shRNA沉默c-myc基因对MG-63骨肉瘤细胞c-myc/PD-L1轴的影响

目的 探讨c-myc与程序性死亡受体1(PD-1)/细胞程序性死亡-配体1(PD-L1)基因在骨肉瘤细胞中的作用机制。方法 构建c-myc基因的shRNA表达载体并转染到c-myc/PD-L1高表达的MG-63骨肉瘤细胞中,采用Real-time PCR及Western blot法检测不同组细胞c-myc、PD-1、PD-L1 mRNA和蛋白的表达。结果 沉默c-myc基因后MG-63骨肉瘤细胞中的PD-1蛋白表达量显著下降,c-myc、PD-L1 mRNA和蛋白的表达量均呈现下降的趋势,与阴性对照组和空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论 沉默c-myc基因能够有效阻断PD-1/PD-L1信号通路。     

扁平苔癣皮损区c-myc PCNA VEGF的表达研究

目的探讨原癌基因c-myc、增殖细胞核抗原(PCNA)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)在扁平苔癣发病中的作用。方法采用免疫组织化学方法,检测了60例扁平苔癣皮损区及60名健康志愿者的表皮中c-myc、PCNA、VEGF的表达及分布特点。结果扁平苔癣皮损区c-myc、PCNA、VEGF表达均较正常表皮中的表达明显增强,分布于除角质层以外的表皮各层,而正常表皮表达阴性或仅在基底层有弱阳性表达。结论c-myc、PCNA在扁平苔癣皮损中过度表达,提示其与扁平苔癣的表皮细胞过度增殖、分化异常有关;VEGF过度表达,提示VEGF与扁平苔癣的真皮浅层淋巴细胞浸润有关。     

可溶性支架转染c-myc基因反义寡核苷酸对静脉桥c-myc基因mRNA表达的影响

目的选择c-myc为靶基因,在兔颈总动脉颈外静脉移植模型中采用可溶性支架将反义c-myc寡核苷酸转染静脉桥,旨在从核酸mRNA水平明确c-myc基因在静脉桥再狭窄机制中的作用。方法新西兰大耳白兔随机分成5组,每组10只动物。①空白对照组;②单纯可溶性支架组;③正义寡核苷酸可溶性支架组;④反义寡核苷酸可溶性支架组;⑤不匹配寡核苷酸可溶性支架组。建立兔颈外静脉颈总动脉旁路移植术模型,合成c-myc寡核苷酸,处理可溶性支架,依组别不同,在静脉移植时静脉桥管腔内分别置入:①空白对照;②单纯可溶性支架;③反义寡核苷酸可溶性支架;④正义寡核苷酸可溶性支架;⑤不匹配寡核苷酸可溶性支架;于颈外静脉移植后7天、28天和90天取出静脉桥。采用原位杂交及NorthernBlot,半定量及定量地检测各组静脉桥中c-myc基因mRNA表达水平。结果原位杂交:同时间段反义寡核苷酸组细胞胞浆与胞核内c-myc基因mRNA的表达明显降低,其他各组静脉桥c-myc基因mRNA强烈表达,斑点杂交及Northern杂交印迹扫描数值显示7天、28天、90天空白对照组、空白支架组、正义组、错配组RNA的表达显著强于同时间点的反义寡核苷酸组RNA表达水平,而同时间点除外反义寡核苷酸可溶性支架组的其他各组之间无差异。结论可溶性支架转染c-myc基因反义寡核苷酸可显著抑制移植物内c-myc基因的表达。     

雌激素对载脂蛋白AⅠ基因启动子不同区域转录活性的影响

目的:探讨雌激素对载脂蛋白(Apo)AⅠ基因启动子不同区域转录调节活性的影响。方法:利用含荧光素酶报告基因的表达载体pGL2构建携带ApoAⅠ基因启动子不同区域片段的重组质粒和同时携带ApoCⅢ/AⅣ基因片段的重组质粒。阳离子脂质体法将重组质粒与pRL-null内参质粒共转染HepG2细胞,加入10μmol/L雌激素刺激24h检测细胞荧光素酶报告基因的荧光强度,以反映ApoAⅠ的转录水平。结果:pGL2/-256AⅠ,pGL2/-2500AⅠ,pGL2/-256AⅠCⅢAⅣ及pGL2/-2500AⅠCⅢAⅣ转染后雌激素组荧光素酶相对活性明显高于对照组(P<0.05);而pGL2/-41AⅠ及pGL2/-41AⅠCⅢAⅣ质粒转染后雌激素组与对照组荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)。结论:ApoAⅠ启动子-256~-41区域可能包含与雌激素作用相关的反应元件,受雌激素刺激后转录活性增强。     

