霍乱毒素基因(ctx)和耐热直接溶血素基因(tdh)双重TaqMan实时PCR检测方法的建立

[目的]建立霍乱毒素和耐热直接溶血素基因双重TaqMan实时-PCR实验室检测方法。[方法]根据霍乱毒素基因(Cholera toxin gene,ctx)和耐热直接溶血素基因(thermostable direct hemolysin,tdh)的保守序列设计引物和TaqMan探针,建立检测霍乱毒素和耐热直接溶血素两种毒力基因的双重TaqMan实时PCR方法。对所建立的霍乱毒素基因和耐热直接溶血素基因双重TaqMan实时PCR检测方法进行灵敏度和特异度评价。[结果]建立了霍乱毒素基因和耐热直接溶血素基因双重TaqMan实时PCR的实验室检测方法。优化的tdh和ct双重TaqMan实时PCR反应体系中,ct引物和探针的浓度分别为200nmol/L和100nmol/L;tdh引物和探针的浓度分别为200nmol/L和100nmol/L。反应体系的灵敏度和特异度均为100%。优化的反应体系对两种质粒模板的检测下限均为1.0×102拷贝/μl,扩增效率分别为94%和97.7%。[结论]本研究建立了基于TaqMan探针的tdh和ct双重实时PCR检测方法,具有令人满意的灵敏度和特异度。检测下限能达到1.0×102拷贝/μl,高于普通PCR100倍。并且双重实时PCR能够在一个反应体系中同时检测两种毒力基因,这为费时又繁琐的传统检测方法提供了一种可靠又快速的替代选择。     

副溶血弧菌不耐热溶血毒素的表达与纯化

目的　表达和纯化融合表达的副溶血弧菌不耐热溶血毒素。方法　将表达载体 pET3 2a -tlh转化大肠杆菌BL2 1(λDE3) ,诱导表达副溶血弧菌不耐热溶血毒素 ,表达产物用聚丙稀酰胺凝胶电泳 (SDS -PAGE)鉴定 ,8mmol/L的尿素溶解包涵体 ,用 6×his组氨酸蛋白质镍亲和层析树脂亲和层析纯化目的蛋白。结果　诱导表达的目的蛋白以包涵体形式存在 ,其含量约占菌体总蛋白的 10 % ,纯化获得了高纯度的融合表达的副溶血弧菌不耐热溶血毒素。结论　转化有重组质粒pET3 2a -tlh的BL2 1(λDE3)可稳定高效地表达目的蛋白 ,采用低浓度的咪唑、β -巯基乙醇和Tritonx -10 0等方法减少杂蛋白污染 ,亲和层析纯化目的蛋白 ,可获得高纯度的目的蛋白     

应用PCR检测副溶血弧菌的耐热溶血毒素基因tdh

副溶血弧菌可引起食物中毒或急性胃肠炎，尤其在夏季，常可从食用不洁海产品而导致食物中毒的病人肛拭标本中分离到。目前一般认为该菌的热稳定性溶血毒素(TDH)是重要的毒力因子。TDH可在莪萋氏血平板上产生一种特殊的溶血现象，称作神奈川现象(Kanagawa phenomenon，KP)^[1]。临床上分离出的副溶血弧菌株几乎都是KP阳性，因此通常认为KP阳性为产毒株，KP阴性为非产毒株。     

不同来源副溶血性弧菌血清群耐热直接溶血素及耐药性研究

摘要：目的　了解不同来源副溶血性弧菌血清群分布,耐热直接溶血素携带情况及耐药性状况。方法　利
用血清凝集试验进行血清群检测;利用荧光定量ＰＣＲ 仪进行耐热直接溶血素检测;采用纸片扩散法进行
１１种抗生素药物敏感试验;采用χ
２ 检验进行统计学分析。结果　副溶血性弧菌食物中毒和肠道门诊分离
株血清群以Ｏ３和Ｏ４为主,水产品分离株无优势血清群。副溶血性弧菌食物中毒和肠道门诊分离株耐热直
接溶血素检出率均达９０％以上,经χ
２ 检验差异无统计学意义（χ
２＝０．０３,ν＝１,犘＝０．８６）。副溶血性弧
菌水产品分离株耐热直接溶血素检出率为０。６２ 株副溶血性弧菌对氯霉素、四环素和复方磺胺甲 唑
１００％敏感。结论　副溶血性弧菌食物中毒和肠道门诊分离株与水产品分离株的血清群和耐热直接溶血素存
在较大差异。抗生素首选氯霉素、四环素和复方磺胺甲唑。
关键词：副溶血性弧菌;血清群;耐热直接溶血素;耐药
中图分类号：Ｒ３７８．３　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００９ ６６３９ （２０１４）０６ ０６０８ ０４     

