艰难梭菌毒素基因3′末端重复区域基因片段的PCR克隆

目的 探寻一种简单，快速，灵敏的检测艰难梭菌的方法。方法 以艰难梭菌毒素A和毒素B基因3′末端高度保守重复区分别设计一对引物。进行PCR反应，同时在同一体系相同反应条件下使用相同引物分别以大肠杆菌和乳杆菌DNA为模板进行扩增，比较二者结果。结果 从艰难梭菌成功克隆了毒素A基因3′端重复区域960bp的基因片段及毒素B基因3′端重复区域1851bp的基因片段，不同来源的菌株出现了相同的2条电泳带。并通过测序鉴定；而对照的大肠杆菌和乳杆菌株无特异电泳带出现。结论 从艰难梭菌毒素A，毒素B基因3′末端重复区域克隆的基因片段具有保守性，可以作为基因探针在临床上进行艰难梭菌检测，该方法简便，灵敏，可直接用粪便标本进行检测，此外，这些基因编码的多肽具有较高的疏水性并存在着膜受体结合区域，可以此为基础进行基因工程蛋白质疫苗的研究。     

艰难梭菌A毒素受体结合区基因在乳链菌中的表达

目的：在乳链菌内表达艰难梭菌A毒素受体结合区并检测其活性．方法：提取艰难梭菌标准株基因组DNA,扩增编码艰难梭菌毒素A毒素受体结合区的羧基未端基因重复序列（14CDTA）,分别连接到乳链菌表达载体pNBC1000及pNBC2000,转化乳链菌,蛋白电泳及Western—blot检测蛋白定位表达情况．结果：成功构建了14CDTA乳链菌表达载体,并在乳链菌内表达了艰难梭菌受体结合区蛋白,分泌表达的艰难梭菌受体结合区蛋白大小约39．2ku,膜锚定表达的受体结合区蛋白大小约为55．1ku,所表达的蛋白均可与艰难梭菌A毒素多克隆抗体发生免疫印迹反应．结论：表达艰难梭菌受体结合区蛋白的重组乳链菌可以识别艰难梭菌A毒素多克隆抗体,为研制防治艰难梭菌疫苗的口服生态活菌亚单位疫苗奠定了一定基础．     

艰难梭菌毒素A羧基端基因原核表达载体的构建及生物信息学分析

目的构建表达艰难梭菌毒素A羧基末端受体结合区功能基因的原核表达载体。方法PCR扩增艰难梭菌毒素A羧基末端受体结合区功能基因（CDTAR），并将其克隆到表达载体pET-22b（＋），重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3），重组载体经EcoRⅠ，XhoⅠ双酶切鉴定及测序进行分析，并以生物信息学软件分析其生物活性。结果构建了含CDTAR的重组质粒pET—CDTAR，生物信息学分析示该序列具有良好的抗原性及疏水性。结论艰难梭菌毒素A羧基末端受体结合区功能基因原核表达载体的构建为艰难梭菌疫苗的研究奠定了基础。     

多聚酶链反应检测艰难梭菌产毒株

以艰难梭菌A毒素基因非重复片段中的两个寡核苷酸链作引物,扩增306bp,用多聚酶链反应技术扩增31株细菌,结果19株艰难梭菌产毒株均扩增出单一特异的电泳带,而8株艰难梭菌无毒株、2株索氏梭菌和2株大肠杆菌均无特异带出现。将艰难梭菌产毒株的模板DNA从50ng稀释至0.5ng后再进行多聚酶链反应,结果仍可见特异扩增带。说明多聚酶链反应检测艰难梭菌产毒株较之细菌分离培养、细胞毒索测定方法具有快速、简便、特异、敏感的优点,可望用于临床标本的直接检测。     

院内感染艰难梭菌的毒素检测及核糖体分型研究

目的 了解艰难梭菌临床分离株的毒力情况,并运用核糖体分型技术进行流行病学研究.方法 采集住院腹泻患者的未成形粪便标本,无水乙醇处理后接种CDMN选择培养基行艰难梭菌分离培养,并通过革兰染色、耐氧试验和凝集试验行菌落鉴定;提取菌株DNA,选择特异性引物用PCR法扩增毒素基因tcdA和tcdB;核糖体分型针对细菌基因组16S～23S rDNA间区序列进行扩增,并根据电泳带型的多态性实现分型.结果 共计分离得44株艰难梭菌,3种毒素型分别为A+B+型、A-B+型和A-B-型,分别占 57％ 、34％和9％;18种核糖体型中以R8 型和R4 型为主,分别占 20％和18％.结论 本研究临床分离的艰难梭菌菌株中,毒素型以A+B+型为主,核糖体分型存在相对优势的型别;无证据提示存在院内艰难梭菌感染的暴发流行.     

