α-胞衬蛋白-小干扰RNA真核表达载体的构建及其对原发性干燥综合征模型小鼠治疗作用的研究

目的 针对α胞衬蛋白(α-Fodrin)构建2段小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,观察其对原发性干燥综合征模型小鼠(NOD小鼠)的治疗作用.方法 16只8周龄的NOD小鼠采用单纯随机抽样法分为4组,对照组、空载体组、α-胞衬蛋白-siRNA1组及α-胞衬蛋白-siRNA2组,每组4只.化学合成siRNA的模板DNA 4条,退火形成2条双链DNA(dsDNA),BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后插入线性化质粒载体pGFP-V-RS的启动子下游,重组体采用双酶切和测序鉴定.将测序鉴定成功的0.5 mg/kg siRNA真核表达载体分别尾静脉注射NOD小鼠,1次/周,共2次,对照组注射等体积的磷酸盐缓冲液(PBS),空载体组注射等剂量的空载体.组织切片在荧光显微镜下观察其是否靶向到泪腺,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测NOD小鼠肺脏α-胞衬蛋白(mRNA)的表达,免疫组织化学法检测NOD小鼠泪腺和肺脏α-胞衬蛋白的表达水平.酶联免疫吸附(ELISA)法检测NOD小鼠血清中干扰素-γ和白细胞介素(IL)-17的表达水平;苏木精-伊红(HE)染色法观察各组小鼠泪腺和脏器的病理变化.统计学方法采用重复测量的方差分析.结果 ①成功构建2段siRNA真核表达载体;②α-胞衬蛋白-siRNA质粒载体靶向到泪腺;③α-胞衬蛋白-siRNA组与对照组和空载体组相比,α-胞衬蛋白mRNA和蛋白的表达明显降低;④α-胞衬蛋白-siRNA组[1组(4.38±1.02) pg/ml,2组(4.55±0.06) pg/ml]与对照组[(11.73±2.73) pg/ml]和空载体组[(15.40±1.99) pg/ml]相比,2次注射后小鼠血清中IL-17水平显著下降(P＜0.05),干扰素-γ水平无明显下降(P＞0.05);⑤α-胞衬蛋白-siRNA组与对照组和空载体组相比,小鼠泪腺淋巴细胞浸润减少,肺间质炎细胞浸润明显减少.结论 α-胞衬蛋白siRNA能抑制炎症反应,减轻NOD小鼠的泪腺和肺脏炎细胞浸润程度,从而抑制疾病的进展.     

RNA干扰SBF2对人口腔癌细胞株SCC15增殖、凋亡及侵袭的影响

目的探讨RNA干扰SET结合因子2(SBF2)表达对人口腔癌细胞株SCC15增殖、凋亡及侵袭的影响。方法根据SBF2的mRNA序列及siRNA设计原则,设计并合成3条靶向SBF2基因的siRNA(SBF2-siRNA1、SBF2-siRNA2、SBF2-siRNA3),以阳离子脂质体Lipofectamine 2000为载体转染取对数生长期SCC15细胞,同时设转染不针对任何基因的随机序列(siRNA-NC)。转染48 h后采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测SBF2干扰效率,分别于转染24、48、72 h采用WST-1法评价讨RNA干扰SBF2对SCC15细胞增殖的影响,分别于转染24、48 h后采用Annexin VFITC/PI双标流式细胞术和Transwell小室法检测SCC15细胞的凋亡率及穿膜细胞数以评价RNA干扰SBF2对凋亡和侵袭能力的影响。结果与仅行转染试剂Lipofectamine 2000处理的对照组相比,SBF2-siRNA1、SBF2-siRNA2和SBF2-siRNA3组SCC15细胞中SBF2 mRNA水平均降低(P<0.05),且干扰率由高至低依次为SBF2-siRNA2>SBF2-siRNA3>SBF2-siRNA1,故选取干扰效率最高的SBF2-siRNA2用于后续实验。与对照组和siRNA-NC组相比,SBF2-siRNA组的增殖抑制率和凋亡率均升高,而穿膜细胞数降低,以上差异均有统计学意义(P<0.05);对照组和siRNA-NC组以上指标的无统计学差异(P>0.05)。结论 RNA靶向干扰SBF2表达可抑制人口腔癌细胞增殖及侵袭能力并诱导其凋亡。     

