新型核酸酶使细菌产生的重组DNA蛋白容易纯化

在溶解微生物以获得所需蛋白质时,需要一种核酸酶,以去除由微生物产生的物质中的RNA或DNA.丹麦Eenzon公司生产的工业级别的核酸酶(BNIG)能纯化和分离所需蛋白质.在大肠杆菌中表达的核酸酶可使DNA或RNA最终降解成容易去除的二核苷酸,这样,在蛋白质纯化前就降低了细菌和真核生物的溶解产物的粘滞度.     

液相-电喷雾离子化-质谱在DNA加合物检测中的应用进展

DNA加合物是一种判断DNA损伤的重要的生物标志物。对于某些特殊DNA加合物的检测不仅能够获取个体对于这些化合物的接触情况,而且还可以判断其可能产生的效应。DNA加合物有许多检测方法,如32P后标记法、免疫法和液相/气相-质谱联用法等等。随着液相-质谱偶联技术(LC-MS)的发展,离子化方法尤其是电喷雾离子化(ESI)方法在技术上的突破以及离子发射和检测技术的进步,LC-MS可以检测暴露外源遗传毒性化合物后与动物和人组织DNA形成的加合物水平。本文就LC-ESI-MS液相质谱联用技术在检测碱基、核苷和核苷酸DNA加合物方面的应用做一简述。     

阿西维辛或谷胱甘肽降低顺铂引起的肾脏毒性和顺铂-DNA加合物在鼠肾脏中的水平(英文)

目的　为了了解阿西维辛 (acivicin)和GSH预防肾脏毒性的机制 ,研究了顺铂 DNA加合物在大鼠肾脏中的水平。方法　顺铂 (6mg·kg- 1)从尾静脉注入大鼠 ,5d后处死。其他两组动物在给顺铂前2 .5h ,给予阿西维辛或者GSH。测量顺铂 DNA加合物在肾脏中的浓度、血中尿素氮 (BUN)和丝氨酸肌酸的浓度。结果　在给顺铂前 2 .5h ,给 10mg·kg- 1阿西维辛完全阻断了顺铂引起的肾脏毒性。具体表现是血氮和肌酸浓度降低 ,DNA加合物减少了17.1% (P <0 .0 5 )。在给顺铂前 ,给 5 0 0mg·kg- 1GSH ,肾脏毒性和顺铂 DNA加合物水平均显著性减低 (P <0 .0 5 )。另外 ,在DNA加合物和血氮之间存在着一个弱正相关关系。结论　DNA加合物在顺铂引起的肾脏毒性中引了一些作用。但是DNA加合物和血氮之间的弱相关关系提示DNA加合物与肾脏毒性只有较弱的联系 ,在顺铂引起的肾脏毒性中不是主要因素     

~（32）P后标记法检测生物样品的DNA加合物

~（３２）Ｐ后标记法检测生物样品的ＤＮＡ加合物刘淑芬，蒋湘宁，徐晓白中国科学院生态环境研究中心（北京１０００８５）用加强灵敏度的３２Ｐ后标记法检测各种样品里的ＤＮＡ加合物的过程，是将从各种样品里提取的ＤＮＡ加合物，在小球菌核酸酶，脾核酸酶的催化下酶解?..     

核酸酶P1研究进展

核酸酶P1是由桔青霉产生的一种能将单链DNA和RNA水解为5’-核苷酸的磷酸二酯酶，也是酶法生产5’-核苷酸的主要工业用酶，其水解产物5’-核苷酸广泛用于食品、医药、以及分子生物学等方面。文章概述了核酸酶P1的分子结构、催化特性、影响因素、应用和研究状况。     

二乙烯砜-谷胱甘肽系列加合物的制备及其与体外DNA加合反应活性

目的合成制备芥子气(SM)的重要氧化代谢产物二乙烯砜(DVS)的谷胱甘肽(GSH)加合物,并研究其体外与DNA的加合反应活性。方法以SM为起始原料,通过两步氧化反应制备芥子亚砜(SMO)和芥子砜(SMO_2),在碱性条件下通过"脱氯"反应合成并纯化获得DVS,进而采用制备液相色谱纯化获得了DVS-GSH单加合物及其与鸟嘌呤或腺嘌呤形成的2种DVS双加合物,并通过超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)技术研究DVS-GSH与体外DNA的加合反应活性。核磁共振谱和高分辨质谱鉴定DVS加合物表征和结构。结果在水溶液中DVS与GSH的反应活性显著高于SM,且生成的DVS-GSH单加合物也具有较强的反应活性,可与DNA的腺嘌呤和鸟嘌呤生成系列新的加合物,且与腺嘌呤加合物的丰度高于与鸟嘌呤加合物。结论 SM的氧化代谢产物DVS的二相代谢产物(DVS-GSH)与DNA体外仍具有较强的加合反应活性,其对DNA的损伤效应值得关注。     