大鼠脑缺血再灌注损伤后c-myc蛋白和mRNA表达及细胞凋亡的研究

目的　研究大鼠局灶性脑缺血再灌注后即早基因c- myc蛋白和c-mycmRNA表达及细胞凋亡的变化。方法　采用线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。应用免疫组织化学法、原位杂交法检测c -myc蛋白和mRNA表达 ,利用原位杂交法和转移酶介导dUTP缺口末端标记法 (TUNEL)研究凋亡细胞的变化。结果　脑缺血再灌注后c -myc蛋白和c- mycmRNA表达较正常对照组及假手术组表达明显增强 ;凋亡细胞显著增多(P <0 . 0 1)。结论　局灶性脑缺血再灌注能够引起c- myc蛋白和mRNA表达增加 ,从而参与脑缺血再灌注损伤的发病机制 ,引发神经细胞凋亡。     

apoAⅠ启动子-93 bp～-63 bp片段及-75 bp位点突变对基因转录调控作用的研究

目的：研究载脂蛋白A Ⅰ（apoA Ⅰ）启动子区域-93 bp～-63 bp对基因转录活性的影响,探讨-75 bp位点G→A置换在基因转录中的作用.方法：在人类基因组数据库中截取并下载apoAⅠ基因启动子序列,对照基因图谱人工合成apoAⅠ启动子区域-93 bp～-63 bp片段,-75 bp位点分别为突变型（A）或野生型（G）,进行生物素标记.培养HepG2细胞,提取核蛋白混合物.将核蛋白与标记好的两条DNA链结合,进行电泳迁移率（EMSA）实验,观察两者结合情况.结果：apoAⅠ启动子-93 bp～-63 bp区域可与某种特异性核蛋白转录因子结合.-75 bp位点为G等位基因的探针与含A的探针相比,核蛋白的结合明显增多.同时,竞争抑制实验表明,含G的探针与核蛋白的亲和力高于含A的探针.结论：apoAⅠ基因启动子-93 bp～-63 bp区域通过与核蛋白转录因子的结合参与基因调控,-75 bp位点G→A置换降低与转录因子的亲和力,降低apoAⅠ转录活性从而影响基因表达.     

-514bp及-250bp位点基因多态性对肝脂酶转录活性的影响

目的:探讨同时含肝脂酶(HL)启动子-514 bp和-250 bp多态位点的野生型及变异纯合子型的荧光素酶表达质粒对HL转录活性的影响.方法:PCR法扩增含不同目的基因的DNA片段,将目的基因插入到pUCm-T质粒中,获取含SacⅠ及BglⅡ酶切位点的目的基因,将该基因与含荧光素报告基因的pGL2质粒相连,构建pGL2-HL/-514T+ -250A变异纯合型以及pGL2-HL/-514C+ -250G野生型荧光素酶表达质粒,转染至HepG2细胞内表达,双荧光素酶检测系统检测不同重组质粒荧光素酶报告基因的活性.结果:(1)实验成功构建了同时含HL启动子部位-514/-250位点的野生型和变异纯合型的荧光素酶表达质粒.(2) pGL2-HL/-514T+ -250A变异纯合型的荧光素酶相对表达活性明显低于野生型荧光素酶表达活性(P＜0.01).结论:HL启动子-514及-250位置基因的联合变异可直接影响HL的转录活性.     

乙型肝炎病毒C基因启动子区及前C区突变与乙型肝炎病情的关系

目的分析乙型肝炎病毒(HBV)C基因启动子(BCP)双突变及前C区nt1896位点突变与乙型肝炎临床表现及e抗原(HBeAg)表型的关系。方法采用巢式聚合酶链反应(PCR)扩增nt1660~1935的HBVDNA片段及PCR产物直接测序的方法检测BCP区及前C区基因的变异情况。结果130例经证实为HBVDNA阳性的急慢性肝炎患者中共有75例BCP区nt1762、nt1764双突变,HBeAg阳性组BCP突变者32例(58.2%),而HBeAg阴性组43例(57.3%)。检出前C区nt1896突变者20例,其中慢性肝炎10例(12.8%)、重型肝炎2例(25.0%)、肝硬化8例(22.2%);nt1896突变者在HBeAg阳性组3例(5.5%),HBeAg阴性组17例(22.7%),两组比较差异有统计学意义。nt1896突变组丙氨酸转氨酶(ALT)及HBV DNA水平较无突变组差异均有统计学意义。结论BCP双突变及前C nt1896均与肝炎的慢性化、重型化及肝硬化的发生密切相关,前者对HBeAg的表达及HBV-DNA水平并无明显影响;后者影响HBeAg的表达,并且增强病毒复制水平。     

