联合神经生长因子诱导小鼠胎肝间充质干细胞向神经外胚层分化

目的:观察小鼠胎肝间充质干细胞在联合神经生长因子的作用下向神经细胞分化的能力。方法:实验于2004-03/09在暨南大学血液病研究所完成。健康BABL/c小鼠按雌雄2∶1的比例合笼过夜,第2天分开并检查。以见到阴栓为怀孕的标准,计为孕0.5d。分离孕13.5dBABL/C胎鼠肝脏,贴壁法收获胎肝间充质干细胞。用以下方案进行诱导:碱性成纤维生长因子(10μg/L)4d;碱性成纤维生长因子(10μg/L)和成纤维生长因子8(10μg/L)4d;碱性成纤维生长因子(10μg/L)、脑源性神经营养因子(10μg/L)以及2%的B274d。观察诱导细胞的形态学变化。于诱导0,4,12d收获细胞,反转录聚合酶链反应检测神经特异性基因表达;免疫细胞染色检测神经特异性蛋白的表达。以上实验均重复3次。结果:①形态学变化:经贴壁法分离的胎肝间充质干细胞呈均质梭形。碱性成纤维生长因子诱导3d,胎肝间充质干细胞开始变圆并聚集,呈神经干细胞样形态。经成纤维生长因子8和脑源性神经营养因子的进一步诱导后,大部分细胞呈现典型的神经元样细胞形态,极少数细胞呈星形胶质细胞样形态。②胎肝间充质干细胞经过神经生长因子的顺序诱导后,表达神经特异性基因:未诱导的胎肝间充质干细胞巢蛋白(nestin神经干细胞特异性)、低分子量神经丝蛋白(神经元特异性)、胶质纤维酸性蛋白基因(星形胶质细胞特异性)表达与看家基因(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)的比值分别为(0.06±0.02),0,0;诱导4d分别为(0.59±0.11),(0.46±0.23),(0.20±0.96);诱导12d分别为(0.21±0.07),(0.85±0.31),(0.13±0.10)。每种基因在不同诱导时间的表达具有统计学差异(P<0.01)。③经过神经生长因子的顺序诱导,胎肝间充质干细胞表达神经特异性蛋白:未诱导的细胞不表达巢蛋白(神经干细胞特异性)、微管蛋白Tubulin(神经元特异性)以及胶质纤维酸性蛋白(星形胶质细胞特异性);诱导4d,圆形细胞及细胞团nestin染色阳性,Tubulin阳性细胞为(62.3±3.5)%,仅有(6.0±1.6)%的细胞显示胶质纤维酸性蛋白阳性;诱导12d,巢蛋白阳性细胞开始减少,Tubulin阳性细胞达(90.3±1.5)%;胶质纤维酸性蛋白阳性细胞为(4.7±1.5)%。诱导12d的细胞微管蛋白Tubulin阳性表达率与诱导4d的细胞相比有统计学差异;而诱导12d的细胞胶质纤维酸性蛋白阳性表达率与诱导4d的细胞相比没有统计学差异。结论:胎肝间充质干细胞在联合神经生长因子提供的信号作用下可以分化为神经元样细胞,诱导结束后,细胞表现为典型的神经元形态并表达神经元特异性蛋白Tubulin。     

人骨髓间质干细胞定向分化为神经元样细胞的实验

目的：体外定向诱导人骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞并观察其传导功能。方法：实验于2003-06／2004-02在中南大学湘雅医院完成。采用淋巴细胞分离液（1．007g／L）梯度离心分离人骨髓间质干细胞，体外进行培养扩增，丁化羟基苯甲醚和二甲基亚砜诱导人骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞，免疫细胞化学方法鉴定神经元特异性标志物，神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白，突触素蛋白．胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白： 结果：加入诱导剂3h后，大多数细胞转变为类似于神经元的形态，有长的突起，相互之间连接呈网状，并表达神经元特异性烯醇化酶，阳性率为（75．0&;#177;6．5）％、神经丝蛋白阳性率为（68．0&;#177;4．2）％及胶质纤维酸性蛋白阳性率为（25．0&;#177;6．4）％，但胶质纤维酸性蛋白表达明显较前两者弱（P〈0．05）。神经元细胞胞体表达突触素蛋白，突起未见表达。 结论：人骨髓间质干细胞在体外可以分化为神经元样细胞；神经元样细胞其突起不具备传导功能。     