靶向5-LOX的siRNA诱导胰腺癌细胞的凋亡

目的:采用RNA干扰技术(siRNA)阻断5-LOX基因的表达,观察其抑制人胰腺癌细胞增殖及诱导细胞凋亡的作用.方法:构建靶向5-LOx的siRNA质粒表达载体,采用Lipofectamine-2000转染人胰腺癌细胞株SW1990,采用RT-PCR检测RNA干扰后5-LOX mRNA表达,MTT法检测细胞的增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果:靶向5-LOX序列特异性的三条siRNA(组1、组2、组3)可以有效地抑制SW1990细胞5-LOX基因表达,其表达抑制率分别为19.6%±1.9%、55.4%±2.6%和55.2%±2.7%.转染靶向5-LOX siRNA的三个质粒表达载体可以显著抑制SW1990细胞的增殖, 细胞接种24 h后,三组增殖抑制率分别为5.37%±1.19%、11.63%±1.25%和13.67%±1.04%:48 h后其增殖抑制率分别为16.13%±1.5%、26.63%±1.22%和25.47%±1.67%, 各siRNA组增殖抑制率高于空白组和阴性对照组(均P<0.05),转染后24 h和48 h三组细胞凋亡率分别为5.56%±1.05%、11.45%±1.44%、12.13%±1.36%和7.37%±1.23%、18.75%±1.5%和22.02%±1.45%,均高于空白对照组和阴性对照组(P<0.05).结论:所构建的靶向5-LOX的siRNA质粒表达载体可以有效阻断SW1990细胞5-LOX基因表达,显著地抑制SW1990细胞增殖,并在一定程度上诱导其凋亡.     

LOXL2基因沉默对人胃癌细胞株BGC823增殖的影响及其机制

目的观察赖氨酰氧化酶样蛋白2(LOXL2)基因沉默后人胃癌细胞株BGC823增殖情况变化,并探讨其相关机制。方法培养并收集人胃癌细胞株BGC823、正常胃上皮细胞株GES-1,采用real-time PCR检测LOXL2 mRNA,Western blotting法检测LOXL2蛋白。将BGC823细胞分为实验组、阴性组、对照组,其中实验组、阴性组分别转染LOXL2 siRNA、NS siRNA,对照组仅加入Lipofectamine2000试剂。继续培养48 h后,采用MTT实验观察细胞增殖抑制情况,流式细胞术观察细胞周期分布,采用real-time PCR检测增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期素D1(Cyclin D1)mRNA,采用Western blotting法检测PCNA、Cyclin D1蛋白。结果 BGC823细胞中LOXL2 mRNA及蛋白相对表达量均高于GES-1细胞(P均<0.05)。与对照组相比,实验组、阴性组细胞增殖抑制率分别为48.32%±3.91%、8.86%±2.98%。实验组G0/G1期细胞百分比高于阴性组与对照组,S期细胞百分比低于阴性组与对照组(P均<0.05)。实验组细胞中PCNA、Cyclin D1 mRNA及蛋白相对表达量均低于阴性组和对照组(P均<0.05)。结论 LOXL2基因沉默后,BGC823细胞增殖受到抑制,其机制可能与下调PCNA、Cyclin D1 mRNA及蛋白表达有关。     