人多巴胺D2受体基因内含子区51103T/C多态性对基因转录活性的影响

目的探讨人多巴胺D2受体（DRD2）基因第3内含子区51103 bp位点单核苷酸多态性（rs2075652）对DRD2基因转录活性的影响,进一步揭示DRD2基因第3内含子区的单核苷酸多态性影响创伤后应激障碍发病风险的分子机制。方法以人全血基因组DNA为模板,扩增DRD2基因第3内含子区序列（399 bp）,51103 bp处分别为T或C,与报告基因载体pmir Glo相连接,构建重组荧光素酶表达载体,经限制性内切酶酶切及测序得以鉴定,然后分别与pRL-CMV共转染人胚肾癌细胞株HEK293,检测细胞中荧光素酶的相对表达量。结果双酶切及测序结果证实成功构建重组质粒pmir Glo-T/pmir Glo-C,荧光素酶检测结果显示,当第3内含子区51103 bp位点为C时荧光素酶活性显著高于为T时（P〈0.01）。结论成功构建了pmir Glo-T/pmir Glo-C报告基因重组质粒,DRD2基因第3内含子区rs2075652位点由T突变为C后,可能增强基因转录活性,该结果为进一步研究DRD2基因内含子区的功能奠定了基础。     

人多巴胺D2受体基因内含子区51103 T/C多态性对基因转录活性的影响

目的：探讨人多巴胺D2受体(DRD2)基因第3内含子区51103 bp位点单核苷酸多态性(rs2075652)对DRD2基因转录活性的影响,进一步揭示DRD2基因第3内含子区的单核苷酸多态性影响创伤后应激障碍发病风险的分子机制。方法以人全血基因组DNA为模板,扩增DRD2基因第3内含子区序列(399 bp),51103 bp处分别为T或C,与报告基因载体pmirGlo相连接,构建重组荧光素酶表达载体,经限制性内切酶酶切及测序得以鉴定,然后分别与pRL-CMV共转染人胚肾癌细胞株HEK293,检测细胞中荧光素酶的相对表达量。结果双酶切及测序结果证实成功构建重组质粒pmirGlo-T/pmirGlo-C,荧光素酶检测结果显示,当第3内含子区51103 bp位点为C时荧光素酶活性显著高于为T时(P<0．01)。结论成功构建了pmirGlo-T/pmirGlo-C报告基因重组质粒,DRD2基因第3内含子区rs2075652位点由T突变为C后,可能增强基因转录活性,该结果为进一步研究DRD2基因内含子区的功能奠定了基础。     

甲状旁腺激素、1，25（OH）2D3对鼠心肌细胞c—myc基因表达的影响

目的　研究不同浓度水平的甲状旁腺激素 (PTH)和 1,2 5 (OH) 2 D3 对新生大鼠心肌细胞c mycmRNA表达的影响。 方法　采用新生大鼠心肌细胞原代培养和逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)技术 ,比较正常对照组、不同浓度PTH组和 1,2 5 (OH) 2 D3 组心肌细胞c mycmRNA表达程度。结果　 (1)高浓度PTH组 (10 -8M )心肌细胞c mycmRNA表达较正常对照组和低浓度PTH组(10 -10 M)明显增高 (分别为 1 84± 0 38、0 11± 0 16和 0 10± 0 14,P <0 0 1) ,而后两组之间没有差异 (P >0 0 5 ) ;(2 )两种浓度 1,2 5 (OH) 2 D3 组心肌细胞均未见c mycmRNA表达。 结论　高浓度PTH明显刺激心肌细胞c mycmRNA表达 ,1,2 5 (OH) 2 D3 能抑制c mycmRNA表达     