杭州地区2000-2002年副溶血弧菌的分子分型研究

目的了解杭州地区2000-2002年副溶血弧菌临床和环境分离菌株的分子流行病学特征.方法对172株2000年和2002年从临床食物中毒患者和散发腹泻病例以及外环境（小水产品）中分离的副溶血弧菌菌株进行血清分型.对40株临床来源O3：K6型菌株及环境来源O3：KUT（K抗原未分型）型菌株,应用PCR技术进行耐热直接溶血素基因（tdh）和耐热直接溶血素相关基因（trh）的检测,并进行核糖体基因分型（ribotyping）、随机扩增多态性DNA分析（RAPD）、肠道细菌重复基因间共同序列PCR（ERIC-PCR）等.结果在调查的13起副溶血弧菌引起的食物中毒中,tdh阳性、trh阴性的O3：K6血清型引起的有11起（84.6%）;tdh阳性、trh阴性的O4：K8菌引起有2起（15.4%）.在散发腹泻病例中,tdh阳性、trh阴性的O3：K6、O4：K8和O1：KUT菌株分别占26.5%（9/34）、17.6%（6/34）和38.2%（13/34）,未能分型的占17.6%（6/34）.在水产品中分离的菌株中,37株分属7种O血清型,其中未见有O3：K6和O4：K8血清型;另外有9株未能分型;其中除1株O1：KUT菌株trh阳性外,其余tdh和trh均为阴性.绝大部分食物中毒患者和散发腹泻病例分离的O3：K6菌株在ribotyping、ERIC-PCR及RAPD三种指纹上均属于一种密切相关的克隆群,而环境分离的O3：KUT菌株与临床分离的O3：K6菌株间,在三者指纹上均有明显差异.结论临床来源和小水产品来源的副溶血弧菌菌株间血清型分布有显著差别;一群关系密切、tdh阳性、trh阴性的O3：K6血清型菌株在杭州地区呈优势流行.     

副溶血性弧菌直接溶血毒素65位氨基酸突变体的构建

目的：将副溶血性弧菌直接溶血毒素65位氨基酸进行突变。方法：酶切tdh基因获得tdhm268-570bp，一对突变引物扩增出tdhm1-267bp，与载体pUC19连接并转化大肠杆菌JM109；对重组质粒进行测序鉴定。结果：DNA测序结果表明tdhm和tdh的序列有2个碱基的差别。结论：按照预期设计成功突变了副溶血性弧菌的直接溶血毒素的65位氨基酸，为构建该菌的基因工程菌苗奠定了良好的基础。     

利用免疫磁珠法分离环境及食品中产生TDH副溶血性弧菌的研究

采用免疫磁珠法分别从 1份海水、 1份海泥和 3份蛤肉中检出了神奈川现象阳性 ,并产生耐热直接溶血毒素 (TDH )的副溶血性弧菌 ,血清型为O3 :K6。该方法与一般的细菌培养分离法相比 ,极大地提高了环境样品及食品中病原性副溶血性弧菌的检出率 ,也为研究TDH阳性副溶血性弧菌在环境中的分布及预防由其引起的食物中毒提供了依据     