小鼠胚胎神经干细胞的体外生长特性和相关基因的表达

目的：观察小鼠胚胎神经干细胞的体外生长特性并检测其相关基因的表达。方法：实验于2005—02／06在暨南大学医学院中心实验室进行。①取妊娠13．5d昆明小鼠分离胚胎大脑中的神经干细胞，用添加碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养基进行体外培养，取培养3d的神经球接种于多聚赖氨酸包被的培养瓶，用含血清的培养基诱导分化。②免疫细胞化学检测细胞表面抗原。（爹四甲基偶氮唑盐法绘制生长曲线。④流式细胞术检测细胞周期。⑤反转录-聚合酶链反应和免疫细胞化学技术对神经干细胞进行鉴定。结果：①胚胎神经干细胞及其分化细胞的抗原表达：血清诱导8h，分化细胞中（8．9&;#177;5．6）％细胞呈Tubulin阳性，（87．5&;#177;7．4）％细胞胞浆呈胶质纤维酸性蛋白阳性表达。未诱导细胞近100％呈巢蛋白阳性，仅有极少数细胞Tubulin阳性或胶质纤维酸性蛋白阳性。②胚胎神经干细胞的细胞周期：从小鼠胚胎大脑获取的神经干细胞3d左右进入指数生长期；原代培养细胞83．8％处于静止期／DNA合成前期。③原代与传代细胞均表达巢蛋白mRNA，聚集形成的神经球巢蛋白阳性。血清诱导4h胚胎神经干细胞开始转录神经元相关基因Tau和胶质细胞相关基因胶质纤维酸性蛋白。结论：从小鼠胚胎大脑可成功分离获得大量胚胎神经干细胞．并在含碱性成纤维细胞生长因子的条件培养基中迅速增殖，血清诱导下分化生成神经元和星型胶质细胞。     

骨形成蛋白4诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元的能力

目的：骨形成蛋白4(bone morphogenetic protein4，BMP4)体外诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元的能力。方法：采用BMP4体外定向诱导第五代骨髓间充质干细胞，免疫组化鉴定神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果：成年大鼠骨髓间充质干细胞受BMP4诱导后出现神经元样细胞，细胞免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NF表达阳性，诱导后5h，12h，1d，3d，5d和7d的NF神经样细胞阳性率分别为(40&;#177;7)％，(71&;#177;6)％，(58&;#177;3)％，(53&;#177;6)％，(37&;#177;5)％，(13&;#177;2)％，诱导后12h，NF神经元样细胞阳性表达到高峰，与诱导后5h比较，差别有显著性(t=1．380～2．621，P&;lt;0．05)。结论：BMP4可以在体外诱导成年大鼠骨髓间充质分化为神经元。     

地黄多糖诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞的效应

目的：探讨地黄多糖对骨髓问充质干细胞分化为神经细胞的诱导效应。方法：实验于2004-03／06在湖南省中医学院内科实验室进行，取1月龄SD大鼠1只，取股骨和胫骨，利用贴壁法分离纯化骨髓问充质干细胞。将骨髓间充质干细胞分为3组：地黄多糖组用地黄多糖诱导其向神经细胞分化，β-巯基乙醇组β-巯基乙醇诱导，对照组不做任何处理。光镜下观察细胞形态，采用免疫细胞化学方法鉴定神经细胞特异性抗原标志神经丝蛋白和神经胶质细胞特异性抗原胶质纤维酸性蛋白的表达。结果：地黄多糖组经地黄多糖诱导培养24h后细胞显示为典型的神经细胞样形态，神经丝蛋白阳性为(82．3&;#177;6．1)％，胶质纤维酸性蛋白阳性细胞为(10．5&;#177;2．1)％。β-巯基乙醇组的细胞神经丝蛋白及胶质纤维酸性蛋白阳性细胞数较少，分别为(22．3&;#177;4．7)％，(42．3&;#177;5．3)％。对照组神经丝蛋白及胶质纤维酸性蛋白染色均为阴性：结论：地黄多糖具有诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞的作用，其机制需探讨。     

