以Bacmid-杆状病毒-昆虫细胞系统表达人FGF-9

目的：在Ｂａｃｍｉｄ杆状病毒昆虫细胞系统中表达人ＦＧＦ９ 。方法：采用ＲＴＰＣＲ技术,自新鲜人脑胶质瘤组织获取人ＦＧＦ９ 全编码区ｃＤＮＡ,将其克隆入ｐＣＲＴＭ Ⅱ质粒及ｐＹＥＸ４Ｔ１ 真核表达质粒,经ＤＮＡ自动测序仪进行ＤＮＡ序列测定。将人ＦＧＦ９ ｃＤＮＡ 定向克隆入ｐＦａｓｔＢａｃ 质粒,进一步将其转座入Ｂａｃｍｉｄ 中,在昆虫细胞Ｓｆ９ 中进行表达,采用ＳＤＳＰＡＧＥ对表达产物进行分析。结果：在昆虫细胞表达系统中表达出人ＦＧＦ９ 重组蛋白。结论：人ＦＧＦ９ 在Ｂａｃｍｉｄ杆状病毒昆虫细胞系统中得到了表达。     

酵母蛋白质组氨酸激酶在昆虫细胞中的表达

以ＤＮＡ聚合酶链式反应从酵母基因组ＤＮＡ中钓取编码酵母组氨酸激酶活性区的ＤＮＡ，将此ＤＮＡ克隆入Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ转递质粒。然后用Ｂａｃｕｌｏ Ｇｏｌｄ ＤＮＡ与重组质粒ｐＶＬ１３９３共转染昆虫细胞（ＳＦ９），在感染了重组Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ的ＳＦ９细胞中表达了ＹＨＫ活性蛋白，该蛋白在体外组氨酸激酶试验中表现出自身组氨酸残基磷酸化的活性。     

人胰岛素样生长因子1的真核细胞表达及其鉴定

目的 构建人胰岛素样生长因子１（ＩＧＦ－１）的真核细胞表达质粒。方法 用ＰＣＲ方法从人的肝细胞ｃＤＮＡ文库中克隆出ＩＧＦ－１ｃＤＮＡ,然后定向插入真核细胞表达载体ｐｃＤＮＡ３中,并用脂质体方法转染ＣＯＳ７细胞。用ＥＬＩＳＡ法和人胚肺纤维母细胞以及ＮＩＨ３Ｔ３纤维细胞增殖法分别测定转染细胞上清液中ＩＧＦ－１的含量和生物活性。结果 重组的真核细胞表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＩＧＦ－１所含的ＩＧＦ－１ｃＤＮＡ序列和插入方向均正确,其转染的ＣＯＳ７细胞分泌较高浓度的ＩＧＦ－１,并且具有明显促进纤维细胞增殖的能力。结论 本实验所构建的重组真核细胞表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＩＧＦ－１能够高效表达有活性的ＩＧＦ－１,对进一步研究ＩＧＦ－１体内表达的生理和病理作用有一定意义。     

用细菌／杆状病毒系统在昆虫细胞中表达HIV—2外膜糖蛋白gp105和跨膜糖蛋白g

目的 用细菌／杆状病毒（Ｂａｃ ｔｏ Ｂａｃ）表达系统在昆虫细胞Ｓｆ９中表达ＨＩＶ－２外膜糖蛋白ｇｐ１０５跨膜糖蛋白ｇｐ３６,为研制艾滋病疫苗和诊断试剂奠定基础。方法 分别将ＨＩＶ－２外膜蛋白ｇｐ１０５和跨膜蛋白ｇｐ３６全基因序列克隆到杆状病毒转座载体ｐＦａｓｔ Ｂａｃ ＴＨａ和ｐＦａｓｔ Ｂａｃ ＴＨｂ中我角体启动子下游,构建成重组转座载体ｐＦａｓｔ Ｂａｃ ＨＴａ－ｐｇ１０５和ｐＦａｓｔ Ｂａｃ ＨＴｂ－ｇｐ３６,利用细菌／杆状病毒（Ｂａｃ ｔｏ Ｂａｃ）表达系统筛选重组杆状病毒,并在昆虫细胞Ｓｆ９中表达ＨＩＶ－２的ｇｐ１０５和ｇｐ３６。结果 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析结果表明,ｐｇ１０５基因表达产物为－６６０００ｕ糖蛋白,ｐｇ３６基因则表达－４１０００ｕ糖蛋白,与天然产物一致。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ结果显示：     