羰基镍急性中毒大鼠血清镍变化与淋巴细胞DNA损伤及加合物形成的研究

目的观察羰基镍急性中毒大鼠血清镍变化与淋巴细胞DNA损伤及加合物形成情况,探讨羰基镍急性中毒致大鼠淋巴细胞DNA损伤的机制。方法染毒后第1、2、3和7天,测定4个染毒组(A、B、C组分别为低、中、高浓度羰基镍染毒组,D组为氯气染毒组)与正常对照组(E组)大鼠的血清镍。采用紫外吸收光谱移动法测定淋巴细胞DNA加合物,单细胞凝胶电泳观察DNA损伤。结果各染毒组血清镍在染毒后第1天最高,随时间的推移逐渐降低。各染毒组淋巴细胞DNA均在259 nm处有最高吸收峰,与E组(在260 nm处有最高吸收峰)比较位移均为+1 nm。A组淋巴细胞DNA最大吸光度在第3天降至最低点,B组在第7天降至最低点,C组和D组在第2天降至最低点,与E组比较,差异均有统计学意义(P0.05)。各染毒组淋巴细胞DNA彗星尾长和Olive尾矩均大于正常对照组(P0.05)。结论羰基镍急性染毒后第1天大鼠血清镍最高。染毒后第2天淋巴细胞DNA加合物形成最多,第3天淋巴细胞DNA损伤最重,第7天有所恢复。     

注射用盐酸吉西他滨

【通用名】盐酸吉西他滨Gemcitabine【商品名】泽菲【规格】0·2 g/瓶;1·0 g/瓶。【作用机理】吉西他滨是一种脱氧胞苷的类似物,须在体内经脱氧胞苷激酶作用,在细胞内磷酸化形成二磷酸盐和三磷酸盐两种活性产物后,才能发挥细胞毒作用,主要的药理作用是细胞毒作用、自增强作用和掩蔽链终止。能使病人轻松渡过化疗期,无症状生存期延长。细胞毒作用:①减少DNA合成和修复所需的脱氧核苷酸的量。②与脱氧核苷酸竞争结合进入DNA链。引起DNA断裂、细胞死亡。自增强作用:①本品的二磷酸盐抑制了核苷酸还原酶,减少DNA合成所需的脱氧核苷酸的量…     

脂质体-聚乙烯亚胺-DNA三元复合物的构建及其对细胞的体外转染

目的研究非病毒基因载体脂质体-聚乙烯亚胺(PEI)-DNA三元复合物(TC)的制备方法,评价其体外细胞学性质。方法采用乙醇注入法制备空白阴离子脂质体,与PEI/DNA复合物37℃孵育30 min后,得到TC,考察其理化性质、抗核酸酶降解能力、血浆稳定性、细胞毒性及在卵巢癌细胞(Hela)中的转染效率。结果制备的TC呈类球形,大小较均匀,平均粒径为234.5 nm,Zeta电位为-20.72 mV;TC能在血浆中稳定存在4 h而不发生聚集;与核酸酶作用2 h后,其中的DNA几乎无降解;其细胞毒性较低,在无血清和含血清培养基中均能成功的转染Hela细胞,在含血清培养基中其转染效率明显高于PEI/DNA复合物。结论 TC是一种制备工艺简单、血浆稳定性好、转染率较高、极具应用潜力的非病毒纳米基因载体。     

博来霉素对DNA序列的识别

博来霉素是一种糖肽抗肿瘤抗生素,这种抗生素在有Fe~(2+)的反应里通过降解DNA而起作用。它使DNA单链上产生一个缺口,通常发生于二核苷酸GPy段;GA极少被切     

细胞内游离钙在辛伐他汀诱导大鼠血管平滑肌细胞凋亡中的作用

目的　研究 3 羟 3 甲戊二酰辅酶A (HMG CoA)还原酶抑制剂辛伐他汀诱导血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡的机制。方法　以荧光染料Fura 2 /AM负载后荧光分光光度计法检测细胞内游离钙浓度 ,以DNA琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪PI/膜联蛋白 (an nexin)V染色及半胱天冬酶 3激活来检测细胞凋亡。结果　辛伐他汀 30 μmol·L- 1孵育VSMC后 ,细胞内游离钙浓度显著升高 ,6h时达对照的 3倍以上 (P <0 .0 1) ,维拉帕米 80 μmol·L- 1与辛伐他汀 30 μmol·L- 1共同孵育VSMC 6h后细胞内游离钙浓度为 (14 4± 34)nmol·L- 1(P <0 .0 1)。辛伐他汀可诱导细胞凋亡率增高、“DNA梯状”样改变及半胱天冬酶 3的激活 ,这些变化均可被维拉帕米所逆转。结论辛伐他汀通过使细胞外钙大量内流而诱导VSMC凋亡。     

