建立检测细胞色素P450酶与紫杉醇代谢相关突变位点的基因芯片分型方法

目的 建立针对与临床抗癌药物紫杉醇代谢相关的细胞色素P450(CYP450)酶基因多态性位点的快速、准确、高通量的基因芯片基因分型方法.方法 选取CYP450酶2C8*3、3A4* 18、3A5*3C等3个与紫杉醇代谢相关突变位点,根据基因库中报道的序列,设计每个基因多态性位点的野生型和突变型探针,在突变位点2侧设计PCR扩增引物,PCR片段长度应＜200 bp,并构建标准质粒.探针在3'端氨基修饰,下游引物标记荧光素Cy3,将探针按一定顺序点样于经醛基化处理的玻片制备成基因芯片.人体血液DNA样本分别通过3对引物扩增后与基因芯片上的探针杂交,通过扫描图像和配套软件对结果进行分析和判断.同时,对50份血液样本进行检测.结果 通过标准质粒杂交结果显示,每个位点对应的1对探针均能将野生型和突变型质粒进行准确地区分,无非特异性杂交信号出现;检测50份血液样本,CYP2C8 * 3位点的突变率为2%,CYP3A4 * 18位点均为野生型,CYP3A5 * 3C位点的突变率为62%.同时,通过测序法进行验证,基因芯片方法与测序方法的结果完全一致.结论 建立的同时检测抗癌药物紫杉醇代谢相关的CYP450酶基因多态性位点CYP2C8*3、CYP3A4 * 18、CYP3A5 * 3C的基因芯片分型方法快速、准确,结果可靠,重复性好,可用于指导紫杉醇患者的个体化用药,并为分析个体患者对于紫杉醇药物体内代谢提供了一个高通量技术平台.     

CYP3A4基因多态性与临床疾病易感性的研究进展

细胞色素P450 3A4(CYP3A4)作为人体内代谢药物的主要酶细胞色素P450超家族中的重要成员,参与多种内、外源性化学物质在人体内的转化代谢的过程,而其基因多态性也与多种临床疾病的易感性密切相关。本文就CYP3A4基因多态性与临床多种疾病的易感性作一综述。     

双管单色荧光PCR法与基因芯片法检测CYP2C19基因多态性的比较研究

目的 建立快速检测CYP2C19*2和CYP2C19*3 基因多态性的实验方法。方法 从样本库中选取100例血液样本。设计针对CYP2C19*2和CYP2C19*3基因多态性位点的特异性引物和taqman荧光探针,通过双管单色荧光PCR法检测基因型,与基因芯片法进行比较验证。结果 双管单色荧光PCR法能很好地鉴别CYP2C19*2和CYP2C19*3基因型,与基因芯片结果一致率为100%。结论 双管单色荧光PCR法能快速有效地进行CYP2C19*2和CYP2C19*3基因多态性分型,该方法期待用于临床实验室以指导个体化用药。     

潮汕地区人群CYP2C9基因多态性研究

目的了解细胞色素酶P450家族CYP2C9基因多态性在潮汕地区人群分布的情况,以及基因型分布和基因突变率。方法采用DNA测序法检测204例当地健康志愿者CYP2C9*2和CYP2C9*3的基因多态性。结果204例志愿者CYP2C9基因型检测有184例为*1/*1型,19例为*1/*3型,1例为*3/*3型,频率分别为90.19%、9.31%和0.50%,未发现*1/*2、*2/*2和*2/*3型突变;CYP2C9*3的突变率在男女之间差异有统计学意义(P0.05)。结论 CYP2C9基因在潮汕地区的多态性分布和性别有关,根据基因型的差异进行个体化用药有利于临床治疗。     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术检测药物代谢酶基因多态性平台的建立

