收率,同时也减少了原料的浪费。     

甲壳糖固定血管紧张素转换酶的制备及其性质

目的 将血管紧张素转换酶(ACE)固定化并测定其动力学性质。方法 以甲壳糖为载体，碳二亚胺(EDC)为交联剂，与分离纯化的ACE混合,使ACE固定化；并以马尿酰甘氯酰甘氨酸(HCG)为底物，分别测定了其游离酶和固定化酶的动力学性质。结果 固定化酶活力110u／g湿重，固定化率为22％，与游离酶比较，固定化酶稳定且具良好的耐热性，在50—80℃固定化酶较游离酶稳定。在pH7．1的底物缓冲体系中，37℃，游离酶Km=0.026mol／L；在间歇振摇下固定化酶的表现Km=0．040mol／L。游离酶最适pH为、8.0固定化酶最适pH为9．0。结论 用甲壳糖固定ACE方法简便可行，且固定后的甲壳糖性能稳定，有广阔的应用前景。     

固定化E.coli BL21(pTrc-gsh)细胞催化合成谷胱甘肽

分别以卡拉胶、明胶、海藻酸钠包埋E.coli BL21 (pTrc-gsh)细胞催化合成谷胱甘肽(GSH).从酶活收率及机械强度方面进行比较,选择卡拉胶为包埋载体,其最适pH为7.0,最适温度为40°C.相关物质对GSH的合成均有影响半胱氨酸、甘氨酸的最适浓度为20mmol/L,谷氨酸的最适浓度为60mmol/L;Mg2+/ATP为1～5(V/V)较合适;腺苷二磷酸(ADP)浓度为5mmol/L时对酶活的抑制为20%.优化条件下罐式反应器中GSH的产量为0.84g/L,操作稳定性较好;延迟加入甘氨酸时GSH产量可提高17.5%;与酵母生产ATP体系相耦联的共固定化体系在填充床中反应,GSH合成量达1.24g/L,收率比直接加入ATP提高24.2%.     

固定化青霉素酰化酶在光敏感可再生两水相体系中催化青霉素G为6-APA

在一种光敏感可再生高聚物(PNBC 300000)与葡聚糖20000(Dextran 20000)形成的两水相体系中进行固定化青霉素酰化酶的相转移催化青霉素G产生6-APA的反应。在这个两水相体系中,当pH为7.8,底物浓度为62 mmol/L,反应温度为20℃,在50 mmol/L KCl存在下,6-APA的分配系数可达8.4。催化动力学显示,达到平衡的时间近6 h,PG(Na)转化率约82.6%。3批半连续反应转化率为60%~70%,较相近条件下的单水相反应得率提高近20%。在两水相中,底物及产物主要分配在上相,固定化酶分配在下相,底物青霉素G进入下相经酶催化产生的6-APA及苯乙酸又转入上相,从而解除了青霉素酰化酶催化反应的底物及产物抑制作用,达到提高产物得率的效果。形成两水相的高聚物通过488 nm的激光照射可实现循环利用,高聚物的光照回收率在95%~98%。     

酿酒酵母表面展示脂肪酶LipB52的酶学性质

酿酒酵母表面展示脂肪酶重组菌株EBY100-pLHJ026在含半乳糖(20 g/L)的YNB-CAA培养基中进行诱导表达,脂肪酶在诱导48 h时酶活达到最高。以不同碳链长度的对硝基苯酚酯为底物对全细胞酶活进行性质检测,结果表明:对硝基苯酚癸酸酯(C10)为最适反应底物;全细胞脂肪酶在pH 8.0时的最适反应温度为37℃,在60℃保温2 h酶活保持90%,在60℃保温3 h酶活保持55%,表现出较好的热稳定性。在等体积二甲基亚砜中处理3 h后酶活保持28.4%。     

高产耐热3′-磷酸二酯酶菌种的选育及酶性质的研究

以粘红酵母(Rhodotorula glutinis)Q0402为出发菌株,经紫外谤变,得到一株粘红酵母QX0402.5 L发酵罐的发酵液中3'-磷酸二酯酶酶活力可达250 U/mL,为文献报道过的最高酶活力的2.5倍.所产生的3'-磷酸二酯酶在70℃下保温1 h,酶活力仍有50%以上.该酶最适反应pH为5.4,最适反应温度为60℃,反应3 h的反应转化率为56.37%,底物浓度可以提高到3%,生产效率为文献报道的3倍.     

两种硫辛酸对映体对胚胎体外发育的影响

目的：探讨(R)-硫辛酸和(S)-硫辛酸对胚胎体外发育的影响。方法解冻复苏卵裂期胚胎,分别在含不同浓度(R)-硫辛酸和(S)-硫辛酸的GⅡ培养基微滴中培养,观察各组的桑胚率、致密化率、囊胚率和优质囊胚率。结果硫辛酸可提高胚胎体外发育率,(R)-硫辛酸浓度10×10-9 mol/m3组桑胚率、致密化率、囊胚率和优质囊胚率分别达到了59.2%,55.1%,49.0%和54.2%,均高于其他浓度组（P<0.01）。(R)-硫辛酸浓度10×10-9 mol/m3组的桑胚率、致密化率和优质胚胎率均高于(S)-硫辛酸10×10-9 mol/m3组（P<0.05）。结论硫辛酸对胚胎体外发育具有促进作用,特别是对桑胚率和囊胚率具有显著的影响。(R)-硫辛酸10×10-9 mol/m3组的效果最好。     

壳聚糖的酶法降解

用壳聚糖酶降解壳聚糖,探讨了壳聚糖降解过程中温度、pH值、底物浓度和金属离子对酶促反应的影响。结果表明:酶促反应进行到5 h左右时,即可得到聚合度小于10的壳寡糖。该酶促反应的最适温度为50℃,最适pH=5.5;最适底物浓度为0.02 g/mL;金属离子Ca2+和Mg2+对酶降解有一定的促进作用,而Zn2+、Cu2+对酶降解有较强的抑制作用。该酶促反应符合米氏动力学方程,米氏常数Km=7.80 g/L,最大反应速率Vmax=7.72 g/(min.L)。