小干扰RNA干扰高迁移率族蛋白1对HepG2细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨小干扰RNA(siRNA)抑制高迁移率族蛋白1(HMGB1)基因对人肝癌细胞株HepG2细胞增殖和凋亡的影响. 方法设计并化学合成针对HMGB1的3对siRNA分子序列(siRNAH1、siRNH2、siRNAH3),同时设未转染对照组(Lipo组)及转染阴性siRNA组(阴性siRNA对照组).脂质体法瞬时转染HepG2细胞,通过PCR法和Western blot检测细胞中HMGB1基因在mRNA水平和蛋白质水平的变化,利用四甲基偶氮唑盐法检测转染HMGB1-siRNA的HepG2细胞增殖情况,TdT酶介导的缺口末端标记法检测细胞凋亡情况.两组数据间比较用t检验,组内数据比较用方差分析,细胞增殖数据采用可重复双因素方差分析.结果 3对特异性HMGB1-siRNA转染后,HMGB1 mRNA相对表达量分别为1.147±0.024、1.014±0.042和0.435±0.055,较Lipo组的1.411±0.065明显减少(t值分别为7.187、9.018和20.689,P值均＜0.01);HMGB1蛋白相对表达量分别为0.369±0.035、0.340±0.028和0.097±0.020,较Lipo组的0.553±0.051明显减少(t值分别为6.678、7.919和17.287,P值均＜0.01),其中以siRNAH3抑制效果最好,抑制率可达到80%.转染siRNAH3后HepG2细胞的增殖能力受到明显抑制,与Lipo组相比,72、96、120h时F值分别为34.651、540.550、3778.197,P值均＜0.01,HepG2细胞凋亡指数明显增高(F=130.696,P＜0.01).结论 靶向HMGB1基因的siRNA分子片段可以有效地抑制HepG2细胞生长,促进HepG2细胞凋亡,其作用与下调HMGB1的表达有关,HMGB1可能是肝癌治疗的一个潜在靶点.     

FUT3-miRNA重组质粒对人胃癌KATO-III细胞增殖的影响

目的:研究利用miRNA干扰技术抑制FUT3基因表达对人胃癌KATO-Ⅲ细胞增殖的影响.方法:将前期实验构建成功的2对针对FUT3基因的特异性miRNA表达载体,用脂质体转染入人胃癌KATO-Ⅲ细胞,RT-PCR检测FUT3基因表达水平的变化;免疫细胞化学法、流式细胞术检测其合成抗原sLeA表达变化;MTT法、克隆形成实验检测FUT3基因的表达抑制对KATO-Ⅲ细胞增殖的影响.结果:转染FUT3-miRNA的2个干扰组FUT3基因mRNA相对表达量分别为0.41±0.01,0.36±0.02,明显低于对照组(0.71±0.05)和空载体组(0.65±0.03,P<0.05);细胞表面合成抗原sLeA的表达水平,FUT3-miRNA1组为35.51%±0.36%,FUT3-miRNA2组为26.05%±1.14%,明显低于对照组(52.79%±2.62%)与空载体组(49.75%±1.29%,P<0.05);与对照组(5.60%±0.63%)和空载体组(8.90%±0.91%)相比较,FUT3-miRNA1组(38.10%±1.96%)和FUT3-miRNA2组(49.04%±2.37%)能明显抑制细胞的增殖(P<0.05);细胞的克隆形成能力FUT3-miRNA1组(14.10%±1.70%)和FUT3-miRNA2组(12.50%±1.96%),显著低于对照组(29.79%±3.05%)和空载体组(28.92%±2.10%,P<0.05).结论:FUT3靶向miRNA真核表达载体可有效抑制胃癌细胞的增殖能力.     

MT2-MMP基因沉默对缺氧条件下培养的胰腺癌AsPC-1细胞增殖、凋亡及侵袭力的影响

目的 利用特异性siRNA沉默人胰腺癌AsPC-1细胞的膜型金属蛋白酶2（MT2-MMP）基因表达,观察其对缺氧条件下培养的细胞增殖、凋亡和侵袭力的影响.方法 采用脂质体转染法将插入MT2-MMP特异性siRNA的真核表达质粒转染至人胰腺癌AsPC-1细胞株（siRNA组）,以转染过表达MT2-MMP质粒（过表达组）或阴性对照质粒（空载体组）的AsPC-1作为对照.实时定量PCR法和蛋白质印迹法检测转染细胞的MT2-MMP mRNA和蛋白的表达.在缺氧条件（37℃、1％O2、5％ CO2、饱和湿度的三气培养箱）下培养后,应用CCK-8法检测转染细胞的增殖,流式细胞仪检测细胞的凋亡,Transwells小室检测细胞的侵袭能力.结果 成功获取MT2-MMP基因沉默的AsPC-1细胞株和过表达的细胞株.缺氧条件下培养24h后,空载体组、过表达组、siRNA组细胞增殖的吸光度值（A490值）分别为0.68±0.08、0.80 ±0.08、0.52±0.07;细胞凋亡率分别为（6.2±1.5）％、（2.8±1.1）％、（21.4±3.9）％;每个视野（200倍）的穿膜细胞数分别为（115.8 ±23.2）、（256.4±38.6）、（45.8±18.2）个.siRNA组较空载体组的细胞增殖显著被抑制,穿膜细胞数显著减少,而细胞凋亡率显著增加（P值均＜0.05）.过表达组较空载体组的细胞增殖显著增强,穿膜细胞数显著增加,而细胞凋亡率显著降低（P值均＜0.05）.结论 MT2-MMP基因沉默的AsPC-1细胞在缺氧条件下培养后细胞凋亡增加,增殖被抑制,侵袭力减弱.     