目的 建立基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术检测患者体内药物代谢酶基因多态性的平台。方法 选取2013年10月～2014年6月在北京协和医院门诊就诊患者53例EDTA抗凝外周血,提取全血基因组DNA,用MALDI-TOF-MS技术检测53例患者药物代谢酶基因CYP2C9*2(rs1799853),CYP2C9*3(rs1057910),CYP2C19*2(rs4244285),CYP2C19*3(rs4986893),CYP2C19*4(rs28399504),CYP2C19*5(rs56337013)和CYP2C19*17(rs12248560)的单核苷酸多态性(SNP)位点,并用Sanger测序法进行验证。结果 用 MALDI-TOF-MS 技术可以同时完成53份样本,2个药物代谢酶基因,7个SNP位点的检测。53例患者中,发现CYP2C19*2(rs4244285)AG型25例,AA型6例,GG型22例,A等位基因频率为34.9%。CYP2C19*3(rs4986893)AG型4例,GG型49例,A等位基因频率为3.8%。CYP2C9*3(rs1057910)CA型5例,AA型48例,C等位基因频率为4.7%。未发现 CYP2C9*2(rs1799853),CYP2C19*4(rs28399504),CYP2C19*5(rs56337013)和CYP2C19*17(rs12248560)位点突变。经与Sanger测序法比较,两种检测方法结果的符合率为100%。结论 成功建立MALDI-TOF-MS技术检测药物代谢酶基因多态性的平台,该平台具有高通量、准确的特点,对个性化用药治疗具有重要的临床应用价值。     

应用焦磷酸测序技术检测VKORC1和CYP2C9基因型

目的建立基于焦磷酸测序技术的维生素K环氧化物还原酶复合物亚单位1(VKORC1)和细胞色素P450 2C9(CYP2C9)基因分型的方法,用于检测华法林药物代谢酶相关基因多态性。方法收集50份健康人外周血样本,提取全血基因组DNA。针对VKORC1-1639GA、CYP2C9 430CT和CYP2C91075AC 3个单核苷酸多态性(SNP)位点,分别设计一套带生物素标记的扩增引物和测序引物。样本经PCR扩增后进行焦磷酸测序,结合信号峰型分析每个样本基因型,以Sanger测序法为对照,比较两种方法检测基因型结果的一致性。结果根据待测位点出峰的碱基和峰高,可以清晰判断3个SNP位点的基因型,50份样本中,VKORC1-1639GA基因型AA和AG分别有41例和9例,各占82%和12%;CYP2C9基因型*1/*1和*1/*3分别有45例和5例,各占90%和10%,未检出等位基因CYP2C9*2。焦磷酸测序技术与Sanger测序法所检测的基因型结果一致。结论焦磷酸测序技术在SNP基因分型中具有操作简便、耗时短、成本低和结果准确可靠等优点,该检测方法可快速对CYP2C9和VKORC1的SNP位点进行分型。     

东莞地区汉族冠心病患者CYP2C19基因多态性分布特征分析

目的探讨东莞地区汉族冠心病患者CYP2C19基因多态性分布特征。方法选取该院2016年9月至2019年1月收治的800例汉族冠心病患者作为研究对象,采用等位基因特异PCR技术对患者CYP2C19基因多态性进行检测,了解CYP2C19基因多态性分布情况,并根据患者的年龄、性别进行分组分析。结果 CYP2C19基因型中*1/*1出现频率为38.50%,*1/*2频率为40.00%,*1/*3频率为6.38%,*2/*2频率为11.75%,*2/*3频率为3.00%,*3/*3频率为0.37%;其中快代谢型为38.50%、中代谢型为46.38%、慢代谢型为15.12%;等位基因分布中CYP2C19*1占61.69%,CYP2C19*2占33.25%,CYP2C19*3占5.06%。不同年龄、性别、患者CYP2C19各基因多态性分布虽存在一定的差异,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论东莞地区汉族人群冠心病患者CYP2C19基因型中以快代谢型与中代谢型为主,基因分布以CYP2C19*1占比较高,不同性别、年龄患者CYP2C19基因型间差异不明显。     