抗副溶血弧菌TLH蛋白多克隆抗体的制备及其ELISA双抗体夹心检测法的研究

目的分别制备抗副溶血弧菌及其不耐热溶血毒素(thermolabile hemolysin,TLH)的多克隆抗体,建立检测副溶血弧菌TLH的酶联免疫吸附试验(ELISA)双抗体夹心法。方法以副溶血弧菌及其TLH分别免疫健康雄性新西兰大白兔和雌性BALB/C小鼠,制备兔抗副溶血弧菌多克隆抗体及小鼠抗TLH多克隆抗体,以间接ELISA法检测两种抗体效价,并以棋盘法筛选两种多克隆抗体用于夹心检测TLH的效价。结果兔抗副溶血弧菌多克隆抗体效价达1∶6400,鼠抗TLH多克隆抗体效价为1∶102 400,经筛选确定以1∶800稀释的兔抗副溶血弧菌多克隆抗体包被酶标板,与1∶1600稀释的鼠抗TLH抗体建立了ELISA双抗体夹心法。结论兔抗副溶血弧菌多克隆抗体可与TLH呈特异性反应,以此建立的双抗体夹心法检测副溶血弧菌TLH可获较满意结果,此实验可为进一步建立简便、快速的副溶血弧菌检测方法奠定基础。     

副溶血性弧菌直接溶血相关毒素蛋白的纯化及性质初探

目的 纯化副溶血性弧茵直接溶血相关毒素(TRH)蛋白,鉴定表达产物的生物学活性和免疫原性,为构建副溶血性弧菌快速检测方法奠定物质基础。方法 构建trh基因的原核融合表达系统PRⅡ(trh／pGEX-3X／DE3),在31℃条件下0.6mmot／L IPTG诱导表达。用SDS-PAGE分析蛋白表达,溶血试验检测表达蛋白的溶血活性。将表达产物皮下注射免疫兔,溶血抑制实验检测该抗体体外对TRH溶血活性的抑制作用。结果 PRⅡ在上述条件下诱导后,TRH呈可溶性、融合性表达。溶血试验表明,表达的蛋白具有溶血活性。用表达的蛋白免疫兔产生的相应抗体,在体外具有抑制TRH溶血活性的作用。结论 trh基因在原核融合表达系统pGEX-3X／DE3中获得成功表达,并得到纯度较高的TRH蛋白,为基因工程大规模制备高纯度TRH抗原、制备抗TRH的多克隆和(或)单克隆抗体、构建基因工程菌苗、阐明该菌的致病机制奠定了基础。     

市售生食水产品污染副溶血性弧菌的病原学分析

目的通过对2011～2012年合肥市售生食水产品中分离的副溶血性弧菌血清型、毒力基因和耐药性的研究,了解生食海产品污染的副溶血性弧菌的病原学特征。方法按GB/T4789.7-2008方法进行分离鉴定,用PCR技术检测不耐热溶血素(tlh)基因、耐热直接溶血素基因(tdh)和耐热直接溶血素相关溶血素基因(trh)。药敏试验采用K-B法。结果两年检获的65株副溶血性弧菌分属11个血清群,以O2(41.54%)、O1(12.31%)、O3(12.31%)群为主。65株菌均不携带tdh和trh毒力基因,tlh基因全部阳性。药敏结果显示,65株菌对15种抗生素显示出较高的青霉素(100.0%)和氨苄西林(95.4%)耐药性。结论近年来合肥市售生食水产品中污染的副溶血性弧菌以O2血清型为主,tdh基因和trh基因均为阴性。     

赤潮藻溶血活性测定标准的建立

目的探讨溶血毒素活性测定的标准化。方法以溶血毒素产生藻——海洋卡盾藻为材料,在系统分析和考查超声波细胞破碎法和液氮研磨法、不同减压蒸馏温度、不同来源红细胞及样品保存时间和温度等对溶血毒素活性影响的基础上,提出海洋卡盾藻溶血毒素及活性的提取、测定最优化方法。结果超声波细胞破碎法和液氮研磨法得到的溶血活性分别为288.23和94.89HU/L;超声时间分别为5、10、20和30min时,测得溶血活性分别为80.57、157.45、288.23和279.17HU/L;减压蒸馏温度分别为40、60和80℃时,溶血活性为288.23、124.97和120.68HU/L。分别选择兔、昆明鼠、花身和人的红细胞作为底物,测定等量毒素的溶血活性,测得溶血活性分别为244.98、288.23、266.35和195.47HU/L;将离心后的藻细胞分别于0、20和-20℃保存1、3和7天,藻细胞的溶血活性随时间延长逐渐降低。结论超声波为最佳藻细胞破碎法;功率为200W时,超声时间以20min为宜;蒸馏温度应保持在40℃左右;兔红细胞对溶血毒素最为敏感。实际测定时,最好选择5%兔血红细胞;藻类样品在0℃下最多可保存3天。     

