腺病毒介导的mPPARγ1基因转染抑制IFN-γ诱导ECV304细胞galectin-9基因和蛋白表达

目的：观察腺病毒介导的mPPARγ1转染抑制IFN-γ诱导ECV304细胞galectin-9基因和蛋白表达。方法：构建表达小鼠PPARγ1基因的复制缺陷型腺病毒表达载体；将融合80%的ECV304细胞给予不同刺激量（1×104 U/L、5×104 U/L、1×105 U/L和2×105 U/L）的IFN-γ干预；将IFN-γ（1×105 U/L）预刺激并孵育 24 h 的ECV304细胞分成对照组（C）、PPARγ基因过度表达组(P)、PPARγ活化剂曲格列酮干预组(T)以及PPARγ基因过度表达和曲格列酮共刺激组(PT)进行干预，观察不同剂量IFN-γ对ECV304细胞galectin-9基因和蛋白表达的作用，以及PPARγ基因过度表达和/或活化对上述作用的影响。结果：正常ECV304细胞galectin-9基因表达弱。IFNγ孵育24 h后， ECV304细胞galectin-9基因和蛋白表达增加，且galectin-9表达与IFN-γ具有量效关系。PPARγ1基因转染抑制IFN-γ诱导galectin-9基因/蛋白表达，曲格列酮对上述作用无影响；PPARγ1基因转染和曲格列酮共刺激抑制IFN-γ诱导galectin-9基因/蛋白表达与单一PPARγ1基因转染效应相似。正常ECV304细胞PPARγ表达量低，而PPARγ基因过表达和活化不影响内源性PPARγ基因表达。结论：PPARγ1基因转染抑制IFN-γ诱导ECV304细胞galectin-9基因/蛋白表达可能是PPARγ基因发挥免疫调控作用的一个重要机制。     

α-硫辛酸对氧化低密度脂蛋白致内皮细胞损伤的保护作用

目的:探讨α-硫辛酸(LA)对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)致内皮细胞损伤的保护作用。方法:内皮细胞ECV304随机分为:空白对照组(ECV304)、LA对照组(ECV304+LA)、ox-LDL组(ECV304+ox-LDL)、LA处理组(ECV304+ox-LDL+LA),以0.1g/L浓度的ox-LDL刺激细胞,并加入0.5g/L的LA,孵育24h后,收集培养液,测定乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)含量。结果:LA处理组较ox-LDL组LDH和MDA含量明显降低,两者差异有显著性(P<0.05)。结论:LA对ox-LDL导致的内皮细胞损伤有保护作用。     

Toll样受体4和巨噬细胞移动抑制因子对血管内皮细胞生物活性的影响

目的:探讨Toll样受体4(TLR4)和巨噬细胞移动抑制因子(MIF)对ECV304内皮细胞增殖、黏附及炎症因子水平的影响。方法:ECV304细胞经TLR4 MIF单克隆抗体(mAb)和脂多糖(LPS)处理后,通过3H-TdR掺入实验、黏附实验和放射免疫分析研究细胞增殖、黏附和细胞因子水平。结果:LPS(10 mg/L)明显促进ECV304细胞TLR4的表达,而抗MIF mAb(10、50 mg/L)明显抑制其表达。抗MIF(50 mg/L)和抗TLR4mAb(1 mg/L)明显抑制了ECV304细胞的增殖,而LPS(10 mg/L)明显促进增殖。抗MIF mAb明显抑制了人外周血淋巴细胞对ECV304细胞的黏附,而LPS和抗TLR4 mAb对黏附无显著影响。抗MIF、抗TLR4 mAb明显抑制ECV304细胞TNFα的分泌,并呈剂量依赖,而LPS作用相反。与对照组相比,LPS(1 mg/L,48 h)可以促进ECV304细胞IL-8的分泌,抗MIF mAb(50 mg/L,48 h)可以明显抑制IL-8的分泌(P0.05)。但是抗TLR4 mAb(1 mg/L)对ECV304细胞IL-8的分泌无明显影响。结论:LPS、抗TLR4及抗MIF mAb对血管内皮细胞TLR4表达及活性有显著影响。     