携EGFP的STAT3载体构建、表达及其对HEP-2细胞的增殖抑制作用

目的 构建携EGFP的信号转导与转录激活因子(STAT)3 mRNA的小RNA干扰(siRNA)表达载体,并检测STAT3表达及其对HEP-2细胞增殖的抑制作用.方法 合成用于产生针对STAT3的小发卡状RNA(shRNA)寡核苷酸,克隆到PGPU6/EGFP/Neo载体中,BbsⅠ和BamHⅠ双酶切及测序鉴定重组体,并转染HEP-2细胞.流式细胞仪、RT-PCR、免疫印迹、MTT法检测HEP-2细胞中STAT3的表达及该细胞的增殖情况.结果 成功构建STAT3-siRNA表达载体,转染HEP-2后可显著抑制细胞STAT3 mRNA及蛋白的表达,细胞增殖活性显著降低(P<0.05). 结论 用pGPU6/EGFP/Neo载体,针对不同靶位点构建的STAT3-siRNA表达载体可有效抑制喉癌细胞增殖及其STAT3的表达.     

靶向肝癌HepG2细胞VEGF基因的siRNA表达载体构建及体外抑制作用

目的: 构建靶向肝癌HepG2细胞VEGF基因的siRNA表达载体并在体外检测其对VEGF基因表达的抑制作用.方法: 设计合成靶向HepG2细胞VEGF基因的siRNA cDNA序列并与pSUPER载体连接, 构建VEGF siRNA表达载体, 经酶切鉴定和测序确认后, 脂质体2000介导VEGF siRNA转染HepG2细胞. RT-PCR及Western blot检测VEGFsiRNA表达载体转染的HepG2细胞中VEGF基因表达.结果: 通过双酶切鉴定和测序分析, 成功构建了靶向HepG2细胞VEGF基因的siRNA表达载体. RT-PCR和Western blot法检测转染VEGFsiRNA表达载体的HepG2细胞VEGF mRNA及VEGF165表达下调, 其抑制率分别为65%和74%. 实验组中的HepG2中VEGF mRNA表达较阴性对照组、空载体组表达量显著下降(0.304±0.062 vs 0.896±0.061, 0.884±0.074,P<0.05).结论: 成功构建了靶向肝癌HepG2细胞VEGF基因的siRNA表达载体, 且该载体在体外能有效抑制HepG2细胞VEGF基因表达.     

RNA干扰DNA甲基转移酶1对人胰腺癌PaTu8988细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察以DNA甲基转移酶1(DNA methy transferas 1,DNMT1)基因为靶基因的RNA干扰对人胰腺癌PaTu8988细胞增殖及凋亡的影响.方法 设计、合成针对DNMT1基因的siRNA和阴性对照siRNA(N-siRNA).实验分为空白对照组、脂质体组(仅予脂质体)、N-siRNA组(转染30 nmol N-siRNA)、siRNA组(转染30 nmol siRNA).siRNA转染48 h后,实时PCR法检测DNMT1 mRNA水平;WST-8法检测细胞增殖;流式细胞技术检测细胞凋亡.结果 siRNA组DNMT1 mRNA的抑制率为(86.0±4.3)%,明显高于N-siRNA组的(40.1±2.2)%和空白对照组的0(P＜0.01);细胞存活率为(47.6±5.6)%,明显低于N-siRNA组的(68.1±4.1)%和空白对照组的100%(P＜0.01);细胞凋亡率为(14.94±2.89)%,明显高于空白对照组的(7.51±1.12)%、脂质体组的(7.06±0.39)%、N-siRNA组的(8.84±1.44)%(均P＜0.01).结论 siRNA能特异、有效地抑制人胰腺癌PaTu8988细胞DNMT1mRNA的表达,同时抑制细胞增殖、促进细胞凋亡.     