广东省肇庆地区冠心病患者CYP2C19基因多态性差异性分布

目的 探讨广东省肇庆地区冠心病(CHD)患者CYP2C19基因多态性分布,并比较不同性别和不同地区间CYP2C19基因多态性的分布,为CHD患者抗血小板治疗的个体化用药策略提供理论基础。方法 2019年6月-2020年11月诊断为CHD的501例患者均采用数字荧光分子杂交技术对CYP2C19*2、CYP2C19*3 和CYP2C19*17进行基因多态性检测。结果 在501例CHD患者中,CYP2C19*1*17、CYP2C19*1*1、CYP2C19*1*2、CYP2C19*1*3、CYP2C19*2*2、CYP2C19*2*3的基因型所占比例分别为0.80%、44.11%、36.13%、6.39%、8.98%、3.59%;CYP2C19的代谢表型:超快代谢型(UM)、快代谢型(EM)、中间代谢型(IM)、慢代谢型(PM)所占比例分别为0.80%、44.11%、42.51%、12.58%;CYP2C19*1、*2、*3和*17等位基因频率分别为65.77%、28.84%、4.99%、0.40%。不同性别间的CHD患者CYP2C19基因型、等位基因和代谢型分布差异无统计学意义(P>0.05);肇庆地区CHD患者CYP2C19等位基因、代谢型分布与广州、佛山、东莞、梅州客家、粤北地区进行比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 肇庆地区CHD患者存在CYP2C19基因多态性,其中CYP2C19*2和CYP2C19*3功能缺失型等位基因所占比例较高,建议CHD患者应用氯吡格雷抗血小板治疗前对CYP2C19基因多态性进行检测,评估氯吡格雷的抵抗风险,为患者制定合理的个体化用药方案。     

荧光PCR-熔解曲线法检测新疆回族人群CYP2C9和VKORC1基因多态性研究

目的应用荧光PCR-熔解曲线法检测新疆回族人群细胞色素P450酶2C9(CYP2C9)和维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位1(VKORC1)基因多态性,研究新疆回族人群CYP2C9和VKORC1基因分布及基因突变频率情况,并评价荧光PCR-熔解曲线法临床使用的适用性。方法采用荧光PCR-熔解曲线法和测序法对比检测CYP2C9*2、CYP2C9*3和VKORC1(-1639G/A)的基因多态性。结果 228例新疆回族人群中,共检测出CYP2C9*1/*1标本199例,CYP2C9*1/*2标本2例,CYP2C9*1/*3标本26例,CYP2C9*3/*3标本1例,未检测出CYP2C9*2/*2和CYP2C9*2/*3标本。VKORC1(-1639G/A)检测出2种等位基因G和A,其中VKORC1-1639G/G型标本检出2例,VKORC1-1639G/A型标本检出39例,VKORC1-1639A/A型标本检出187例,与测序法对比检测比较,荧光PCR-熔解曲线法与测序法检测结果完全一致。结论新疆回族人群同样具有CYP2C9基因*2、*3位点和VKORC1基因-1639位点的多态性,其发生频率与新疆维吾尔族及其他地域人群的具有一定差异,所采用的荧光PCR-熔解曲线法用于基因多态性检测可满足临床检测要求。     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术检测华法林代谢酶基因多态性

目的用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术建立检测人群中华法林代谢酶基因多态性的方法。方法选取2011年1月至2013年1月北京安贞医院心脏外科心脏机械瓣膜置换术后接受华法林抗凝治疗的患者10例,采集外周血,提取全血基因组DNA,用MALDI-TOF-MS技术检测10例患者华法林代谢酶基因CYP2C9*2(rs1799853)、CYP2C9*3(rs1057910)、CYP2C9*6(rs9332131)、VKORC1 CT(rs9923231)(-1639GA)、GGCX GC(rs11676382)的单核苷酸多态性(SNP)位点,并用Sanger测序法进行验证。结果用MALDI-TOF-MS技术可以同时完成10份标本3个华法林代谢酶基因5个SNP位点的检测。10名服华法林的心脏机械瓣膜置换术患者中,发现VKORC1-1639GA AG型2例,AA型8例,A等位基因频率为90%。未发现CYP2C9*2(rs1799853)、CYP2C9*3(rs1057910)、CYP2C9*6(rs9332131)和GGCX GC(rs11676382)突变。经与Sanger测序法比较,符合率为100%。结论成功建立MALDI-TOF-MS技术检测华法林代谢酶基因多态性的平台,该法具有高通量、快速、准确的特点,在个性化医疗上有较大的推广应用价值。     