三甲复脉汤含药血清体外诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元

目的：观察三甲复脉汤含药血清体外诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经兀的能力。方法：实验于2004-10／2005—02在广州中医药大学神经解剖学实验室完成。选择40只SD大鼠，随机分为对照组、碱性成纤维细胞生长因子组、龟板组与三甲复脉汤组，每组10只。龟板组与三甲复脉汤组每天给予龟板与三甲复脉汤口服液4mL灌胃1周，对照组及碱性成纤维细胞生长因子组则给予等体积蒸馏水灌胃1周。采用含药血清体外定向诱导第五代骨髓间充质干细胞，龟板组与三甲复脉汤组用含10μg／L碱性成纤维细胞生长因子的L—DME 2μL预处理24h后，再分别加入龟板、三甲复脉汤含药血清诱导。每次诱导时设有对照血清组与碱性成纤维细胞生长因子组（加入10μg／L碱性成纤维细胞生长因子2μL）。诱导后5h，12h，1d，3d，7d在倒置显微镜下观察细胞形态，免疫组化鉴定神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白的表达。结果：在实验过程中共有2只动物死亡，进行了相应的补充，进入结果分析为40只，保持为4组，每组10只。①骨髓间充质干细胞受诱导向神经元分化的形态特征：骨髓间充质干细胞经碱性成纤维细胞生长因子、龟板与三甲复脉汤血清诱导5h后，部分细胞形态发生明显改变，胞体变小，胞质向核周收缩，由原来的梭形变成圆形，形成网络样结构。随着诱导时间延长，骨髓间质干细胞呈渐近性的向神经元样细胞转化，神经样细胞增多。对照组未见有神经元样细胞出现。②骨髓间充质干细胞诱导后细胞的神经分化鉴定：神经元样细胞的胞体和突起神经丝蛋白染呈棕色，神经丝蛋白阳性细胞胶质纤维酸性蛋白染色为阴性。③骨髓间充质干细胞诱导后细胞的神经元样细胞数：诱导后12h，神经元样细胞阳性率达到高峰，碱性的成纤维细胞生长因子组、龟板组、三甲复脉汤组细胞的神经元样细胞数均高于对照组[（74&;#177;6），（75&;#177;6），（71&;#177;5），（6&;#177;1）个1；至第7天仍有神经元样细胞存活，其中以三甲复脉汤存活时间最长，高于碱性成纤维细胞生长因子组和龟板组[（21&;#177;3），（12&;#177;3），（15&;#177;2）个]。结论：三甲复脉汤含药血清可以在体外诱导成年大鼠骨髓间充质分化为神经元，而且能延长其表达。     

软脑膜细胞诱导神经干细胞高比例分化为神经元的效应

目的：观察软脑膜细胞对神经干细胞分化的影响。方法：实验于2004年在上海体育学院运动科学系实验中心完成。从脑组织分别分离和培养软脑膜细胞和神经干细胞，并进行两种细胞的共培养，同时按照免疫细胞化学染色方法，观察和鉴别神经干细胞在软脑膜细胞提供的微环境下的分化状态。结果：自然分化条件下，微管相关蛋白-2ab阳性的神经元、胶质纤维酸性蛋白阳性的星型胶质细胞和2，3-环核苷酸磷酸二酯酶阳性的寡突胶质细胞在神经干细胞后代中所占比例分别为（14．6&;#177;4．5）％，（11．3&;#177;3．8）％和（73．6&;#177;18．7）％。而在共培养条件下，神经元、星型胶质细胞和寡突胶质细胞在神经干细胞后代中所占比例分别为（40．5&;#177;15．8）％．（44．6&;#177;16．7）％和（15．3&;#177;4．1）％。结论：软脑膜细胞可诱导神经干细胞高比例分化为微管相关蛋白-2ab阳性的神经元。     

体外培养诱导成人骨骼肌干细胞向神经样细胞分化的实验

目的：以含有碱性成纤维细胞生长因子和二甲基亚砜的培养液对原代培养的成人骨骼肌干细胞进行诱导，探讨其转化为神经细胞的可行性。 方法：实验于2004-06／12在军事医学科学院基础医学研究所完成。实验所用3例成人正常颞肌标本取白于开颅手术患者，由北京协和医院神经外科提供，患者知情同意。机械分离加混合消化液处理分离单细胞，体外培养及克隆纯化，培养至第3代时加入含有碱性成纤维细胞生长因子二甲基亚砜的培养液诱导分化，进行反转录-聚合酶链反应分析和免疫荧光细胞化学染色．观察诱导后细胞形态变化，同时结合普通光线在100倍下随机计数6个视野（大于100个细胞），计算阳性细胞的百分比。 结果：①骨骼肌干细胞培养24h后见少量细胞贴壁呈短的梭形或棒状。培养第3天红细胞开始裂解成细胞碎屑并聚集、悬浮在培养基中．这些碎屑随着换液而逐渐消失。克隆培养的细胞大约于接种后两三周才能铺满孔底，胞体呈梭形．排列规整。②荧光显微镜下胞核蓝染，每个细胞都呈Desmin染色阳性，证明成人骨骼肌干细胞能够在体外进行克隆培养。③在含有碱性成纤维细胞生长因子和二甲基亚砜的培养液诱导下，骨骼肌干细胞可分化为形态上类似于神经元和星形胶质细胞的细胞。④反转录-聚合酶链反应分析证实诱导后的骨骼肌干细胞有神经丝蛋白和胶质纤维酸性蛋白基因表达。⑤免疫荧光细胞化学检测到诱导后的骨骼肌干细胞呈神经丝蛋白和胶质纤维酸性蛋白免疫反应阳性。⑥诱导后骨骼肌干细胞分化为神经丝蛋白阳性细胞的比例为（35．9&;#177;6．3）％，分化为胶质纤维酸性蛋白阳性细胞的比例为（43．7&;#177;5．3）％。 结论：成人骨骼肌干细胞在体外经诱导分化后形态类似于神经元和星形胶质细胞，并且表达神经元标志物神经丝蛋白、星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白，认为成人骨骼肌干细胞在体外可诱导分化为神经元和星形胶质细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛素阳性细胞的潜能