人甲胎蛋白启动子控制HIV-1 Vpr表达的重组腺病毒体内抑瘤效果研究

目的：研究人甲胎蛋白启动子控制表达HIV Vpr基因的重组腺病毒对裸鼠肝癌模型的肿瘤组织生长抑制作用,探讨其应用于肝癌基因治疗的可行性。方法：将人甲胎蛋白启动子控制表达HIV Vpr基因的重组腺病毒（rvAdAFP-Vpr）直接注射到利用BEL-7402细胞建立的肝癌裸鼠模型瘤体内,同时往裸鼠腹腔内注射环磷酰胺（CTX）,经过1个月的治疗,利用肿瘤生长曲线、增殖指数、凋亡指数等指标,观察rvAdAFP-Vpr对肝癌组织生长抑制的效果。结果：人甲胎蛋白启动子控制表达HIV Vpr基因的重组腺病毒在肝癌组织中表达了Vpr蛋白,rvAdAFP-Vpr注射明显诱导肿瘤细胞凋亡,抑制了体内肝癌组织的生长,rvAdAFP-Vpr治疗组和rvAdAFP-Vpr＋CTX治疗组抑瘤率分别达到41％和66．7％,与空白对照组和rvAd-null组相比,具有统计学意义,差异显著（P〈0．05,P〈0．01）,两组的Ki-67指数和凋亡指数相比,对照组和空腺病毒载体（rvAd-null）组同样具有统计学意义,差异显著（P〈0．05,P〈0．01）。结论：人甲胎蛋白启动子控制表达HIV Vpr基因的重组腺病毒rvAdAFP-Vpr通过引起肝癌细胞凋亡,有效抑制了体内肝癌组织的生长。本研究结果为HIV-1 Vpr应用于肝癌治疗提供了依据。     

Characterization of Tilapia (Oreochromis niloticus) aldehyde reductase (AKR1A1) gene,promoter and expression pattern in benzo-a-pyrene exposed fish

This study planned to isolation and characterization of AKR1A1 cDNA from Bap injected nile tilapia (Oreochromis niloticus), comparison of its characteristic structures with those of other species, characterization of AKR1A1 gene and promoter, and investigation of AKR1A1 mRNA expression in various organs of Bap injected tilapia. The cDNA was 1172?bp long which includes an open reading frame of 975?bp encoding a 324 amino acids protein and a stop codon. The sequence showed 3' and 5' non-coding regions of 179 and 18?bp. The amino acid sequence of O. niloticus AKR1A1 shows similarities of 60, 60, 60.6, 61.2 62.2, and 57.8% with mouse AKR1A1, Norway rat AKR1A1, zebrafish AKR1A1, African clawed frog AKR1A1, human, and yellow perch AKR1A1, respectively. Nucleotide sequence investigation of AKR1A1 gene and 5′-flanking region showed that the structural gene and the 5′-flanking region were approximately 2975?bp and 4006?bp in length, respectively. The protein-coding region contained eight exons, and one additional upstream exon. Real-time polymerase chain reaction (PCR) results showed that the highest level of AKR1A1 expression was found in bile (108.7), followed by kidney (77.9), muscles (37.3), and liver (24.7). mRNA levels of AKR1A1 were almost negligible in gills (0.6) while no detectable (ND) constitutive expression was detected in gut. In conclusion, our results concluded that tilapia AKR1A1 is inducible by BaP and have a significant function in the metabolism of xenobiotics and, therefore, may used as biomarker in fish     

Inhibitory effect of imipramine on the human corticotropin-releasing-hormone gene promoter activity operates through a PI3-K/AKT mediated pathway

Antidepressant drugs inhibit the corticotropin-releasing-hormone (CRH) gene promoter activity in the differentiated Neuro-2A cells, but a molecular mechanism of their action has been poorly recognized. The aim of the present study was to elucidate the involvement of some intracellular signal transduction pathways in imipramine-induced inhibition of CRH gene activity in the differentiated Neuro-2A cells, stably transfected with a human CRH promoter fragment linked to the chloramphenicol acetyltransferase (CAT) reporter gene. It was found that wortmannin (0.1muM), an inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-K) and forskolin (10, 25muM), an activator of adenylate cyclase enhanced the basal activity of CRH gene promoter, whereas inhibitors of protein kinase A, calcium/calmodulin kinase (CaMK) and mitogen-activated protein kinase (MAPK) had opposite effects. Moreover, wortmannin at a low concentration (0.01muM) significantly reversed the inhibitory effect of imipramine on CRH-CAT activity, whereas other protein kinase inhibitors were inactive or even enhanced the imipramine effects. The involvement of PI3-K/Akt pathway in the imipramine action was confirmed by Western blot study, which showed that this drug increased phospho-Ser-473 Akt level, but had no effect on total Akt and glycogen synthase kinase (GSK-3beta) levels. These results indicate that the inhibitory effect of imipramine on the CRH gene promoter activity in Neuro-2A cells is mainly connected with enhancement of PI-3K/Akt pathway.     