CpG DNA是口服蛋白抗原的有效佐剂

新型佐剂 Cp G DNA的基本结构中含有未甲基化的双核苷酸 ,其最常见的形式是用抗核酸酶二硫代磷酸酯骨架制备的合成的寡脱氧核苷酸 ( Cp G ODN)。先前研究显示 ,含免疫刺激性基元的 Cp G ODN是肌肉 ( IM)注射或鼻内 ( IN)吸入蛋白的有效佐剂。在此作者评估了 Cp G ODN作为口服抗原佐剂的有效性。　　作者以 HBs Ag和破伤风类毒素 ( TT)为模型抗原 ,Cp G为佐剂 ,分别于 0、7、1 4天口饲 BALB/c雌鼠单纯的或加有 Cp G ODN的HBs Ag或 TT,口服的抗原量均为 1 0 0 μg,佐剂量分别为 50、1 0 0、50 0 μg。对照组则以1 0 0 μg …     

三硝基甲苯血红蛋白加合物的竞争抑制性酶联免疫吸附试验测定

建立了竞争抑制性酶联免疲吸附试验方法(CI—ELISA)以定量测定三硝基甲苯(TNT)血红蛋白加合物,该法的线性范围0.5 ng·ml~(-1)～1μg·ml~(-1),每个样品最小可测值为0.05 ng;批内变异系数8.0％左右,批间变异系数约为15.0％;正常大鼠血浆和血红蛋白溶液中外加2-氨基-4,6-二硝基甲笨(2A)或4-氨基-2,6-二硝基甲苯(4A)的回收率为84～101％,用此法首次检测TNT染毒大鼠中血红蛋白加合物,证实TNT血红蛋白加舍物水平与染毒剂量之间有明显的依赖关系,并可存留较长时间;反复染毒时,血红蛋白中2A,4A量有明显蓄积现象。     

呱仑酸钠的合成

以愈创为原料 ,用二烷·三氧化硫加合物 (D.S.试剂 )作磺化剂合成呱仑酸钠 ,总收率 71% ,产品纯度在99.5 %以上。     

同型半胱氨酸引起平滑肌细胞LDLR启动子区DNA甲基化改变的位点分析

目的探讨同型半胱氨酸(Hcy)引起平滑肌细胞低密度脂蛋白受体(LDLR)启动子区DNA甲基化改变的特点及机制。方法原代培养人脐静脉平滑肌细胞(VSMCs)并鉴定,用50、100、200、500μmol·L-1Hcy干预,巢式降落式甲基化特异性PCR(nMS-PCR)法检测LDLR甲基化改变,甲基敏感性限制性内切酶HpaII和BssHII分析LDLR DNA甲基接受能力。结果 50、100、200、500μmol·L-1Hcy组平滑肌细胞LDLR启动子区DNA去甲基化(P<0.05),经限制性内切酶HpaII消化后,LDLR启动子区C↓CGG序列被酶切,经限制性内切酶BssHII消化后,LDLR启动子区GC↓GCGC序列被酶切,与对照组比较,DNA甲基接受能力下降,其中HpaII引起的效果更明显。结论 Hcy可使平滑肌细胞LDLR启动子区DNA去甲基化的效应偏重于一般的CpG二核苷酸序列,CpG岛所受影响相对较小。     

8-甲氧补骨脂素诱导的四膜虫DNA损伤修复

用0.6 μg·ml~(-1)8-甲氧补骨脂素(8-methoxypsoralen,8-MOP)与365 nm UVA(紫外线)联合处理后,四膜虫DNA的修复反应,表现为细胞增殖反应受抑;DNA,RNA合成率在0 h受抑,(DNA为对照的5％,RNA为对照的20％),但经过一段修复后,DNA,RNA合成率均回升,在24h,DNA达70％,而RNA则几乎100％,同样条什下,用分子杂交等技术,观察到在0 h产生了分子交联(DNA双链在受热100℃时仍不能解链),经过24h培养后,有部分分子交联被去除(受热后DNA解链且被S1酶降解)。     

半边旗提取物6F抑制HL-6 0细胞蛋白激酶C活性(英文)