055 副溶血性弧菌溶血素基因及其检测的研究进展

副溶血性弧菌是一种重要的食源性致病菌，可引起急性胃肠炎和原发性败血症。副溶血性弧菌能够产生3类溶血素，包括不耐热溶血素（TLH）、耐热直接溶血素（TDH）和TDH相关溶血素（TRH）。TLH、TDH和TRH分别由tlh、tdh和trh基因编码。副溶血性弧菌溶血素基因的检测通常采用PCR和核酸杂交，复合PCR和实时荧光定量PCR是未来检测技术应用的趋势。     

不同膜脂对米氏凯伦藻溶血毒素致溶血作用的影响

目的研究不同膜脂对米氏凯伦藻溶血作用的影响。方法于反应体系中加入外源性卵磷脂、鞘磷脂、L-α-磷脂酸、胆固醇和神经节苷脂等5种膜脂,观察其对米氏凯伦藻溶血毒素活性的影响;分析溶血毒素对不同动物红细胞的溶血活性,比色法测定不同动物红细胞膜中神经节苷脂的总量。结果 5种膜脂中,只有神经节苷脂对溶血活性具有显著的抑制作用(P<0.05)。加入神经节苷脂10min后,其溶血活性仅为16.05%,而对照组为35.65%。兔红细胞对毒素最为敏感,溶血百分数明显高于相应大鼠(P<0.05)和美国红鱼(P<0.01);兔、大鼠和美国红鱼每克冻干红细胞膜上脂结合唾液酸(LBSA)的量分别为672.08、585.97和431.52μg/g,兔红细胞膜上LBSA量显著高于大鼠和美国红鱼(P<0.05)。结论外源神经节苷脂可显著抑制米氏凯伦藻溶血毒素的活性,不同动物红细胞对毒素的敏感性与其红细胞膜上神经节苷脂的量呈明显相关。     

杭州地区临床和环境分离副溶血弧菌菌株携带毒力基因的特征

目的　了解杭州地区临床和环境分离副溶血弧菌菌株的毒力基因特征。方法　对近年从食物中毒病人、临床散发病人和外环境 (小水产品 )中分离的 174株副溶血弧菌菌株 ,应用PCR技术进行耐热直接溶血素基因 (tdh)和耐热直接溶血素相关基因 (trh)的检测。结果　临床来源的副溶血弧菌 (94株来自食物中毒病人和 34株来自散发腹泻病人 )菌株的tdh携带率均大于 97% ,trh携带率为 0 % ;而所有 4 6株分离自环境 (小水产品 )的副溶血弧菌菌株未见有tdh携带 ,仅 1株trh阳性。 1株tdh阴性、trh阳性的副溶血菌株 ,其尿素酶试验为阳性 ,而在其他所有trh阴性的副溶血菌株中 ,不管其tdh是阳性或是阴性 ,尿素酶试验均为阴性。结论　引起杭州地区食物中毒及散发腹泻的副溶血弧菌主要为tdh阳性、trh阴性菌株 ,外环境中存在的trh阳性的副溶血弧菌也是一个潜在的病原     

副溶血性弧菌溶血素基因及其检测的研究进展

副溶血性弧菌是一种重要的食源性致病菌,可引起急性胃肠炎和原发性败血症。副溶血性弧菌能够产生3类溶血素,包括不耐热溶血素(TLH)、耐热直接溶血素(TDH)和TDH相关溶血素(TRH)。TLH、TDH和TRH分别由tlht、dh和trh基因编码。副溶血性弧菌溶血素基因的检测通常采用PCR和核酸杂交,复合PCR和实时荧光定量PCR是未来检测技术应用的趋势。     

055副溶血性弧菌溶血素基因及其检测的研究进展

副溶血性弧菌是一种重要的食源性致病菌,可引起急性胃肠炎和原发性败血症.副溶血性弧菌能够产生3类溶血素,包括不耐热溶血素(TLH)、耐热直接溶血素(TDH)和TDH相关溶血素(TRH).TLH、TDH和TRH分别由tlh、tdh和trh基因编码.副溶血性弧菌溶血素基因的检测通常采用PCR和核酸杂交,复合PCR和实时荧光定量PCR是未来检测技术应用的趋势.     