活性氧对ECV304细胞生长和凋亡的相关基因表达谱研究

目的： 探讨活性氧（ROS）对ECV304细胞生长和凋亡作用的相关基因表达谱。 方法： 采用MTT法分别观察不同浓度AngⅡ在4 h、12 h和24 h时对ECV304细胞生长率和ROS生成量的影响。应用基因芯片技术和光镜分别检测0.0625和1 μmol/L AngⅡ作用12 h时ECV304细胞生长作用的相关基因表达谱和细胞形态学变化。 结果： 一定浓度的AngⅡ作用12 h时ECV304细胞生长率明显增加（P<0.05）；基因芯片技术分析显示，在0.0625 μmol/L AngⅡ作用ECV304细胞12 h时，与细胞生长相关的ERK、CDK、CCN、PCNA等25个基因普遍上调，而与细胞凋亡相关的DR6、caspase-6、BAK1、PDCD8等12个基因普遍下调，在1 μmol/L AngⅡ作用12 h时，呈相反结果。 结论： AngⅡ是ECV304细胞产生ROS(·OH)的诱导剂，可引起多种与ECV304细胞生长和凋亡的靶基因表达；N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）可以明显抑制AngⅡ对ECV304细胞的生长作用；ROS(·OH)可能是AngⅡ诱导ECV304细胞生长和凋亡的主要信号转导分子和基因表达调节分子。     

反式脂肪酸对ECV304细胞HNP-1mRNA表达和氧自由基的作用

目的:探讨反式脂肪酸(TFAs)对ECV304细胞氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)的作用及其机制。方法:按常规方法传代培养ECV304细胞,用实时荧光定量PCR检测不同浓度TEAs刺激(TFA处理组)后ECV304细胞中HNP-1的表达;采用流式细胞仪检测ECV304细胞中氧自由基(ROS)的生成;用脂质氧化产物丙二醛(MDA)生成量描述ECV304细胞LDL氧化能力的变化。并与未行TFAs处理的ECV304细胞对照组比较其组间差异。结果:与对照组比较,TFAS处理组HNP-1mRNA表达水平显著升高(0.220±0.030vs 0.429±0.090,P0.05);与对照组比较,1mmol/L TFAS刺激ECV304细胞12h其ROS水平显著升高(11.30±1.67vs 66.70±6.53,P0.05),在加入不同钙离子拮抗剂后ROS水平明显下降(P0.05);与LDL处理组比较,1mmol/L TFAS+LDL处理组MDA水平也显著升高(0.134±0.027vs 0.155±0.025,P0.05)。结论:反式脂肪酸能促进HNP-1的表达,提高钙离子依赖的自由基水平,从而提高ECV304细胞氧化LDL的能力。     

氧化高密度脂蛋白通过MAPKs信号转导途径诱导ECV304细胞表达组织因子

目的： 探讨氧化高密度脂蛋白(oxHDL)对人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞表达组织因子(TF)的影响及其机制。方法：实验分为阴性对照组、阳性对照组（加组胺）、HDL、oxHDL 4组, ECV304细胞经不同浓度oxHDL、HDL（10-120 mg/L）和组胺(1×10-9-1×10-4 mol/L)处理不同时间(2-8 h)后,采用实时定量PCR (RQ-PCR)和Western bloting方法检测TF表达。同时,分别应用SP600125［c-Jun氨基端激酶(JNK) 特异性抑制剂］、SB203580［p38丝裂素活化蛋白激酶(p38MAPK) 特异性抑制剂］、 PD98059［细胞外信号调节激酶(ERK1/2) 特异性抑制剂］,观察其对oxHDL和组胺诱导的ECV304细胞表达TF的影响。 结果：正常ECV304细胞未检测到TF,经组胺处理1 h后TF mRNA表达明显增加,在1×10-5 mol/L时最高,约为1×10-9 mol/L时的4.8倍。oxHDL以时间和浓度依赖性方式诱导ECV304细胞TF mRNA表达,在oxHDL 20 mg/L时最高,为10 mg/L时的1.8倍,在第6 h时TF mRNA表达水平为第2 h的5.3倍（P<0.05）,并在20 mg/L时显著刺激ECV304细胞TF蛋白表达,为40 mg/L时的1.5倍,而HDL没有此效应。 MAPKs（JNK、p38 MAPK、ERK1/2）抑制剂可部分解除oxHDL诱导ECV304细胞TF表达的效应,TF分别下调表达至原来的19.0%、5.0%和13.0%（P<0.05)。结论：oxHDL能以浓度和时间依赖性方式诱导ECV304细胞产生TF,其机制可能通过JNK、p38 MAPK和ERK1/2所介导。     