GATA结合蛋白6对子宫内膜癌细胞活性的影响及作用机制

目的 探讨珠蛋白转录因子(GATA)结合蛋白6对子宫内膜癌细胞活性的影响及作用机制。方法 常规培养人子宫内膜癌系(HEC)-151,转染并分组：空白对照组(含10%胎牛血清的DMEM细胞培养基);GATA结合蛋白6空载质粒组(加入空载体质粒);GATA结合蛋白6过表达质粒组(加入过表达质粒);GATA结合蛋白6 siRNA阴性对照组(加入siRNA阴性对照);GATA结合蛋白6siRNA组(加入siRNA)。同时常规培养人子宫内膜上皮细胞hEEC。CCK-8法和流式细胞术检测细胞增殖活力和凋亡率；划痕实验和Transwell侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力。RT-PCR检测GATA结合蛋白6、星形胶质细胞上调基因(AEG)-1 mRNA表达。Western印迹检测人细胞凋亡调节因子(Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-9、钙黏蛋白E、波形蛋白表达。结果 人子宫内膜癌细胞中GATA结合蛋白6 mRNA、AEG-1 mRNA表达水平明显高于人子宫内膜上皮细胞(P<0.01)。GATA结合蛋白6过表达质粒组细胞活力明显高于GATA结合蛋白6空载质粒组、空白对照组，...     

钠-氢交换蛋白1反义表达载体对人肺腺癌细胞钠-氢交换蛋白1基因表达的影响及其意义

目的　探讨Na /H 交换蛋白 1(NHE 1)反义表达载体 (pNHE 1)对人肺癌细胞NHE 1基因的抑制作用及生物学效应。方法　实验细胞分为 3组 ,A5 4 9 pNHE 1组 (反义组 )、A5 4 9空载体组(空载体组 )、A5 4 9对照组 (A5 4 9组 )。采用阳离子脂质体使pNHE 1转染人肺腺癌A5 4 9细胞株。采用半定量逆转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)法测定 3组细胞的NHE 1mRNA表达水平 ;用荧光法测定 3组细胞内pH(pHi)值 ;了解转染细胞增殖生长状况 ;用细胞凋亡原位检测法检测 3组细胞凋亡率。结果　在转染细胞基因组DNA中扩增出外源真核表达载体的DNA片段 ,证明转染成功。半定量RT PCR法证实反义组细胞的NHE 1mRNA表达水平 (0 4 2± 0 0 6 )显著低于A5 4 9组 (0 71± 0 0 8,P <0 0 1)和空载体组 (0 6 9± 0 16 ,P <0 0 1)。A5 4 9组细胞在培养 12、2 4和 4 8h后pHi值分别为 7 15 0±0 0 0 4、7 14 0± 0 0 0 7和 7 12 0± 0 0 0 8,反义组pHi值分别为 6 990± 0 0 0 5、6 84 0± 0 0 0 5和 6 75 0±0 0 0 5 ,两组差异均有极显著性 (P <0 0 1)。A5 4 9组、空载体组和反义组的细胞倍增时间分别为 3 2 0、3 2 8和 4 97d ,反义组细胞的增殖、生长明显慢于A5 4 9组及空载体组 (P <0 0 1)。反义组细胞凋亡率为 (2 4     