诱导条件对TNF—α ScFv在原核系统中表达量的影响

目的：探讨诱导时间对目的蛋白表达量的影响。为大量获得抗ＴＮＦ－α单链抗体提供实验依据。方法：将Ｅ６ＳｃＦｖ基因分别克隆入表达载体ｐＥＴ１５ｂ－Ｅｔａｇ和ｐＢＶ２２０中,构建重组质表达质粒ｐＥＴＥ６ＳｃＦｖ和ｐＢＶＥ６ＳｃＦｖ。在化学诱志和温度诱导两种条件下,于诱导后相同时间点等量取菌体,用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ对各时间点表达产物扫描定量。     

E－选择素cDNA克隆和表达

从内皮细胞总ＲＮＡ中用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出Ｅ－选择素ｃＤＮＡ全长编码区，并将其克隆到ｐＵＣ１８载体中，构建了重组质粒ｐＵＣ１８／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ，对此质粒进行了酶切及ＤＮＡ序列分析鉴定。将Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎｃＤＮＡ插入到天坛株痘苗病毒载体ＳｍａＩ位点，构建了表达质粒ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ。采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法，ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ转染ＴＫ－１４３细胞，用ＢｕｄＲ和ＬａｃＺ双筛选，获得带有人Ｅ－选择素ｃＤＮＡ的重组痘苗病毒。经活细胞荧光染色和ＡＰＡＭ检测，重组痘苗病毒能有效地表达人Ｅ－选择素ｃＤＮＡ。     

GST-人可溶性成纤维细胞生长因子受体1融合蛋白在酵母细胞中的表达及活性测定

目的：表达重组人可溶性成纤维细胞生长因子受体１（ｓｏｌｕｂｌｅ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　１，ｓＦＧＦＲ１），研究其对成纤维细胞生长因子（ＦＧＦ）生物学活性的拮抗作用。方法：采用逆转录－ＰＣＲ（ＰＴ－ＰＣＲ）技术自人肺成纤维细胞获得ｓＦＧＦＲ１　ｃＤＮＡ，测序确证后，将其克隆人酵母细胞表达载体ｐＹＥＸ４Ｔ－１；重组质粒转化入酵母细胞（ＤＹ１５０）中进行诱导表达，表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及 Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ鉴定。利用 ＮＩＨ３Ｔ３细胞增殖抑制实验检测重组人 ｓＦＧＦＲ１的生物学活性。结果：经 ＣｕＳＯ４诱导，酵母细胞表达出重组谷胱苷肽转移酶（ＧＳＴ）－ｓＦＧＦＲ１融合蛋白，此蛋白在凝胶上表现为 １条约 ６０ｋＤ的阳性区带，在 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ实验中可被ＧＳＴ特异性抗体识别。重组ＧＳＴ－ｓＦＧＦＲ１融合蛋白的粗提物在体外能够桔抗ＦＧＦ介导的促ＮＩＨ３Ｔ３细胞增殖的活性。结论：重组ＧＳＴ－ｓＦＧＦＲ１融合蛋白在酵母表达系统中得到有效表达，并具有很好的生物活性。     

直接从中国人胎肝染色体DNA中克隆粒细胞集落刺激因子（G－CSF）外显子及其在大肠杆菌中的高效表达

利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，直接从正常人胎肝染色体ＤＮＡ库中分离克隆了中国人粒细胞集落刺激因子（ｃ－ＣＳＦ）外显子，全长５３７ｂｐ，它包括除信号肽氨基酸外的所有编码区，为了使克隆的Ｇ－ＣＳＦ外显子在大肠杆菌中高效表达，对其５’端进行了修饰，去除第１个编码Ｔｈｒ的密码子，在不改变氨基酸的前提下，变换为ＡＴ丰富的密码子；并将某些密码子换成大肠杆菌喜用的密码子。对于每段目的ＤＮＡ所进行的２次独立的ＰＣＲ反应所获得的产物分别进行了核苷酸序列测定。结果完全一致，证明所克隆的Ｇ－ＣＳＦ外显子的序列是可靠的，与国外发表的Ｇ－ＣＳＦ外显子序列相比，未发现变异。将上述人Ｇ－ＣＳＦ外显于基因插入ｐＢＶ２２０表达载休，构建了ｐＢＶ２２０／Ｇ－ＣＳＦ质粒，将其转化入ＤＨ５ａ菌，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明其表达量约占菌体总蛋白量的２０％，用依赖性细胞系ＮＦＳ－６０进行测定，活性为５ｘ１０ｖＩＵ／Ｌ。     