妊高征孕妇血清瘦素浓度和新生儿体重的关系

探讨妊娠高血压综合征(妊高征)患者和正常孕妇血清中的瘦素浓度与胎儿体重的关系.用RIA检测158名孕妇血清瘦素水平,并对其结果进行t检验.结果显示:妊高征组血清瘦素水平( 30.7±9.6ng/mL)明显高于正常孕妇组(17.3±6.2ng/mL, P＜0.01).妊高征重度组血清瘦素水平(39.7±9.2 ng/mL)明显高于妊高征轻度组(23.9±7.1 ng/mL,P＜0.01)和妊高征中度组(31.2±6.5 ng/mL,P＜0.05);妊高征患者组的新生儿体重(3012±338g)明显低于正常孕妇组(3479±557g, P＜0.01).妊高征重度组的新生儿体重(2454±299gL)明显低于妊高征轻度组(3412±321g,P＜0.01)和妊高征中度组(2998±316g,P＜0.01).检测孕妇血清中的瘦素水平,对于评估胎儿的发育和体重具有重要意义,对妊高征的治疗和预后也有指导价值.     

钠泵抑制剂哇巴因对ECV304细胞连接相关分子表达的影响

目的:探讨钠泵抑制剂哇巴因对细胞连接相关分子表达的影响.方法:以不同浓度哇巴因作用ECV304细胞,用倒置相差显微镜和透射电镜观察细胞形态变化;通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞生长抑制作用;用Hoechst33342/PI双荧光染色、荧光显微镜分析细胞死亡特征;应用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞连接相关分子钠泵β1亚单位、内皮钙黏蛋白、 P120连环蛋白1A和P120连环蛋白3A mRNA的表达.结果:哇巴因以浓度和作用时间依赖的方式抑制ECV304细胞生长;10 μmol/L哇巴因作用24 h,引起细胞坏死;0.1 μmol/L哇巴因作用24～48 h,细胞明显脱落,细胞间连接丧失,细胞出现染色质凝集、边移、凋亡小体形成等凋亡特征.RT-PCR结果显示钠泵β1亚单位、内皮钙黏蛋白和P120连环蛋白1A表达下降,P120连环蛋白3A表达上调.结论:哇巴因调节ECV304细胞连接相关分子表达从而影响其黏附和存活.     

妊高征患者血清瘦素水平的初步研究

目的　探讨妊娠高血压综合征 (妊高征 )血清瘦素水平及其与血压间的关系。方法　采用放射免疫法 ,测定 32例妊高征患者 (妊高征组 )及 30例正常妊娠妇女 (对照组 )血清瘦素水平 ,分析瘦素与收缩压 (SBP)、舒张压 (DBP)的相关性。结果　⑴妊高征组血清瘦素水平为 (16 .5 1± 4 .4 7)ng/mL ,高于正常妊娠组的 (14 .14± 3.79)ng/mL ,差异具有显著性 (P <0 .0 5 ) ;(2 )产后妊高征组瘦素水平为 (8.6 2± 2 .2 3)ng/mL ,较产前明显降低 (P <0 .0 1) ,与对照组产后瘦素水平 (7.97± 2 .2 2 )ng/mL相比 ,差异无显著 (P >0 .0 5 ) ;(3)正常妊娠组与妊高征组产前血清瘦素水平与SBP、DBP的相关系数分别为 (0 .2 5 8,0 .0 74 )及 (0 .0 91,0 .0 6 5 ) ,均无显著相关 (P >0 .0 5 )。结论　妊高征患者血清瘦素水平升高 ,它与血压不相关 ,妊高征血压升高与血清瘦素水平间无明确的因果关系。     

海洋放线菌素X2对CVB3感染ECV304细胞VCAM-1表达的影响

目的研究柯萨奇病毒(Coxsackievirus,CVB3)感染ECV304细胞后,血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesionmolecule,VCAM-1)的表达变化及海洋放线菌素X2对CVB3感染ECV304细胞VCAM-1表达的影响。方法采用MTT法检测不同浓度的海洋放线菌素X2作用病毒后的抑制情况;采用RT-PCR和FCM分别测定CVB3感染的ECV304细胞在海洋放线菌素X2作用前后不同时间点的VCAM-1的mRNA和蛋白的表达水平。结果海洋放线菌素X2在病毒吸附前对CVB3的SI为63.88。正常状态下ECV304细胞基本无VCAM-1 mRNA表达,CVB3感染ECV304细胞促进VCAM-1 mRNA表达,感染12 h达到最高峰,6～54 h时VCAM-1 mRNA水平,与细胞对照组相比CVB3感染组差异有统计学意义(P<0.05)。CVB3感染ECV304细胞后,VCAM-1蛋白表达在12～48 h显著高于正常ECV304细胞对照组(P<0.05)。海洋放线菌素X2干预后,于12～54 h降低ECV304细胞VCAM-1 mRNA的水平,12～24 h降低VCAM-1蛋白的表达,与CVB3感染组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论海洋放线菌素X2在病毒吸附前对CVB3具有抗病毒作用,并可下调CVB3诱导的ECV304细胞VCAM-1的mRNA水平和蛋白的表达。     