RNA干扰沉默NF-κB p65基因表达抑制胰腺癌PANC1细胞增殖与侵袭的研究

目的 运用RNA干扰技术阻断人胰腺癌细胞株PANC1的NF-κB p65表达,观察该基因沉默后对细胞增殖能力及体外侵袭能力的影响.方法 采用阳离子脂质体LipofectamineTM 2000将化学合成的人NF-κB p65的小干扰RNA(siRNA)转染人胰腺癌细胞PANC1作为siRNA组,另设无同源性siRNA转染细胞的阴性对照组和蒸馏水空白对照组.实验重复6次.应用RT-PCR检测转染细胞NF-κB p65 mRNA与细胞间黏附分子-1(ICAM-1)mRNA的表达.MTT结合克隆形成实验测定细胞生长抑制率.Matrigel细胞侵袭实验测定细胞体外侵袭能力.结果 siRNA组、阴性对照组和空白对照组NF-κB p65 mRNA相对表达量分别为0.227±0.045、0.381±0.038和0.404±0.031;ICAM-1 mRNA相对表达量分别为0.597±0.083、0.983±0.068和1.027±0.098;细胞生长抑制率(72 h)分别为18.3%、2.3%和0;克隆形成率分别为(14.1±3.1)%、(24.5±2.1)%和(27.2±2.6)%;侵袭细胞数分别为80.25±6.35、123.83±8.80和127.68±9.23.siRNA组均明显低于2个对照组(P＜0.01).结论 NF-κB p65的RNA干扰能抑制胰腺癌PANC1细胞NF-κB p65 mRNA和ICAM-1 mRNA的表达,抑制细胞的生长和侵袭.     

生存素siRNA表达质粒对MGC-803细胞增殖的影响

目的:应用siRNA表达载体介导的RNAi技术,观察 RNA干扰沉默生存素基因对胃癌MGC-803细胞增殖的影响．方法:用脂质体介导将生存素siRNA表达质粒转染 MGC-803细胞,通过倒置显微镜观察转染后细胞形态学的变化,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性,流式细胞术分析细胞周期的变化,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测生存素mRNA的表达水平．结果:生存素siRNA表达质粒转染组MGC-803细胞变圆、浮起,生存素siRNA表达质粒明显下调MGC-803 细胞内生存素mRNA的表达,与空白对照组相比降低了48．2％,阻断细胞周期在G1期(77．4％),显著抑制细胞增殖,siRNA转染组细胞吸光度比空白组显著降低 (24 h:0．272±0．048 vs 0．576±0．018;48 h:0．270±0．060 vs 0．809±0．027;72 h:0．143±0．046 vs 1．015±0．075;均 P<0．01)．转染24,48和72 h后的抑制率分别为53．4％, 66．7％和86.3％．结论:应用siRNA表达载体介导的RNAi技术,可有效下调生存素在MGC-803细胞中的表达,并在体外抑制细胞的增殖．     

分化抑制因子1对结肠癌HT-29细胞增殖的影响

目的 检测分化抑制因子1(Id1)对结肠癌HT-29细胞VEGF表达的影响,探讨其在结肠癌增殖中的作用.方法 HT-29转染Id1表达质粒,RT-PCR方法和Western印迹法检测血管内皮生长因子(VEGF) mRNA和蛋白的表达,MTT法检测各组细胞增殖情况;合成Id-1干扰序列转染HT-29细胞后,RT-PCR及Western印迹检测HT-29细胞VEGF mRNA和蛋白的表达情况,采用MTT法检测各组细胞增殖情况.结果 Id1表达质粒空白组、对照组(空载体组)、过表达组VEGF/GAPDH mRNA分别为:0.002 99±0.000 687、0.003 49±0.001 34、0.0313±0.00605(P＜0.01);VEGF/GAPDH蛋白分别为:0.132±0.035 1、0.131±0.053 0、0.245 ±0.032 6(P ＜0.01),MTT实验显示相对对照组,过表达组增殖明显快(P＜0.01).Id-1干扰空白组、对照组(空载体组)、抑表达组VEGF/GAPDH mRNA分别为:0.006 16±0.000 829、0.006 26±0.000 447、0.002 3±0.000 308(P ＜0.01);VEGF/GAPDH蛋白分别为:0.450 ±0.039 3、0.464±0.023 1、0.231±0.027 3(P ＜0.01).MTT实验显示相对对照组,抑表达组增殖明显减慢(P＜0.01).Id1过表达能显著上调VEGF mRNA和蛋白表达,提高细胞的生长,Id1抑制后能显著下调VEGF mRNA和蛋白表达,减缓细胞的生长.结论 在结肠癌HT-29细胞中Id1为VEGF的上游基因,Id1通过Id1 ↑ →VEGF ↑途径来影响结肠癌细胞增殖,在肿瘤血管生成中发挥重要作用.Id1有望成为结肠癌治疗的一个新靶点.     