氟西汀氧化代谢酶的鉴定及临床个体化给药剂量

氟西汀是临床上常用的选择性5-羟色胺重摄取抑制剂,用于抗抑郁症的治疗。氟西汀在肝脏由细胞色素P450酶进行氧化代谢。现已知N-去甲基代谢是主要代谢途径,其次为O-脱烷基代谢。文内所述的体内和体外研究表明,CYP2C19和CYP2C9是催化氟西汀N-去甲基代谢的主要CYP酶,而CYP2C19和CYP3A4是催化O-脱烷基代谢的主要CYP酶;多态性CYP2C19对氟西汀代谢的作用均呈底物剂量依赖性和基因剂量效应。这些研究结果将为临床上合理使用氟西汀提供重要的实验依据。     

细胞色素P450 2C9*8与CYP2C9*27慢病毒表达载体的构建及在HEK239T细胞中的稳定表达

目的构建人细胞色素P450 2C9(CYP2C9)及突变体CYP2C9*8与CYP2C9*27的慢病毒表达质粒,并于HEK293T细胞中稳定表达。方法反转录人肝总RNA获得c DNA,PCR扩增获得CYP2C9编码序列,并克隆至载体MigR1上,获得慢病毒表达重组质粒MigR1-CYP2C9。以该质粒为模板,重叠PCR方法分别引入449GA与449GT点突变,并分别克隆至MigR1,获得MigR1-CYP2C9*8与MigR1-CYP2C9*27慢病毒表达质粒。在HEK 293T细胞中进行病毒包装,并采用获得的慢病毒感染HEK293细胞,经流式分选和单克隆挑取获得稳定表达CYP2C9、CYP2C9*8与CYP2C9*27的细胞,命名为293T-2C9、293T-2C9*8与293T-2C9*27。实时定量PCR(qRT-PCR)与Western blot检测胞内CYP2C9表达。采用CYP2C9的特异性底物双氯芬酸对CYP2C9的活性进行评价。结果成功构建MigR1-CYP2C9、MigR1-CYP2C9*8与MigR1-CYP2C9*27表达载体。采用构建病毒感染获得的单克隆细胞293T-2C9、293T-2C9*8与293T-2C9*27在30代后荧光显微镜下观察可见绿色荧光表达率在100%,qRT-PCR与Western blot均表明有目标分子表达。提取自这三株细胞的微粒体均可催化双氯芬酸代谢为4-羟基双氯芬酸。结论成功构建稳定表达CYP2C9、CYP2C9*8与CYP2C9*27人源化细胞模型,该方法构建的细胞可用于CYP2C9*8与*27两个突变体的功能研究。     

CYP2C9和VKORC1基因多态性检测试剂盒的性能验证

目的对华法林代谢相关的人细胞色素P450超家族第二亚家族C9代谢酶(CYP2C9)和维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位1(VKORC1)基因多态性检测试剂盒进行性能验证。方法根据中国合格评定国家认可委员会(CNAS)制定的有关要求,结合试剂说明书,从符合率、精密度、检出限、抗干扰能力4个方面对苏州旷远生物分子技术有限公司的人CYP2C9与VKORC1基因多态性检测试剂盒(荧光PCR法)进行性能验证。结果20例临床标本的荧光PCR检测结果与Sanger测序法检测结果的符合率为100%;荧光PCR对1例临床标本重复检测15次,CYP2C9与VKORC1基因荧光通道的Ct值变异系数(CV)均<5%;试剂盒最低检测限为10 ng/μL;已知基因型的血液标本中加入干扰物血红蛋白、胆红素和胆固醇之后的基因型结果与对照组完全一致。结论人CYP2C9与VKORC1基因多态性检测试剂盒(荧光PCR法)符合ISO15189质量管理要求,可以在保证项目验收的基础上,为临床提供可靠的检测结果。     

氟西汀氧化代谢酶的鉴定及临床个体化给药剂量

氟西汀是临床上常用的选择性5－羟色胺重摄取抑制剂，用于抗抑郁症的治疗。氟西汀在肝脏由细胞色素P450酶进行氧化代谢。现已知N－去甲基代谢是主要代谢途径，其次为O－脱烷基代谢，内所述的体内和体外研究表明，CYP2C19和CYP2C9是催化氟西汀N－去甲基代谢的主要CYP酶，而CYP2C19和CYP3A4是催化O－脱烷基代谢的主要CYP酶；多态性CYP2C19对氟西汀代谢的作用均呈底物剂量依赖性和基因剂量效应，这些研究结果将为临床上合理使用氟西汀提供重要的实验依据。     