腺病毒介导CTLA4Ig和Iκ-Bα双基因在ECV304细胞中的表达

目的: 通过制备细胞毒性T淋巴细胞相关抗原 4融合蛋白(CTLA4Ig)和核因子的抑制蛋白 (Iκ- Bα)双基因共表达腺病毒载体, 检测重组腺病毒在ECV304细胞中的表达。方法: 将Iκ- Bα和CTLA4Ig通过内部核糖体进入部位(IRES2 )连接, 并以基因重组的形式插入腺病毒表达载体, 构建重组腺病毒, 检测Iκ- Bα和CTLA4Ig在ECV304细胞中的蛋白表达情况及其对炎症介质TNF的调控效应。结果: ( 1 )构建pAdTrack -CMV- CTLA4Ig IRES2- Iκ-Bα, 与pAdEasy在BJ5183重组后转染 293, 获得重组腺病毒。(2)PCR鉴定重组腺病毒正确。(3)用重组腺病毒感染体外培养的ECV304后,该腺病毒可表达Iκ- Bα蛋白及CTLA4Ig蛋白, 且可以下调LPS攻击后TNF α的产生。结论: 构建人CTLA4Ig, Iκ- Bα双基因共表达腺病毒载体, 可以有效的抑制炎症因子的表达,为进一步的CTLA4Ig免疫耐受基因治疗中的抑制, 因NF- κB的过度激活而产生的炎性反应提供研究基础。     

脱氢表雄酮对抗LDL和OX-LDL所致ECV304细胞的损伤

目的：观察脱氢表雄酮（DHEA）对抗LDL及OX-LDL所致ECV304细胞的损伤作用，探讨DHEA可能的抗AS作用机制。 方法: 采用培养的ECV304细胞, 应用硝酸还原酶、放免及SABC免疫组化等方法观察经DHEA预处理及与LDL或OX-LDL混合作用后的细胞培养液中NO2-/NO3-、ET-1水平及细胞表面ICAM-1的表达。 结果: LDL可明显地减少培养液中NO2-/NO3-的含量，增加细胞ICAM-1的表达，但不影响ET-1的分泌；OX-LDL可明显减少培养液中NO2-/NO3-的含量、升高ET-1的水平，同时上调细胞表面ICAM-1的表达； 在预处理条件下，DHEA可升高LDL作用后细胞培养液中NO2-/NO3-的含量、下调ICAM-1的表达，但在混合培养条件下无此作用；在预处理及混合培养条件下，DHEA均可升高OX-LDL作用后细胞培养液中NO2-/NO3-的含量、减少细胞ET-1分泌以及下调ICAM-1的表达。 结论: LDL和OX-LDL对ECV304细胞具有明显的毒性作用，两者作用机制不尽相同。DHEA可能通过对ECV304细胞内部结构和功能的调节或通过其对OX-LDL分子的直接作用而发挥保护作用。     

核酶抑制内皮素-1mRNA的表达

目的:从设计针对人内皮素-1mRNA的核酶DNA片段中,筛选能显著抑制ET-1mRNA表达的核酶。方法:应用锤头状核酶设计原理,将计算机设计人工合成的核酶片段亚克隆到真核表达载体pEGFP中,经脂质体转染入ECV304细胞后,用RT-PCR方法测定转染核酶的细胞内ET-1mRNA的相对含量,并用空载体作对照。结果:设计的核酶R145降低ECV304细胞ET-1mRNA的表达。结论:与对照组相比,核酶R145能显著抑制ECV304细胞ET-1mRNA的表达。     

高糖时细胞间相互作用对共培养ECV304细胞的影响及茶多酚的干预作用

目的：研究高糖时系膜细胞对体外共培养的ECV304细胞产生活性氧和转化生长因子β1（TGF-β1）的影响以及茶多酚的干预作用。 方法： 建立体外ECV304细胞和系膜细胞不直接接触共培养体系，分为正常对照组、高糖组、茶多酚组、茶多酚干预组，并与两种细胞分别单独培养进行比较，培养36 h后，分光光度比色法测定细胞上清液超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量，RT-PCR法测定培养ECV304细胞内TGF-β1 mRNA的表达。 结果： 在共培养模型中，高糖抑制SOD活性，促进MDA产生，上调共培养模型中ECV304细胞TGF-β1 mRNA表达，其作用显著高于单独培养的ECV304细胞，茶多酚干预可拮抗高糖时ECV304细胞的上述改变。 结论： （1）高糖环境下系膜细胞和ECV304细胞间存在相互作用，这种作用能促进共培养的ECV304细胞产生活性氧和上调TGF-β1的表达。（2）茶多酚通过干预这种细胞间相互作用，保护ECV304细胞。     