小干扰质粒干扰肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物A对小鼠胰岛β细胞增殖及胰岛素基因表达的影响

目的探讨肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物A(MafA)对胰岛β细胞增殖及胰岛素基因表达的影响。方法采用RT-PCR和Western blot分别测Ma。fA mRNA和蛋白的表达,筛选最佳小干扰质粒(siRNA),分为转染对照组(Cy3组)、阴性对照组(Scramble组)、阳性对照组(siβ-actin组)及实验组(即siMafA-1、siMafA-2和siMafA-3组)。按不同葡萄糖浓度分为5.6 mmol/L、10 mmol/L、25 mmol/L。根据不同葡萄糖浓度是否加入siRNA分为未加siRNA的对照组:A_0组5.6 mmol/L、B_0组10 mmol/L、C_0组25 mmol/L;加入siRNA的实验组:A_1组5.6 mmol/L、B_1组10 mmol/L、C_1组25 mmol/L。测MafA基因沉默后MIN6细胞增殖、胰岛素(Insulin)-1和Insulin-2 mRNA表达、MafA蛋白表达及上清液胰岛素浓度的变化。结果siMafA-2组干扰效果最好。C_1组MafA蛋白表达较C_0组下降(P0.05);MIN6细胞增殖、Insulin-2 mRNA表达和上清液胰岛素浓度均降低(P0.05)。A_1组与A_0组比较,MafA蛋白表达比较,差异无统计学意义(P0.05);MIN6细胞增殖、Insulin-2 mRNA表达和上清液胰岛素浓度比较,差异无统计学意义(P0.05)。不同糖浓度各亚组与对照组Insulin-1 mRNA表达比较,差异均无统计学意义(P0.05)。结论siRNA-2组是理想的siRNA。MafA下调可抑制小鼠胰岛β细胞增殖。MafA下调可抑制小鼠Insulin2 mRNA表达和胰岛素分泌。     

lncRNA FOXCUT调控FOXC1基因对结直肠癌HCT116细胞增殖、迁移的作用研究

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)叉头框C1基因启动子上游转录体(FOXCUT)通过调控叉头框C1(FOXC1)基因对结直肠癌HCT116细胞增殖、迁移的作用。方法将lncRNA FOXCUT siRNA、siRNA control序列分别转入HCT116细胞,设为沉默组和空载组,未经处理细胞为空白组;比较3组转染后lncRNA FOXCUT基因表达量、细胞增殖、迁移能力及细胞FOXC1、基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9、波形蛋白(Vimentin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)mRNA和蛋白表达量。结果沉默组lncRNA FOXCUT基因相对表达量低于空白组和空载组(P0.05);沉默组细胞CCK-8实验48、72 h光密度(A)值均低于空白组和空载组(P0.05),3组细胞CCK-8实验A值随时间的延长均升高(P0.05);沉默组48 h细胞迁移率低于空白组和空载组(P0.05)。沉默组FOXC1、MMP2、MMP9、Vimentin mRNA和蛋白相对表达量均低于空白组和空载组(P0.05);沉默组E-cadherin mRNA和蛋白相对表达量高于空白组和空载组(P0.05)。结论沉默lncRNA FOXCUT基因可抑制结直肠癌细胞增殖、迁移能力,可能通过调控FOXC1及其下游MMP2、MMP9、Vimentin、E-cadherin mRNA和蛋白表达发挥作用。     

