旋毛虫成虫cDNA文库免疫筛选及序列分析

目的　为获得旋毛虫成虫抗原基因。　方法　应用免疫血清和人工感染血清对旋毛虫成虫cDNA文库进行免疫筛选、克隆测序及核苷酸序列数据库 (GenBank)查寻比较 ,采用DNAstar软件进行基因序列分析。　结果　免疫筛选成虫cDNA文库 ,获得 9个阳性克隆。对其中的Ts87进行测序 ,又采用 5′ RACE ,获取全长为 1172bp的cDNA片段 ,该基因编码 3 47个氨基酸。序列分析表明 ,克隆Ts87是个尚未见报道的旋毛虫基因序列 ,存在预测的抗原表位。　结论　获得具有抗原性的旋毛虫抗原新基因。     

免疫筛选旋毛虫cDNA克隆及原核表达

目的 获取旋毛虫抗原的cDNA克隆并进行蛋白的原核表达。方法 应用兔抗旋毛虫成虫可溶性全虫抗原血清对旋毛虫成虫cDNA文库进行筛选，并用兔人工感染旋毛虫血清对强阳性克隆进行再筛选。将编号为Ts87阳性克隆的基因片段亚克隆PET－28a( )表达载体，IPTG诱导表达后用SDS－PAGE电泳分析表达产物。结果 免疫筛选获得阳性克隆Ts87；成功构建重组表达质粒PET－28a( )/Ts87。诱导表达该融合蛋白，SDS－PAGE电泳表明，其能表达一分子质量约为40ku的融合蛋白，与预测分子质量相符。结论 筛选到cDNA克隆Ts87，与兔抗旋毛虫成虫可溶性全虫抗原血清和兔人工感染旋毛虫血清均产生特异性免疫反应，PET原核表达系统所获重组蛋白为蛋白功能研究奠定了基础。     

旋毛虫成虫期特异性基因的筛选与序列分析

目的　获得旋毛虫成虫期特异性基因序列。方法　应用旋毛虫成虫期特异性探针对成虫cDNA文库进行杂交筛选、克隆测序及核苷酸序列数据库 (GenBank)查寻比较 ,采用DNAstar软件进行基因序列分析。结果　利用消减杂交 (subtractedhybridization)获得的旋毛虫成虫期特异性探针筛选成虫cDNA文库 ,获得一个长 16 2 9bp的基因。其开放阅读框架由 146 4个核苷酸组成 ,编码 487个氨基酸。序列分析表明 ,该序列是一个尚未见报道的旋毛虫基因序列 ,在 2 0 7～ 2 70位氨基酸间存在两个锌指结构 ,在 5 2～ 6 4,10 8～ 116 ,137～ 16 3,2 2 6～ 2 6 0位氨基酸处存在预测的抗原表位。结论　获得旋毛虫成虫期特异性基因 ,其编码的蛋白具有一定的抗原表位     

免疫筛选旋毛虫cDNA克隆及原核表达

目的　获取旋毛虫抗原的 c DNA克隆并进行蛋白的原核表达。　方法　应用兔抗旋毛虫成虫可溶性全虫抗原血清对旋毛虫成虫 c DNA文库进行筛选 ,并用兔人工感染旋毛虫血清对强阳性克隆进行再筛选。将编号为 Ts87阳性克隆的基因片段亚克隆入 PET- 2 8a( +)表达载体 ,IPTG诱导表达后用 SDS- PAGE电泳分析表达产物。　结果　免疫筛选获得阳性克隆 Ts87;成功构建重组表达质粒 PET- 2 8a( +) / Ts87。诱导表达该融合蛋白 ,SDS- PAGE电泳表明 ,其能表达一分子质量约为 40 ku的融合蛋白 ,与预测分子质量相符。　结论　筛选到 c DNA克隆 Ts87,与兔抗旋毛虫成虫可溶性全虫抗原血清和兔人工感染旋毛虫血清均产生特异性免疫反应 ;PET原核表达系统所获重组蛋白为蛋白功能研究奠定了基础。     