应用SEFA-PCR扩增刺五加内生青霉鲨烯合酶基因的旁邻序列

①目的 克隆刺五加内生青霉Penicillium minioluteum P116-1a鲨烯合酶(squalene synthase,SS)基因的旁邻序列.②方法 根据已经获得的P.minioluteum P116-1a SS DNA序列设计特异性性引物,采用SEFA-PCR(self-formed adaptor PCR)扩增其3'和5'末端未知序列.③结果 3'末端扩增获得长约5 000 bp的片段,5'末端扩增获得长约3 000bp的片段.④结论 首次应用SEFA-PCR技术扩增获得P.minioluteum P116-1a SS基因的末端序列,为进一步研究该基因对刺五加皂苷含量的作用机制奠定了基础.     

艰难梭菌毒素A羧基端基因的克隆与表达

目的:克隆并表达艰难梭菌毒素A羧基末端受体结合区 (CDTAR)基因.方法:PCR扩增CDTAR基因并将其克隆到表达载体pET-22b( ),重组质粒转化到E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对表达产物进行分析.结果:构建了含CDTAR基因的重组质粒pET-CDTAR,IPTG诱导后SDS-PAGE显示表达出Mr约为35.7 ku的重组蛋白,占菌体总蛋白的36.1%,可溶性表达占上清的22.2%,包涵体中约占24.9%.结论:成功克隆了CDTAR基因,并构建表达了CDTAR重组蛋白,为进一步研究CDTAR功能及研制艰难梭菌疫苗奠定了基础.     

产气荚膜梭菌α毒素亚单位基因的表达及表达产物活性分析

含有产气荚膜梭菌α毒素基因序列的克隆载体pMD18TCα ,经BamHⅠ和HindⅢ内切酶双酶切后 ,将α毒素亚单位基因亚克隆到原核表达载体pET30b中 ,构建表达载体pET30bPα。经酶切和测序鉴定 ,α毒素基因中的90 0bp的片段正确插入到表达载体中。重组菌株BL2 1(DE3)pET30bPα经IPTG诱导的表达产物经SDS PAGE和Western_blot分析 ,表达出大小为 38× 10 3的重组蛋白具有和α毒素阳性血清发生特异性的免疫反应。     

融合蛋白弓形虫主要表面抗原P30-CTXA2/B在大肠杆菌中的表达

目的 :克隆并表达含有刚地弓形虫主要表面抗原P30及霍乱毒素A2 /B亚基基因的原核表达载体 ,为弓形虫疫苗的研究奠定基础。方法 :通过PCR方法扩增出P30基因片段 ,将其克隆入含有霍乱毒素A2 /B亚基基因的表达质粒pUAB0 2 4 ,在大肠杆菌JM10 9(DE3)中表达融合蛋白。行SDS PAGE电泳及West ernblotting检测鉴定。结果 :酶切电泳证明质粒构建正确。SDS PAGE显示IPTG诱导可以产生特异性条带。Westernblotting进一步证实该条带为p30 CTA2 /B融合蛋白。结论 :成功构建的表达载体pUAB0 2 4 p30可有效表达特异性的融合抗原蛋白P30 CTA2 /B。     

基于线粒体功能障碍探讨补肾健脾化湿法对PCOS-IR作用的研究进展

]艰难梭菌是医院感染性腹泻的主要病原菌。艰难梭菌感染严格依赖于艰难梭菌产生的蛋白质毒素。近年来对艰难梭菌毒素的进一步研究有了新的发现,也发展和建立了一些新的艰难梭菌毒素检测方法。本文对艰难梭菌毒素的生物学和艰难梭菌毒素及其基因检测方法的研究进展做一综述,旨在为艰难梭菌感染防治提供参考。     

Detection of toxigenic Clostridium difficile by polymerase chain reaction

ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｏｘｉｇｅｎｉｃＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅｂｙｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎＣｈｅｎＣｕｎｌｏｎｇ（陈村龙）；ＺｈｏｕＤｉａｎｙｕａｎ（周殿元）；ＰａｎＬｉｎｇｊｉａ（潘令嘉）；ＷａｎｇＪｉｄｅ（...     