p53、c-erbB-2、PCNA和EGFR在膀胱癌中过表达及其意义

目的：研究癌基因和抑癌基因蛋白产物在膀胱移行细胞癌中异常表达与病理分级、临床分期、复发和预后的关系。方法：应用免疫组化Ｓ－Ｐ法检查１１７例膀胱移行细胞癌组织中ｐ５３、ｃ－ｅｒｂＢ－２、ＰＣＮＡ和ＥＧＦＲ的表达水平。结果：１１７例膀胱移行细胞癌中ｐ５３、ｃ－ｅｒｂＢ－２、ＰＣＮＡ和ＥＧＦＲ阳性表达率分别为４７．０％、２９．９％、５３．８％和４８．７％。ｐ５３和ＰＣＮＡ阳性表达产物定位于肿瘤细胞核内，ｃ－ｅｒｂＢ－２阳性表达产物定位于细胞膜上，ＥＧＦＲ阳性表达产物定位于细胞膜或细胞浆内。结果表明ｐ５３、ｃ－ｅｒｂＢ－２、ＰＣＮＡ和ＥＧＦＲ异常表达与膀胱癌的分级、分期、复发及术后生存率等之间有统计学意义。结论：ｐ５３、ｃ－ｅｒｂＢ－２、ＰＣＮＡ和ＥＧＦＲ异常表达有助于评估膀胱癌预后，多基因异常表达作为预后评价指标更有意义。     

人补体膜辅助调节蛋白MCP的基因克隆及共真核表达的研究

目的 克隆获得编码人补体膜辅助调节蛋白（ＭＣＰ）的ｃＤＮＡ，并对其在真核细胞的表达及功能进行研究。方法 应用ＲＴ－ＰＣＲ 方法，从Ｕ９３７细胞总ＲＮＡ中扩增编码人ＭＣＰ分子的ｃＤＮＡ片段，快速克隆于ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ载体，测定共序列。将该片段重组于ｐＬＸＳＮ载体，电穿孔转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，经ＦＡＣＳ检测筛选表达ＭＣＰ的阳性细胞克隆，用补体容破试验鉴定其抑制人补体溶破的功能。结果 ＲＴ－ＰＣＲ     

人钙调素基因表达载体的构建及在大肠杆菌DH5α中的表达

目的;构建人钙调素基因表达载体并在大肠杆菌ＤＨ５α中高效表达人ＣａＭ蛋白。方法：用ＰＣＲ方法获得人钙调素基因Ⅲ（ｈＣａＭⅢｃ ＤＮＡ）,将其插入表达载体ｐＢＶ２２０,构建重组表达质粒ｈＣａＭα／ｐＢＶ２２０,用酶切,ＤＮＡ测序,ＰＣＲ扩增鉴定阳性克隆。结果：阳性重组子在大肠杆菌ＤＨ５α中经温度诱导可高效表达ＣａＭ蛋白,经１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,可观察到一分子量与理论值相符的诱导表达条带,其表达     

登革病毒E蛋白抗原基因肌肉注射诱导小鼠免疫应答的初步研究

目的：研究登革病毒Ｅ基因免疫的可行性,方法：用脂质体转染法将构建的Ｅ基因重组真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－Ｅ导入小鼠成纤维细胞ＮＨ３Ｔ３细胞,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和蛋白质印迹试验检测Ｅ基因的体外表达。然后将该重组真核表达质粒经肌肉注射免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,检测其诱发特异性免疫应答水平。结果：重组真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－Ｅ在小鼠体内诱发一定水平的体液和细胞免疫应答,且持续时间较长。结论：登革病毒Ｅ基因免疫可诱发特异性免疫应答。为登革病毒疫苗的研制提供了实验依据。     

TA克隆及双链DNA：测序：介绍一种快速克隆及分析PCR产物的方法

将人酸性纤维母细胞生长因子’（ａＦＧＦ’）ｃＤＮＡ的ＰＣＲ产物以ＴＡ连接方式克隆入ｐＣＲ￣（ＴＭ）ＩＩ质粒，然后采用Ｔ７和Ｓｐ６启动子特异性引物对克隆的片段以双脱氧未端终止法进行双链ＤＮＡ测序。结果表明这项技术是一种快捷而可靠的克隆及分析ＰＣＲ产物的方法     

人野生型p53 cDNA的克隆、表达和意义

目的：为探讨肿瘤细胞ｗｔ ｐ５３蛋白功能失活机制的研究,检测肿瘤患者血清抗ｐ５３抗体辅助临床诊断提供人ｗｔ ｐ５３蛋白。方法 将人ｗｔ ｐ５３基因ｃＤＮＡ片段插入到大肠杆菌表达载体ｐＱＥ－３０中,得到重组表达质粒ｐＱＥ３０－ｐ５３,用ｐＱＥ３０－ｐ５３重组质粒转化大肠杆菌Ｍ１５细胞,转化菌落经ＰＣＲ扩增和ＢａｍＨⅠ、Ｘｂａ Ｉ酶切证实ｐ５３基因插入。ＩＰＴＧ诱导大肠杆菌表达ｗｔ ｐ５３蛋白,通过Ｎ     