大鼠抗感染血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库

目的　探讨大鼠抗日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)感染的分子机制 ,为血吸虫病疫苗的研制提供新的抗原分子。方法　用Sj感染大鼠血清筛选Sj成虫cDNA文库 ,对阳性克隆cDNA插入片段进行PCR扩增及测序分析。 结果　对cDNA文库中约 3× 10 5个噬菌斑进行筛选 ,获 7个阳性克隆 ,其插入基因片段大小为 0 9kb～ 2 0kb。初步测序获 5个部分序列 ,其中R3与Sj线粒体基因明显同源 ;R5为新基因序列 ,命名为Sj-Cs2 (GenBank的登录号为AY0 36 5 80 ) ,经计算机分析该基因片段编码 2 0 6个氨基酸组成的跨膜蛋白 ,Sj-Cs2蛋白含有 3个蛋白激酶C磷酸化位点和 6个N -肉豆蔻酸化位点 ;其余序列亦为新基因片段 ,但无完整编码框。结论　筛选获得了与大鼠抗Sj感染有关的基因克隆 ,相关克隆cDNA全长的获取、新基因的结构与功能以及免疫学特性值得深入研究     

旋毛虫抗原基因Ts88原核表达及重组蛋白鉴定

目的　原核表达旋毛虫抗原基因Ts88,并对重组蛋白的抗原性进行鉴定。　方法　免疫筛选cDNA文库得到旋毛虫抗原新基因Ts88,克隆入原核表达载体pET28c(+),异丙基βD硫代半乳糖苷诱导表达。重组蛋白免疫小鼠制备免疫血清,ELISA检测抗体滴度。蛋白质印迹法检测重组蛋白的抗原性。免疫荧光试验确定Ts88蛋白在虫体的分布。　结果　经原核表达的Ts88重组蛋白,用其免疫小鼠可得到高滴度的抗体血清。蛋白质印迹法结果表明该重组蛋白能与旋毛虫病患者血清、旋毛虫病猪血清、人工感染及人工免疫兔血清反应,不与其他蠕虫病患者血清发生交叉反应 ,并能识别旋毛虫虫体天然抗原成分。免疫荧光试验显示Ts88蛋白主要分布于虫体体壁。　结论　成功制备Ts88基因的重组蛋白,证明该蛋白具有较好的抗原性     

自愈水牛血清免疫筛选日本血吸虫cDNA文库

目的　采用自愈水牛血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库并寻找日本血吸虫疫苗新候选抗原。　方法　用感染日本血吸虫后的自愈水牛血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库,将阳性重组子克隆、测序,对核酸序列进行分析,确定目的基因。　结果　从大陆株日本血吸虫成虫λZAPIIcDNA文库筛到26个阳性克隆,经初步鉴定获3种编码蛋白分子的基因:副肌球蛋白,谷胱甘肽S转移酶,羟基类固醇脱氢酶。　结论　感染日本血吸虫后的自愈水牛血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库,可用于寻找日本血吸虫疫苗新候选抗原。     

旋毛虫感染鼠血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库

目的 探讨旋毛虫与血吸虫之间交叉免疫的分子机制,并寻找有效的日本血吸虫疫苗侯选分子。方法 以旋毛虫感染鼠血清为探针,筛选日本血吸虫成虫cDNA文库,对获得的阳性克隆插入片段进行PCR扩增。结果 共筛选出11个阳性克隆,其插入的cDNA片段大小在1．4－5．0kb之间,其中1．4kb片段2个,5．0kb片段9个。结论 获得的阳性在隆插入基因片段可能为编码旋毛虫与日本血吸虫共同的抗原基因,其表达产物可能有抗日本血吸虫感染的作用。     

日本血吸虫三个新跨膜蛋白基因的克隆和分析

目的　克隆并分析日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)新的抗原基因 ,为血吸虫病防治提供有效的疫苗候选分子。方法　以旋毛虫感染鼠血清为探针 ,筛选Sj成虫cDNA文库 ,对获得的阳性克隆进行PCR鉴定及测序。通过互联网对测序获得的核苷酸序列进行同源性分析 ,并预测新基因编码蛋白质的结构与功能。结果　共筛选出 9个阳性克隆 ,其插入SjcDNA片段大小在 0 .6～ 2 .1kb之间。测序分析获 5个新基因 ,其中Sj Ts1,Sj Ts3及Sj Ts5 (登录号为AY0 0 5 816 ,AF2 990 80 ,AY0 2 4 35 2 )分别编码 83,83,2 33个氨基酸组成的跨膜蛋白。Sj Ts1蛋白含 1个潜在的跨膜区 ,2个蛋白激酶C磷酸化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点和 1个N 肉豆蔻酸化位点。Sj Ts3蛋白含两个跨膜区 ,1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。Sj Ts5蛋白为具有 5个跨膜区的跨膜蛋白 ,含 1个N 糖基化位点、2个cAMP与cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点、4个蛋白激酶C磷酸化位点、1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和 1个N 肉豆蔻酸化位点。结论　Sj Ts1、Sj Ts3与Sj Ts5基因编码的蛋白质均为受磷酸化激活控制的跨膜蛋白 ,可能为潜在的血吸虫病疫苗候选分子     