恶性肿瘤患者艰难梭菌感染相关性腹泻的临床特征分析

目的 恶性肿瘤患者腹泻发生率较高,艰难梭菌感染为其中一个重要的原因,但临床辨别相对困难。本研究拟探讨恶性肿瘤患者艰难梭菌感染相关性腹泻的临床特征。 方法 回顾性分析472例恶性肿瘤合并腹泻患者,根据患者是否感染艰难梭菌分为艰难梭菌感染阳性组(A组,95例)和艰难梭菌感染阴性组(B组,377例)。采用进行聚合酶链式反应(PCR)检测艰难梭菌毒素A(tcdA)和艰难梭菌毒素B(tcdB);采用倾向值匹配法对研究中非研究混杂因素进行类似随机化的均衡处理。卡钳值设定为0.1,2组按照1:1的比例进行匹配。记录2组患者一般情况和恶性肿瘤治疗情况等。 结果 2组患者倾向值匹配完成后,每组共有91例患者纳入研究。A组患者与B组患者一般资料差异均无统计学意义(均P>0.05);A组患者血浆白蛋白水平明显低于B组(P<0.01),抗生素应用比例、质子泵抑制剂应用比例化疗、便潜血阳性比例和化疗后体能状态(ECOG)评分明显高于B组(均P<0.05);2组患者不良反应发生情况差异无统计学意义(P>0.05)。 结论 恶性肿瘤艰难梭菌感染相关性腹泻患者血浆白蛋白水平下降、便潜血阳性增加。抗生素、化疗和质子泵抑制剂的使用可能会增加恶性肿瘤患者艰难梭菌感染几率。      

泰泽菌PCR检测方法的建立及初步应用

目的 建立和应用泰泽菌巢式PCR检测方法。方法 参照日本学者Goto检测泰泽菌16S rDNA序列设计的两对引物,对PCR的检测条件进行了改进和优化。结果 巢式PCR反应的外引物能引导扩增出一条625 bp的DNA片段,内引物则能引导扩增出一条196 bp的DNA片段。此625 bp和196 bpDNA片段的大小均与Goto报道的结果完全一致。试验证明196 bp的阳性带为泰泽菌16S rDNA特异性保守片段。通过将泰泽菌阳性肝组织标本经系列稀释的试验表明,该PCR方法的检测灵敏度为2个菌。另外,将阳性对照标本扩增的625 bp DNA片段作核酸序列测定,发现其碱基序列与Goto报道的泰泽菌MSK株及RJ株16S rDNA序列均有99％同源性。结论 根据上述结果,我们应用本方法对普通级小鼠、大鼠、金黄色地鼠肝组织标本各5份、普通级豚鼠肝组织标本10份、沙鼠肝组织标本10份、MHV3感染的小鼠肝组织1份进行了初步检测,结果未发现带菌动物。     

A型肉毒素预防人瘢痕成纤维细胞增生机制的初步研究

目的 探究不同浓度A型肉毒素(BTX-A)对瘢痕成纤维细胞的影响,初步阐释BTX-A治疗瘢痕及预防术后瘢痕增生的相关分子作用机制.方法 选取人瘢痕成纤维细胞,以不同浓度的B T X-A(0.01、0.10、1.00 U/L及10.00 U/L)作用24 h后,激光共聚焦显微镜观察细胞黏附及骨架变化,并采用MTT及流式技术检测其增殖、凋亡及周期变化,同时采用实时荧光定量PCR(qRCR)及蛋白免疫印迹(Western blot)方法 ,探究TGF-β、基质金属蛋白酶(MMP)-1、MMP-2及MMP-9基因及蛋白的表达变化.结果 随着BTX-A剂量的升高,其细胞黏附数量及骨架荧光强度逐渐减弱;细胞增殖能力减弱且主要阻断在细胞G0/G1期;此外其凋亡也随着BTX-A剂量增大而逐渐增强.qPCR及Western blot结果显示,随着BTX-A剂量增大,MMP-1及MMP-2基因及蛋白均呈现高表达,而TGF-β及MMP-9呈现出低表达.结论 BTX-A通过阻断瘢痕细胞G0/G1期抑制其增殖,同时提高MMP-1及MMP-2的表达来减轻瘢痕形成,对瘢痕的治疗起着积极的作用.     

克雷霉素、头孢噻肟对艰难梭菌毒素转录和表达的影响

目的研究1/2最小抑菌浓度(MIC)剂量的克雷霉素和头孢噻肟对中国艰难梭菌A-B+高分离株BJ08的生长、毒力基因转录和毒素分泌的影响。方法 BJ08菌株分别生长在含有1/2 MIC的克雷霉素或头孢噻肟以及无抗生素的脑心浸液肉汤(BHI)液体培养基中。每4个小时,通过检测其OD值以确定其生长曲线;通过实时荧光定量PCR检测其毒力基因的表达;通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测上清和细胞内B毒素的表达。结果 BJ08在1/2 MIC剂量的克雷霉素存在的情况下,菌株的生长和毒素表达几乎不受影响;但是在1/2 MIC剂量的头孢噻肟存在的情况下,菌株生长变慢,到达对数期的时间延迟;毒力基因和B毒素的表达提前且增加。结论实验证明:在亚MIC剂量的不同的抗生素存在的情况下对中国株A-B+艰难梭菌的生长和毒力基因表达影响不同。我们的研究对于临床医师规范治疗CDAD和合理应用抗生素有一定的参考价值。