目的：观察大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛素阳性细胞能力。方法：①实验于2004-09／2005-01在南京医科大学第一附属医院内分泌及代谢病研究室完成。选用清洁级雄性SD大鼠10只。②取大鼠骨髓，体外分离、培养骨髓间充质干细胞，流式细胞术检测CD45／CD90表达及细胞周期，明确骨髓间充质干细胞特性。③取第3代细胞，随机分为2组，低糖诱导组[先予体积分数0．1胎牛血清低糖Dulbecco改良的Eagle培养液（5.6mmol／L葡萄糖）]或高糖诱导组[高糖Dulbecco改良的Eagle培养液（25mmol／L葡萄糖）1培养14d，换予体积分数0．05胎牛血清低糖Dulbecco改良的Eagle培养液或高糖Dulbecco改良的Eagle培养液＋尼克酰胺（10mmol／L）培养7d，再加Exendin-4（10nmol／L）诱导培养7d。④采用反转录聚合酶链反应法检测胰腺一十二指肠同源盒基因1、胰岛素原和胰岛素基因的表达，激光共聚焦显微镜观察胰岛素蛋白的表达，流式细胞术检测胰岛素阳性细胞数和平均荧光强度，电镜观察诱导后细胞的超微结构。⑤组间计量资料比较采用方差分析。结果：①骨髓间充质干细胞贴壁生长，呈长梭形。流式细胞术检测显示，CD90阳性率为（96．3&;#177;1．3）％，CD45阳性率为（0.3&;#177;0．4）％，细胞周期静止期-DNA合成前期占（76．8&;#177;4．8）％，DNA合成后期一有丝分裂期（11．3&;#177;3．7）％，DNA合成期（11．9&;#177;5．7）％。②骨髓间充质干细胞诱导培养过程中，细胞形成团簇状分布，少数聚集成团，直径80～200μm，半悬浮于培养瓶中。电镜观察此类细胞胞浆内有较多分泌颗粒。③低糖诱导组和高糖诱导组均表达胰腺-十二指肠同源盒基因1、胰岛素原和胰岛素基因。④流式细胞术检测显示低糖诱导组和高糖诱导组胰岛素阳性细胞数和平均荧光强度均明显高于骨髓间充质干细胞诱导前[（21．9&;#177;11．1）％，（19．8&;#177;7．8）％，（1．4&;#177;1.2）％；21．0&;#177;7．6，22．5&;#177;14．5，8．7&;#177;3．5，P〈0．051。结论：大鼠骨髓间充质干细胞在体外可以诱导分化为胰岛素阳性细胞。     

冻存时间对复苏后胚胎大鼠神经干细胞体外诱导向多巴胺能神经元分化的影响

目的：观察应用10％牛血清白蛋白＋20％二甲基亚砜联合低温保护剂冷冻保存不同时间的胚胎大鼠中脑神经干细胞复苏后，其体外诱导分化成多巴胺能神经元的能力。 方法：实验于2004-02／2005-10在中山大学附属第一医院完成。①应用克隆细胞法在含细胞因子表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养液中单细胞克隆培养胚胎大鼠中脑神经干细胞。②经传代扩增后，培养于含10％牛血清白蛋白和20％二甲基亚砜的神经干细胞冻存液中，在液氮中分别冷冻保存6，12，及18个月后，重新复苏培养于神经干细胞培养液中，并在含白细胞介素1α、白细胞介素11、白血病抑制因子、胶质细胞源性神经营养因子的诱导分化液中诱导向多巴胺能神经元分化。③分化细胞分别进行免疫细胞化学鉴定和流式细胞仪检测。 结果：①胚胎大鼠中脑神经干细胞单细胞克隆系经冷冻复苏后，除少数细胞贴壁死亡外，多数细胞生长良好并克隆形成新的神经干细胞球。②神经干细胞球经诱导分化后，免疫细胞化学染色显示分化细胞中含有胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2及酪氨酸羟化酶染色阳性细胞。③流式细胞仪检测冻存6，12，18个月及未冻存组神经干细胞诱导分化的酪氨酸羟化酶染色阳性细胞的分化率分别为（15．3&;#177;3．4）％，（16．2&;#177;1．8）％，（15．6&;#177;2．2）％，（16．7&;#177;2．8）％，方差分析显示各组间差异无显著性（F=1．799，P〉0．05）。 结论：冷冻保存18个月的胚胎大鼠中脑神经干细胞不影响其体外诱导分化成多巴胺能神经元的能力。