当归对高糖所致内皮细胞损伤的保护作用

目的:研究高糖培养液对体外培养人脐静脉内皮细胞株ECV304的影响及当归注射液对高糖培养环境中内皮细胞功能的保护作用。方法:在RPMI1640培养液中培养内皮细胞后,分成对照组、高糖培养组、高糖+当归组、当归组,培养48h后观察各组内皮细胞形态、检测培养液中一氧化氮(NO)浓度和ECV304细胞增殖活性。结果:高糖培养ECV304细胞有肿胀现象,且数量减少;当归干预后,ECV304细胞形态与对照组相似,且数量增多。高糖培养的ECV304细胞增殖活性和NO浓度较高糖+当归组显著减少(P<0.05),而当归组与对照组无统计学差异(P>0.05)。结论:当归注射液可以预防高糖培养对内皮细胞增殖及分泌NO功能的损害,从而对糖尿病患者的血管损害可能起到一定的保护作用。     

赖型钩端螺旋体溶血素HlyX基因的克隆、表达及其细胞毒效应

目的：克隆、表达HlyX基因并研究其细胞毒性效应。 方法:从赖型钩端螺旋体017株全基因组中用PCR方法扩增出目的基因，双酶切构建重组质粒，转化E.coliJM109，诱导表达HlyX；将表达的目的蛋白免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体，Western blotting鉴定其免疫原性；将目的蛋白纯化、复性后作用于ECV304细胞，通过检测ECV304细胞乳酸脱氢酶（LDH）和一氧化氮（NO）的释放量研究目的蛋白的细胞毒性效应。 结果:扩增出1 179 bp的目的基因HlyX，重组质粒经双酶切、PCR鉴定，测序结果表明重组质粒构建成功。经IPTG诱导表达的融合蛋白约64 kD，主要以包涵体的形式表达，经免疫动物得到多克隆抗体，ELISA检测效价达1∶〖KG-*2〗64 000； Western blotting鉴定在目的蛋白的位置处有特异性阳性条带。经过HlyX融合蛋白作用的ECV304细胞LDH和NO释放量明显高于对照组（P<0.01）。 结论:HlyX能在大肠杆菌中表达，表达的目的蛋白对细胞有毒性效应。     

抑制ECV304细胞内EOLA1基因表达后效应观察

目的观察抑制人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞内内皮高表达脂多糖相关因子1（endothe-lial-overexpressed lipopolysaccharide-associated factor 1,EOLA1）基因表达后细胞生长的变化。方法构建EGFP-EOLA1融合蛋白表达载体pEGFP-N2/EOLA1,转染ECV304细胞,G418压力筛选获得稳定表达株;设计靶点特异性的寡核苷酸,连接到经BamHⅠ和HindⅢ酶切线性化的pSlincer3.1/H1质粒上。转染重组质粒到稳定表达EGFP-EOLA1融合蛋白的ECV304细胞,检测靶基因的抑制情况,观察EOLA1表达被抑制后细胞生长的改变。结果抑制EOLA1表达后ECV304细胞生长明显减慢。结论EOLA1基因在细胞内参与了细胞生长的调控。     

血管内皮细胞(ECV304)表达的HLA-G1对NK细胞杀伤活性的抑制作用

目的:证实HLA-G1分子能够抑制NK细胞对同种血管内皮细胞系的杀伤作用。方法:采用脂质体介导的DNA转染技术,以构建的真核表达质粒pcDNA3-HLA-G1转染人脐静脉内皮细胞系ECV304,再用免疫荧光法检测表达的HLA-G1分子。并用MTT比色法检测HLA-G1对NK细胞杀伤活性的影响。结果:ECV304细胞上可稳定表达HLA-G1。NK细胞对空质粒pcDNA3转染的ECV304细胞的杀伤率为(50.6±18.1)%;而对pcDNA3-HLA-G1转染的ECV304细胞的杀伤率为(29.7±11.4)%,两者差异具有显著意义(P<0.01)。结论:HLA-G1分子可明显抑制NK细胞对同种血管内皮细胞的杀伤效应。