中国健康人群与精神分裂症患者CYP2C9遗传多态性的相关研究

目的 探讨中国健康人群与精神分裂症患者细胞色素P450 2C9(CYP2C9)遗传多态性的相关性.方法 应用PCR与DNA测序相结合的方法对91例精神分裂症患者(男52例,女39例,平均年龄50.87±9.38岁)与164例健康志愿者(男88例,女76例,平均年龄47.37±14.82岁)进行了CYP2C9的基因多态性分析,根据CYP2C9将精神分裂症患者和健康志愿者基因型分组.结果 在对CYP2C9的检测中,没有发现CYP2C9*2基因型个体,正常对照组CYP2C9*3(A1075C)的等位基因频率为4%,精神分裂症患者组CYP2C9*3(A1075C)等位基因频率为5.5%,精神分裂症患者和健康志愿者组间的基因型和等位基因频率差异无统计学意义(χ2＝0.669,P>0.05;χ2=0.637,P>0.05).结论 CYP2C9 *3(A1075C)可能不是中国精神分裂症患者的一个易感因素.     

赤峰地区蒙古族冠心病患者CYP2C19基因多态性分布研究

目的分析赤峰地区蒙古族冠心病患者CYP2C19基因多态性分布状况。方法选取2018年3-12月于该院确诊为冠心病并行经皮冠状动脉介入术治疗的患者558例为研究对象,其中蒙古族患者299例为研究组,汉族患者259例为对照组。抽取两组患者的外周血2 mL,提取基因组DNA,采用实时荧光定量PCR方法检测CYP2C19基因多态性,比较两组间CYP2C19基因型、代谢型分布情况。结果研究组患者CYP2C19*1/*1、*1/*2、*2/*3型所占比例均高于对照组(P<0.05);两组CYP2C19*1/*3、*2/*2、*3/*3型所占比例比较,差异无统计学意义(P>0.05)。研究组中间代谢型和慢代谢型基因所占比例低于对照组(P<0.05),快代谢型基因所占比例高于对照组(P<0.05)。结论赤峰地区蒙古族冠心病患者CYP2C19基因存在不同基因型和代谢型,与汉族冠心病患者间存在差异。掌握CYP2C19基因的多态性分布情况对冠心病患者抗凝药物的选择具有重要意义。     

高原世居藏族和移居汉族人群CYP2CI9基因多态性比较分析

摘要:目的比较细 胞色素P450( cytochrome P450, CYP450)的同工酶CYP2C19在高原世居藏族和移居汉族人群中的不同基因型及等位基因分布特点,为高原地区抗血小板药物氯吡格雷使用前是否进行基因检测提供依据。方法选取2021年1 月 至12月在西藏自治区人民医院就诊的藏、汉人群(分别为200例、120例),采用荧光定量PCR检测藏、汉人群CYP2CI9基因多态性,并比较高原地区藏、汉人群基因型和代谢型的分布特点。结果CYP2CI9 在高原地区藏、汉人群中*1/*1.* 1/ *2. *1/*3. *2/*2.*2/ *3、*3/*3基因型分布频率分别为49% .36.5%、6.5% .7.5% .0.5% .0%和47.5%、39%.4% .6%、2.5%、1%,等位基因*1、*2. *3分布频率分别为70.5%、26% .3.5%和69.1%、26.7% .4.2%,两组间基因型和等位基因分布差 异无统计学意义(P>0.05);快代谢(EM,*1/ *1)、中间代谢(IM, * 1/ *2. *1/ *3)、慢代谢(PM, *2/ *2、*2/*3. *3/ *3)分布频率分别为49%、43% .8%和47.5% .42.5%、10%,两组间差异亦无统计学意义(P>0.05)。结论高原世居藏族人群中 CYP2C19基因代谢型和基因型与移居汉族人群比较无差异,且中间代谢型及慢代谢型人群占比超过50%。在高原地区藏、汉人群中使用氯吡格雷之前有必要进行CYP2CI9基因型检测,并根据基因型结果调整用药。     