旋毛虫新生幼虫cDNA文库的免疫筛选

目的　获取具有抗原性的旋毛虫新生幼虫基因。　方法　以旋毛虫感染猪血清为抗体探针,对旋毛虫新生幼虫cDNA文库进行免疫筛选,将获得的阳性克隆进行测序及分析。结果　从45×105旋毛虫新生幼虫cDNA文库重组子中共获得158个阳性克隆。序列分析结果表明,其中有36个新的cDNA序列,已报道的序列有5个,有12个序列无开放阅读框架(ORF),与旋毛虫线粒体基因组DNA同源。　结论　获得具有抗原性的旋毛虫抗原编码cDNA分子     

日本血吸虫肌动蛋白轻链基因的获得和分析

目的运用表达序列标签(expressedsequencetag,EST)技术,从日本血吸虫成虫cDNA文库中筛选和鉴定日本血吸虫新基因,为寻找日本血吸虫新的候选疫苗奠定基础。方法转化日本血吸虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,获得EST;用NCBI站点的GenBank对所获得的新基因序列进行同源性检索;利用BLAST程序对同源性高的基因进行核苷酸和氨基酸水平的同源性比较;并利用pcgene软件对其蛋白质结构进行初步分析。结果发现xzw00081克隆的cDNA序列为日本血吸虫新基因并获得GenBank登录号(AY225851)。该cDNA序列与曼氏血吸虫肌动蛋白轻链基因高度同源,核苷酸水平的同源性为84%;氨基酸水平的同源性为86%;编码蛋白的理论相对分子质量为1053888,等电点为696;抗原表位可能位于氨基酸序列158～184处。结论用EST寻找日本血吸虫新基因是一种可行的方法,所筛选到的日本血吸虫新基因长374bp,编码88个氨基酸,与曼氏血吸虫肌动蛋白轻链基因高度同源,为进一步研究该基因的全序列及功能作准备。     

日本血吸虫亲环素A和乳酸脱氢酶编码基因的克隆及序列分析

目的　识别和克隆日本血吸虫新基因。方法　对本实验室获得的EST进行同源性分析 ,识别血吸虫新基因 ;根据EST设计引物 ,用锚着PCR法从cDNA文库中扩增出新基因全长cDNA ,并将其克隆入原核表达载体 pGEX - 4T - 1,用生物信息学技术对获得的编码基因进行结构与功能的分析。结果　EST同源性分析得到一个完整编码基因 ,开放阅读框(ORF) 4 95bp ,编码 16 4个氨基酸 ;锚着PCR法获得另一EST的 3’端所缺序列 ,得到完整编码阅读框 ,其ORF 999bp ,编码 332个氨基酸。利用生物信息学技术确定它们分别为日本血吸虫亲环素A(CyPA)和乳酸脱氢酶 (LDH)的编码基因。重组质粒经双酶切及测序鉴定证明日本血吸虫CyPA和LDH原核表达质粒构建成功。 结论　克隆到日本血吸虫亲环素A和乳酸脱氢酶编码基因的全长cDNA ,为进一步的功能研究打下了基础     

H9N2亚型禽流感病毒纤突蛋白基因的分析

目的　克隆禽流感病毒A/Chicken/Guangxi/KMⅢ / 99(H9N2 )纤突蛋白血凝素基因和神经氨酸酶基因 ,并与同一亚型不同毒株的病毒进行比较。方法　本研究以自行设计的引物 ,一次性成功地扩增出KMⅢ毒株HA和NA全长基因cD NA ,并将它们克隆和测序。以获得的核苷酸序列和氨基酸序列与其它毒株的HA蛋白和NA蛋白比较。结果　HA基因由16 83bp组成 ,编码 5 6 0个氨基酸 ;NA全基因为 14 0 7bp、编码 4 6 9个氨基酸残基 ;HA1羧基端的氨基酸组成是 :R -S -S -R ,符合低致病力毒株的分子特征。它们的氨基酸组成虽有差异 ,但与血凝素和神经氨酸酶功能关系密切的氨基酸残基却高度保守。联机检索表明 ,KMⅢ的HA基因cDNA与其它H9N2亚型HA基因最大同源性在 82 %～ 96 %之间。NA基因cDNA与其它H9N2亚型NA基因的最大同源性在 88%～ 97%之间。结论　我们首次克隆和测序了KMⅢ毒株的HA基因和NA基因 ,并对它们进行了分析     