受SnpR激活的snpA启动子调控的柔红霉素C-14羟化酶基因的克隆、表达和应用研究

尝试将柔红霉素经微生物转化法合成多柔比星。从Streptomyces sp．C5中通过PCR的方法扩增了含核糖体结合位点、大小为1.3kb的编码C-14柔红霉素羟化酶的doxA基因及受SnpR调控的snpA启动子。最终构建的重组质粒pYG908，能表达一大小为46.6ku的蛋白条带，CO结合差光谱分析表明所表达的酶在450nm有吸收峰。重组质粒转化Streptomyces lividans TK24后，工程菌能转化柔红霉素生成和多柔比星保留时间一样的产物。     

载脂蛋白E启动子-427T/C基因多态性对阿托伐他汀钙调脂效应及长期临床预后的影响

目的分析中国天津地区汉族冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)患者载脂蛋白E(ApoE)启动子-427T/C基因多态性对阿托伐他汀钙调脂疗效以及患者长期预后的影响。方法292例CHD患者均给予阿托伐他汀钙每次20 mg,qn,睡前口服,连续治疗6个月。用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法检测ApoE-427T/C多态性。用酶法测定总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。随访2年并记录所有患者主要不良心血管事件(MACE)。结果治疗6个月后,ApoE-427T/C TT型、TC型和CC型的TC分别为(4.10±0.79),(3.68±0.68)和(3.19±0.71)mmol·L^-1,LDL-C分别为(2.42±0.59),(1.97±0.50)和(1.47±0.54)mmol·L^-1。TC、CC基因型的TC和LDL-C水平与TT基因型比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。随访期间,发生MACE事件21例(7.19%),其中再次血运重建11例(3.77%)、非致死性心肌梗死7例(2.40%)、卒中2例(0.68%)和死亡1例(0.34%)。TT型、TC型和CC型无MACE生存率分别为94.69%,88.89%和84.62%,两两比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论ApoE-427T/C TC和CC基因型有更好的他汀类调脂效果,其能更显著地降低LDL-C和TC水平,但3种基因型的长期临床预后无显著差异。     

蒜氨酸+蒜酶抗肿瘤及其机制的研究

大蒜制剂、大蒜提取物和大蒜提取成分的抗肿瘤作用已有广泛的研究[1 ] 。蒜氨酸 (Alliin ,2 烯丙基半胱氨酸亚砜 )为大蒜活性成分的主要前体物质 ,蒜氨酸在蒜氨酸酶 (Alli inase ,EC 4 .4.1 .4)的催化作用下产生大蒜辣素 (Allicin ,二烯丙基硫代亚磺酸酯 )。本课题组发现蒜氨酸 +蒜氨酸酶生成的大蒜辣素 1 3h内基本稳定。据此 ,本文采用MGC 80 3和HeLa肿瘤细胞株 ,利用蒜氨酸 +蒜氨酸酶生成的大蒜辣素研究其体外的抗肿瘤作用及其作用机制。1　材料和方法1 .1　细胞培养及药物　细胞培养的传代接种见文献[2 ] 。蒜氨酸及蒜氨酸酶由新疆…     

氨茶碱对支气管哮喘气道重塑大鼠支气管肺组织内皮素-1和一氧化氮含量的影响

目的观察氨茶碱对支气管哮喘气道重塑大鼠气道形态学及肺组织中内皮素-1（ET-1）、一氧化氮（NO）、11型胶原含量的影响。方法24只SD大鼠随机分为正常组、模型组、治疗组,每组8只,除正常组外以卵蛋白致敏并吸入激发法制备大鼠哮喘模型,治疗组、模型组从第1次哮喘激发开始（造模第15天）分别给予氨茶碱35mg·kg^-1·次^-1·d^-1、0．9％氯化钠溶液2ml·次^-1·d^-1灌胃给药,用药4周后处死大鼠,取肺组织HE染色,病理图象分析仪测量支气管壁面积、支气管平滑肌面积,采用放射免疫法测定肺组织ET-1、Ⅲ型胶原含量,采用硝酸还原酶法测定肺组织NO含量。结果与正常组比较,模型组大鼠支气管壁面积、平滑肌面积明显增加（P〈0．01）,肺组织中ET-1、NO、II型胶原含量均明显增加（P〈0．01）;与模型组比较,治疗组大鼠支气管壁面积、平滑肌面积较模型组显著降低（P〈0．01）,肺组织中ET-1、NO、11型胶原含量均显著降低（P〈0．05或〈0．01）结论氨茶碱可通过降低肺组织中ET—1、NO、Ⅲ型胶原含量,抑制哮喘大鼠气道壁、平滑肌增厚,从而抑制支气管哮喘大鼠气道重塑。