1043例汉族双相情感障碍患者CYP2C19基因多态性及代谢表型分析

目的探讨汉族双相情感障碍患者CYP2C19基因多态性及代谢表型的分布,为临床合理用药提供理论参考和指导。方法以DNA微阵列技术检测1 043例双相情感障碍患者的CYP2C19基因多态性及代谢表型(快代谢型,中等代谢型,慢代谢型),用基因计数法计算基因型频率和等位基因频率,同时分析基因多态性发生频率与性别的相关性。结果所有检测对象中,CYP2C19*1/*1、*1/*2、*1/*3、*2/*2、*2/*3、*3/*3基因型的频率分别为40.6%、40.5%、5.2%、9.9%、3.4%、0.5%;CYP2C19基因快代谢型、中等代谢型、慢代谢型3种代谢表型所占比例分别为40.5%、45.8%、13.7%;不同性别之间CYP2C19基因型及代谢表型差异无统计学意义(P0.05)。结论汉族双相情感障碍人群CYP2C19基因多态性以*1/*1及*1/*2为主,681位点的变异率高于636位点,检测CYP2C19基因多态性及代谢表型有助于临床合理用药。     

基于武汉地区PCI术后患者CYP2C19基因多态性指导氯吡格雷个体化用药的研究

目的研究CYP2C19基因多态性,分析经皮冠状动脉介入治疗(PCI)术后氯吡格雷中、慢代谢患者个体化用药的疗效差异,为PCI术后患者个体化用药提供参考依据。方法使用荧光定量PCR法测定该院328例PCI术后患者CYP2C19基因型,分析年龄、性别与CYP2C19基因多态性的关系及不同地区汉族冠心病患者代谢表型差异,比较中、慢代谢型患者维持原方案(服用氯吡格雷)和更换抗血小板药物治疗之间的疗效差异。结果本研究共检测出7种基因型,分别为CYP2C19*1*17、*1*1、*1*2、*1*3、*2*17、*2*2、*2*3;4种代谢表型,分别为超快代谢型(1.22%)、快代谢型(42.38%)、中代谢型(40.85%)、慢代谢型(15.55%);代谢表型与太原、连云港地区汉族冠心病患者比较差异有统计学意义(P<0.05),与其他地区汉族冠心病患者比较差异无统计学意义(P>0.05);不同性别患者CYP2C19基因分型、代谢表型差异无统计学意义(P=0.646、0.246);不同年龄段患者CYP2C19基因分型、代谢表型差异无统计学意义(P=0.823、0.574);中、慢代谢型患者维持原方案与更换抗血小板药物治疗比较,疗效差异无统计学意义(P=0.538)。结论本研究中的武汉地区汉族PCI术后患者以中、快代谢型为主,等位基因频率符合亚洲人群分布,对于中、慢代谢型患者,更换抗血小板药物未降低心血管不良事件发生率。     

急性脑梗死患者CYP2C19基因多态性与纤维蛋白原及D-二聚体相关性研究

目的探讨急性脑梗死患者细胞色素P450酶等位基因(CYP2C19基因)多态性与纤维蛋白原(FIB)及D-二聚体相关性。方法选取常规服用氯吡格雷超过1个月的急性脑梗死患者112例为研究对象,采用RT-PCR法检测脑梗死患者外周全血CYP2C19基因型,运用凝固法(Clauss法)检测FIB,透射比浊法检测血浆中D-二聚体。结果112例急性脑梗死患者中快代谢型(快代谢组,CYP2C19*1/*1)患者较多,为46例,占比41.1%;中代谢型(中代谢组,CYP2C19*1/*2、CYP2C19*1/*3)为41例,占比36.6%;慢代谢型(慢代谢组,CYP2C19*2/*2、CYP2C19*2/*3)最少,为25例,占比22.3%。慢代谢组FIB及D-二聚体水平高于快代谢组及中代谢组,差异有统计学意义(P<0.05)。CYP2C19基因型与FIB及D-二聚体呈正相关(r=0.129、0.158,P<0.05)。结论CYP2C19基因型与FIB和D-二聚体具有一定相关性,使用常规剂量的氯吡格雷治疗CYP2C19基因慢代谢型急性脑梗死患者,可能增加血栓风险,可考虑更换新的药物或增加剂量进行治疗。