小鼠白细胞介素6的cDNA克隆及其在昆虫细胞中的表达

本文采用ＲＴ－ＰＣＲ技术从ＬＰＳ刺激后的小鼠腹腔巨噬细胞，扩增小鼠ＩＬ－６ｃＤＮＡ，并克隆构建ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（＋）ＩＬ－６质粒，继将小鼠所得ｃＤＮＡ克隆到ｐＶＬ１３９２载体上，利用杆状病毒ＡｃＮＰＶ表达系统在Ｓｆ９中进行瞬间表达，用ＩＬ－６依赖细胞株ＭＨ６０·ＢＳＦ２检测其表达活性，结果表明，感染后４８ｈ后就具有明显ＩＬ－６表达，由此可见，利用该系统可成功地表达小鼠ＩＬ－６基因。     

人MBL相关丝氨酸蛋白酶-1 cDNA的克隆与鉴定

目的 获得人甘露聚糖结合凝集素（ＭＢＬ）相关丝氨酸蛋白酶－１（ＭＡＳＰ－１）基因。方法 以人胎肝组织总ＲＮＡ为模板,采用ＲＴ－ＰＣＲ获取目的ｃＤＮＡ片段,克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ载体,进行酶切图谱分析和测序鉴定。结果 以ＲＴ－ＰＣＲ方法获得了含信号顺序的全长ＭＡＳＰ－１ｃＤＮＡ,将其与ｐＧＥＭ－Ｔ载体连接,转化大肠杆菌ＴＧ１,建立了ＭＡＳＰ－１的ｃＤＮＡ克隆,酶切图谱与微机分析结果一致。序列分析表明。与     

HBsAg S与GM—CSF融合基因在L929细胞中的表达

将乙肝病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）主蛋白的编码基因Ｓ与人ＧＭ－ＣＳＦ基因融蛤 后,插入真核表达质粒ｐｃＤＮＡ１中,经质粒酶切鉴定及ＤＮＡ序列分析证明,目的基因插入ｐｃＤＮＡ１的ＣＭＶ启动子下降。以获得的重组质粒ｐＳＧＭ转染Ｌ９２９细胞,经ＲＴ－ＰＣＲ及细胞原位杂交证实目的基因的转录。     

不同载体对癌胚抗原DNA疫苗诱导小鼠产生抗—CEA水？…

目的 将癌胚抗原（ＣＥＡ）基因克隆入载体ｐｃＤＮＡ３及ＶＲ１０１２中，比较两套重组质粒在体内表达并诱导小鼠产生抗－ＣＥＡ的差别。方法 通过基因工程技术构建两套ＣＥＱ真核表达载体ｐｃＤＮＡ３－ＣＥＡ及ＶＲ１０１２－ＣＥＡ，将重组质粒肌注ＢＡＫＢ／ｃ小鼠，运用ＥＬＩＳＡ法检测不同时间肌肉组织表达ＣＥＡ水平及血清中抗－ＣＲＡ的产生。结果 ｐｃＤＮＡ３－ＣＥＡ在肌肉内呈低表达ＣＥＡ，最高时为０．１８ｍｇ／     

E—选择素cDNA克隆和表达

从内皮细胞总ＲＮＡ中用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出Ｅ选择素ｃＤＮＡ全长编码区，并将其克隆到ｐＵＣ１８载体中，构建了组质粒ｐＵＣ１８／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ对此质粒进行了酶切及ＤＮＡ序列分析鉴定，将Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎｃＤＮＡ插入一以天坛株痘苗病毒载体ＳｍａＩ位构建了表达质粒ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ，采用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法，ｐＪＳＡ１１７５／Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ转染ＴＫ＾－１４３细胞，用     

登革2型病毒NGC株E基因在NIH3T3细胞中的表达？…

目的 构建登革２型病毒Ｅ基因的真核表达载体,实现登革病毒Ｅ蛋白的真核表达。方法 采用逆录－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增登革２型病毒（ＮＧＣ株）包膜糖蛋白Ｅ基因全长片段,克隆人真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的Ｐｃｍｖ启动子下游,构建重组真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－Ｅ,用脂质体转染法转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞,表达产物以免疫荧光、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和蛋白质印迹进行分析检测。结果 成功构建了重组真核表达质粒ｐｃＤＮ