目的　探讨半边旗提取物 6F的细胞毒作用及诱导DNA片段化与蛋白激酶C(PKC)信号转导途径的关系 ,检测 6F对PKC活性的影响。方法　受试对象为HL 6 0细胞 ,超速离心法获得的胞液 (可溶部分 )及颗粒 (不可溶部分 ,包括细胞膜系统及胞核 )部分用作PKC活性测定。经 0 .4g·L- 1磷脂酰丝氨酸 ,0 .0 4g·L- 1甘油二油酸酯激动剂作用酶粗提物后 ,用液体闪烁计数仪计数 [γ 32 P]ATP参入外源底物的量以测定PKC活性。MTT法测定HL 6 0细胞的活力 ,二苯胺法测定 6F诱导DNA片段化程度。结果　在所测试的浓度范围内 (0 .5～ 312 μmol·L- 1) ,化合物 6F显著抑制胞液及颗粒部分PKC活性 ,最大抑制率达 88.6 % ,呈浓度依赖关系 (胞液部分r =0 .781,P <0 .0 5 ,颗粒部分r =0 .931,P <0 .0 1)。 6F诱导HL 6 0细胞DNA片段化及对细胞的毒性作用可被具有致癌作用的PKC激活剂肉豆蔻酸酯 (PMA ,浓度为 6 5nmol·L- 1)拮抗 ,抑制率分别是 30 %和 4 4% (P <0 .0 1)。PMA单独用使HL 6 0细胞线粒体将MTT还原为甲月赞的能力增强 14 % (P <0 .0 1) ,即增强细胞活力。结论化合物 6F是PKC的抑制剂。 6F对HL 6 0细胞DNA片段化的诱导作用及其细胞毒作用至少可部分归因于其对PKC活性的抑制作用     

山西地区人群DIS80基因座遗传多态性研究

可变数目串联重复序列 (variable number of tandemrepeat简称 VNTR)是新发现的一类具有高度多态性 DNA遗传标记 〔1〕。传统的分析方法是限制性片断长度多态性(restriction fragment length polym orphism ,RFL P)此法要求样本必须是大分子未降解 DNA量 >5 0 ng,需要同位素 ,且操作周期长 ,约 7d,因而使研究受到限制 ,基因扩增技术特别适合于微量 DNA,陈旧样本 ,并对 DNA降解要求不苛刻。只要有微量 DNA模板 ,借助一对与 VNTR基因座两侧序列互补的引物 ,在 Taq DNA聚合酶的作用下 ,可对重复的核心序列进行扩增 ,然后电泳检测…     

比格犬前列腺增生模型中输精管病理变化

目的　探讨前列腺增生症中输精管的增生机制。方法　丙酸睾酮 (TP)诱导比格犬前列腺增生模型建立后 ,获取输精管组织 ,利用放射免疫分析法检测输精管组织中的双氢睾酮 (DHT)含量 ,组织经石蜡固定包埋切片 ,显微图像分析技术分析输精管管腔大小及上皮细胞高度 ,流式细胞术检测输精管组织凋亡率 ,免疫组织化学技术检测输精管组织中前列腺特异抗原 (PSA)、前列腺酸性磷酸酶 (PAP)、Bcl 2及P5 3蛋白表达 ,2 %的琼脂糖凝胶电泳观察输精管组织的凋亡情况。结果　输精管组织中DHT含量随TP剂量增大而增加 ,但无统计显著性差异。输精管管腔面积随TP增加增大 (P <0 .0 1 ) ,输精管上皮细胞高度也随TP增高 (P <0 .0 1 )。流式细胞术结果中 ,对照组细胞凋亡率高于 0 .8及 7.5mg·kg-1TP组(P <0 .0 1 )。免疫组化结果中 ,PSA ,PAP和Bcl 2表达没有明显差异 ,但各组P5 3表达均低于对照组 (P <0 .0 5 )。琼脂糖凝胶电泳结果中 ,对照组中可以看到 2 0 0bp整数倍的DNA片段 ,其他组则没有观察到类似现象。结论　DHT促进输精管增生 ,这种增生与凋亡抑制有关     

三乙烯四胺对c-myc启动区转录活性的调节作用

目的探讨三乙烯四胺(TETA)如何调节c-myc基因表达。方法利用圆二色谱分析TETA对c-myc启动区核酸酶超敏元件Ⅲ1(c-mycNHEⅢ1)碱基序列形成的G-四链体DNA(G4-DNA)结构稳定性的影响。同时,分别构建含c-mycNHEⅢ1的野生型和突变型的c-myc启动区荧光报告质粒,并分别转染HEK293细胞24h后,再接种到96孔板,TETA以终浓度0,0.1,1.0,10及100μmol·L-1处理8h,测定荧光素酶活性,计算TETA对其转录活性抑制率。结果圆二色谱实验结果表明,TETA5μmol·L-1就能够进一步增强c-myc NHEⅢ1在240nm处的负峰和260nm处的正峰的形成,即增强G4-DNA结构的稳定性。报告基因分析结果表明,TETA能够浓度依赖性地抑制野生型c-myc启动区荧光素酶基因的表达,但对突变型c-myc启动区荧光素酶基因的抑制能力明显下降。在TETA1nmol·L-1作用时,对突变型c-myc启动区荧光素酶基因抑制率仅为4.3%,而对野生型的抑制率还高达30.4%。结论TETA可能通过稳定c-mycNHEⅢ1序列形成的G4-DNA结构调节基因的表达。