武汉市6起食物中毒副溶血弧菌分子特征研究

目的：了解武汉地区6起食物中毒病原菌副溶血弧菌分子特征。方法：对6起食物中毒共16株分离株进行药敏分析,运用PCR技术进行耐热性溶血毒素基因（tdh）和耐热性溶血毒素相关溶血素基因（trh）检测,并进行肠道细菌重复基因间共同序列PCR（ER IC-PCR）分析。结果：16株副溶血弧菌对第三代头孢和喹诺酮类较敏感,tdh阳性,trh阴性,ER IC-PCR结果显示每起食物中毒菌株亲缘关系非常紧密,有3起属于同一个群,另外2起属于一个群。结论：武汉地区流行的主要副溶血弧菌分子特征为tdh阳性,trh阴性,ER IC-PCR技术是分析副溶血弧菌引起食物中毒菌株非常有效的工具。     

2015—2020年深圳市水产品及养殖水中副溶血弧菌的毒力基因与耐药性分析

目的 了解2015—2020年深圳市水产品及养殖水中副溶血弧菌的毒力基因和耐药谱情况。方法 采用多重荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术对来源于深圳市食品风险及霍乱监测中的96株副溶血弧菌进行耐热直接溶血素（thermostable direct hemolysin,TDH）、耐热直接相关溶血素（TDH-related hemolysin,TRH）和不耐热溶血素（thermolabile hemolysin,TLH）毒力基因筛查；采用最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）法对其进行17种抗生素耐药谱筛查。结果 96株副溶血弧菌均不含有tdh和trh基因，tlh基因携带率为100%。菌株对氨苄西林耐药率最高，为93.75%，中介率为5.21%；对头孢唑啉中介率最高，为42.71%，其次是头孢吡肟和氨曲南，中介率分别为16.67%和10.42%；所有菌株对头孢替坦、头孢他啶、环丙沙星、庆大霉素、头孢曲松、呋喃妥因、亚胺培南、左旋氧氟沙星、妥布霉素9种抗生素均敏感，敏感率为100%。结论 2...     

广东省食源性副溶血弧菌表型特征与分型比较研究

目的 了解广东省食源性副溶血弧菌的表型特征,并对其分型进行综合比较.方法 对分离自广东省水产品和食物中毒的74株副溶血弧菌分离株进行生化鉴定、药敏试验、耐热直接溶血素(tdh)和耐热直接溶血素相关溶血素(trh)毒力基因的PCR检测.并对副溶血弧菌进行血清分型、核糖体基因分型(Ribotyping)和脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型,应用BioNumerics软件对不同来源、时间和地点的分离株进行比对,分析菌株之间的相关性.结果 副溶血弧菌除对氯霉素100.00％敏感外,对其余13种抗生素均有不同程度的耐药.tdh阳性率为24.32％、trh阳性率为4.05％.74株副溶血弧菌分为26种血清型,O5:K17和O2:K28型为水产品分离株的优势血清型,O3:K6型为食物中毒分离株的优势血清型.74株副溶血弧菌分为62个核糖体型、67个PFGE型,表现出较大的遗传多样性.结论 广东省大部分食物中毒副溶血弧菌分离株携带tdh毒力基因.3种分型方法中,PFGE的分辨率最高,Ribotyping居中,血清分型最低,3种方法相结合可提高分辨率.     

副溶血弧菌分子致病机制研究进展

副溶血弧菌易引起食物中毒,研究表明副溶血弧菌的致病性是多种毒力因子共同作用的结果。本文从分子水平对副溶血弧菌的溶血毒素、尿素酶、蛋白酶、侵袭力和黏附力等毒力因子进行综述,为进一步研究该菌的分子致病机理提供参考。