类风湿关节炎外周血单个核细胞和滑膜中人类软骨糖蛋白-39的研究

目的　通过观察人类软骨糖蛋白 39(HCgp 39)mRNA在类风湿关节炎 (RA)外周血单个核细胞 (PBMC)和滑膜中的表达水平 ,寻找反映RA早期骨破坏的敏感指标。方法　采集 31例RA、6例骨关节炎 (OA)、10例血清阴性脊柱关节病 (SpA)、5例系统性红斑狼疮 (SLE)以及 10例健康人新鲜抗凝静脉血 ,分离单个核细胞 ,并采集 7例RA、5例OA的滑膜 ,行半定量逆转录 (RT) PCR。结果　RA患者PBMC中HCgp 39mRNA行RT PCR与内对照tubulin共扩增后吸光度比值为0 86 90± 0 5 2 4 0 ,与OA(P =0 0 2 4 )、SpA(P =0 0 4 9)、SLE(P =0 0 4 3)以及健康对照 (P =0 0 33)相比差异均有显著性。而OA、SpA、SLE与健康对照之间差异无显著性。RA滑膜HCgp 39mRNA行RT PCR与tubulin共扩增后吸光度比值为 1 986 3± 1 9397,与OA相比差异有显著性 (P =0 0 4 )。在RA和OA中 ,同一患者的PBMC与滑膜HCgp 39mRNA表达差异无显著性。 结论　HCgp 39mRNA在RA患者PBMC和滑膜的表达明显高于其他炎症性关节病 ,提示HCgp 39可能是RA发病机制中重要的自身抗原 ,它的异常表达可能是造成T细胞介导自身免疫反应的机制之一。     

下调Jagged1表达对骨髓瘤细胞增殖的抑制作用

目的探讨下调Jagged1表达对骨髓瘤细胞增殖的抑制作用及其机制。方法将培养的RPMI8226细胞随机分为对照组(不做转染)、siRNA control组(转染negative control)和siRNA Jagged1组(转染Jagged1-siRNA),以RT-PCR检测各组细胞中Jagged1 mRNA表达水平,CCK-8法检测细胞的增殖能力,流式细胞仪检测细胞的周期分布和凋亡率;Western印迹检测细胞中Jagged1、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、B细胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2和酶切半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3蛋白的表达情况。结果与对照组比较,siRNA Jagged1组细胞中Jagged1 mRNA和蛋白表达水平、细胞增殖能力、S期细胞比例、Cyclin D1蛋白和Bcl-2蛋白表达水平显著降低,G0/G1期细胞比例、凋亡率和酶切caspase-3蛋白表达显著升高(P0.05);而siRNA control组细胞中各指标变化差异无统计学意义(P0.05)。结论下调Jagged1表达可抑制骨髓瘤RPMI8226细胞增殖,阻滞细胞于G0/G1期,并诱导细胞凋亡,其作用机制可能与下调Cyclin D1和Bcl-2蛋白表达及上调酶切caspase-3蛋白表达有关。     

下调EZH2表达对胃癌细胞株MKN1增殖作用的研究

目的 下调EZH2的表达,探讨EZH2在胃癌细胞株MKN1增殖、细胞周期中的作用,研究EZH2在胃癌发生与发展中的作用.方法 将EZH2的siRNA表达载体pSilencer 2.1-U6(+)通过Lipofect AUINE 2000转入人胃癌细胞MKN1中,G418选择培养,建立EZH2低表达的胃癌细胞系MKN1/Silence(+);RT-PCR和Western blot检测EZH2在MKN1、MKN1/Silence(+)和MKN1/Silence(-)细胞表达,MTT法检测细胞增殖的活性,流式细胞观察其对MKN1细胞周期的影响.结果 构建成功稳定表达EZH2 siRNA细胞MKN1/Silence(+):EZH2在MKN1/Silenc(+)的mRNA和蛋白的表达明显下降,MKN1/Silence(+)细胞增殖明显抑制.在细胞周期试验中,MKN1/Silence(+)细胞G2/M期(36.08±1.34)比MKNI(16.59 ±0.71)、空载体MKNI/Silence(-)(18.35 ±0.35)显著增高(P＜0.01),Go/G1期细胞显著减少(P＜0.01),而S期细胞无明显变化,EZH2 siRNA作用下阻滞于G2/M期.结论 下调EZH2的表达显著性阻滞了MKN1细胞的增殖,诱导细胞阻滞细胞于G2/M期