旋毛虫成囊前期幼虫编码31kDa抗原基因的分子克隆及序列分析

目的　克隆旋毛虫河南株成囊前期幼虫编码 31kDa抗原基因 (TspE1)片段 ,并测定其基因序列 ,以了解该基因序列与已报道虫株的差异。方法　根据TspE1基因已知序列设计合成一对引物 ,采用RT -PCR技术获取旋毛虫成囊前期幼虫目的基因 ,PCR产物经纯化后用BamHⅠ、HindⅢ进行双酶切 ,定向克隆入pC18质粒 ,转化大肠杆菌JM10 9;重组质粒用BamHⅠ +HindⅢ酶切及PCR扩增鉴定。用Sanger双脱氧链终止法进行DNA序列测定 ,应用DNASIS软件进行同源性比较及预测抗原表位。结果　RT -PCR扩增获得成囊前期幼虫TspE1基因 (约 870bp) ,EcoRⅠ酶切鉴定正确 ;筛选出 7个阳性克隆 ,对目的基因的测序结果显示有 5种类型 ,但都与GenBank中的TspE1基因序列及由其推测的氨基酸序列有较高同源性 ,尤其是Ts HN3核苷酸及氨基酸序列同源性分别达 99 6 %和 98 9% ;TspE1基因中可能存在 7个抗原表位。 结论　应用RT -PCR技术扩增出旋毛虫河南株成囊前期幼虫编码 31kDa抗原结构基因 ,证实TspE1基因在成囊前期幼虫已有表达 ;结果还提示在旋毛虫河南株之间可能存在有遗传多态性     

cDNA clone for the heavy chain of the human B cell alloantigen DC1: strong sequence homology to the HLA-DR heavy chain.

A cDNA library has been constructed from a B cell mRNA fraction enriched for HLA-DR sequences, and cDNA clones corresponding to sequences specifically expressed in B lymphocytes have been isolated by a differential screening procedure. Analysis of these clones with probes specific for the HLA-DR heavy chain gene allowed the characterization of HLA-DR heavy chain-related sequences. One clone, pDCH1, was demonstrated to encode the DC1 heavy chain because the amino acid sequence predicted from its nucleotide sequence matches eight out of nine residues available for comparison in the amino-terminal sequence of the DC1 heavy chain. The heavy chain of the DC1 alloantigen is composed of 232 amino acids and can be divided into two external domains, alpha 1 (amino acids 1-87) and alpha 2 (amino acids 88-181), a connecting peptide (amino acids 182-194), a hydrophobic transmembrane region (amino acids 195-217), and an intracytoplasmic region (amino acids 218-232). Comparison with the HLA-DR heavy chain reveals strong sequence homology in the second external Ig-like domain (alpha 2) and the transmembrane region. In contrast, the first external domain, the connecting peptide, and the intracytoplasmic region are less conserved.     

华支睾吸虫表膜相关蛋白基因的扩增、序列分析和克隆

目的识别华支睾吸虫新基因,并将所发现的华支睾吸虫表膜相关蛋白(tegumental protein ofClonorchis sinensis,CsTP)的cDNA序列克隆到原核载体中,为进一步的研究奠定基础。方法对华支睾cDNA质粒文库进行随机筛选并测序,用在线生物信息学工具进行序列分析,识别CsTP基因,并对其进行同源性、物理性质及结构分析。设计引物,从华支睾cD-NA质粒文库中扩增目的基因cDNA序列,并构建原核重组质粒,相同引物从华支睾吸虫基因组中扩增出CsTP的DNA序列。结果发现CsTP基因,其cDNA完整阅读框含555个碱基,编码184个氨基酸,理论分子量为20.7kDa;其DNA序列含1393个碱基,含有3个外显子、2个内含子。序列分析表明,CsTP蛋白与其它物种的表皮蛋白或膜相关蛋白有一定的同源性。所构建的重组原核表达质粒PGEX-4T-1-CsTP经PCR、双酶切及测序证实与目的基因相符。结论发现华支睾吸虫表膜相关蛋白基因,成功构建其重组原核表达质粒为进一步研究该基因的功能提供了条件。