天麻钩藤饮抗大鼠视神经夹伤模型视网膜神经节细胞凋亡作用的实验研究

目的 观察天麻钩藤饮对视神经夹伤模型大鼠视网膜神经上皮层厚度和视网膜神经节细胞（RGC）凋亡的影响。设计 实验研究。研究对象 SPF级雄性Wistar大鼠48只。方法 将大鼠随机分6组,每组8只,分别为正常对照组,阴性对照组,天麻钩藤饮低剂量组（0.6 g/ml）、中剂量组（1.2 g/ml）、高剂量组（2.4 g/ml）和银杏叶片阳性对照组（1.2 mg/ml）,除正常对照组大鼠不做处理,其他组大鼠右眼均建立视神经夹伤模型,正常对照组和阴性对照组给予纯净水灌胃。于给药30天处死动物取眼球,做石蜡切片HE染色,观察各组视网膜神经上皮层厚度,TUNEL法检测RGC的凋亡程度。主要指标 HE染色视网膜神经上皮厚度及RGC凋亡数量。结果 阴性对照组（171.04±13.86 μm）比正常组（208.98±8.46 μm）视网膜神经上皮厚度显著减少（P=0.000）。而天麻钩藤饮中、高剂量组大鼠视网膜厚度（分别为187.68±11.16 μm 和189.22±9.54 μm）比阴性对照组显著增加（P=0.043,0.001）,且中、高剂量组与阳性对照组（191.35±9.03 μm）之间无显著差异（P=0.052,0.670）;TUNEL凋亡检测发现,阴性对照组凋亡细胞数（9.09±2.24个/高倍视野）比正常组（0.59±0.61个/高倍视野）明显增加（P=0.000）,中剂量组、高剂量组和阳性对照组RGC的凋亡（分别为7.00±1.88, 5.22±2.05, 5.03±2.03个/高倍视野）均比阴性对照组显著减少（P=0.024, 0.000,0.000）。结论 天麻钩藤饮对大鼠视神经夹伤模型具有一定抗RGC凋亡的作用,随药物浓度的升高,抗凋亡作用更显著。     

高糖对体外培养视网膜Müller细胞自噬及凋亡的影响

目的：探究高糖诱导体外培养的视网膜Müller细胞自噬及凋亡的变化。方法：实验研究。将体外培养的SD大鼠视网膜Müller细胞根据不同糖浓度分为5.5 mmol/L葡萄糖组（正常组）及20、30、40、 50 mmol/L高糖组,并对40 mmol/L高糖处理Müller细胞组采用不同时间3、6、12、24、36 h进行培 养。使用蛋白免疫印迹法及细胞免疫荧光检测自噬指标LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、自噬信号通路P62、Beclin-1 蛋白表达及细胞定位;使用透射电镜及GFP-LC3慢病毒转染观察自噬小体的形成情况;使用TUNEL 实验检测细胞凋亡状态。不同组别间数据比较采用单因素方差分析。结果：正常组及20、30、40、 50 mmol/L高糖组中Müller细胞质的Beclin-1、P62及LC3Ⅰ/LC3Ⅱ蛋白相对表达量总体比较,差异均有 统计学意义（F=131.21,P=0.029;F=197.25,P=0.012;F=100.02,P=0.045）,其中与正常组比较各浓 度高糖组Müller细胞质内Beclin-1、LC3Ⅰ/LC3Ⅱ蛋白均明显降低（P<0.05）,P62蛋白相对表达量明显 增加（P<0.001）。正常组以及6、12、24、36 h高糖组中Müller细胞质的Beclin-1、P62及LC3Ⅰ/LC3Ⅱ 蛋白相对表达量总体比较,差异均有统计学意义（F=98.46,P=0.015;F=109.48,P=0.004;F=99.27, P=0.032）,其中6 h高糖组LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白明显增加（P=0.002、0.015）,12、24、36 h高糖组与正常组相比较LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白均明显下降（P<0.05）,P62蛋白明显增加（P<0.001）。 正常组及6、24 h高糖组视网膜Müller细胞中GFP-LC3转染阳性颗粒、自噬小体相对数量组间总体差 异有统计学意义（F=240.49,P=0.014;F=198.98,P=0.001）,其中与正常组比较,6 h高糖组GFP-LC3 转染阳性颗粒、自噬小体相对数量增加（P=0.002、0.029）,24 h高糖组明显降低（P=0.019、0.036）。 正常组及6、24 h高糖组及3MA组视网膜Müller细胞凋亡指数分别为3.14±1.01、15.34±3.87、 25.82±4.96、24.79±4.01,总体比较差异有统计学意义（F=234.12,P=0.003）,与正常组比较,6、24 h 高糖组TUNEL阳性细胞增多（P=0.022、0.039）,24 h高糖组与6 h高糖组比较TUNEL 阳性细胞进一 步增加（P=0.017）。结论：高糖诱导体外培养的视网膜Müller细胞早期自噬增加,细胞凋亡抑制,随着时间不断延长,高糖抑制自噬形成,增加细胞凋亡。高糖抑制自噬可能是促进Müller细胞凋亡的重要原因。     

经瞳孔温热疗法对急性高眼压大鼠视网膜神经节细胞的保护作用

目的研究低阈值经瞳孔温热疗法（TTT）对急性高眼压大鼠视网膜神经节细胞（RGC）是否具有保护作用。设计实验研究。研究对象BN大鼠。方法采用810nm二极管激光机对10只大鼠视网膜进行热刺激，照射光斑1．2mm，能量50mW，照射时间20s，干预后3d光镜下观察视网膜形态结构的改变，免疫组化方法检测HSP70、HSP27在视网膜组织表达。采用上述激光参数，照射视网膜后3d，制作急性高眼压模型（TTT＋I/R组，n=10），采用TUNEL法检测RGC层细胞凋亡数量，及计数高倍镜下RGC层细胞数，与未干预的急性高眼压模型组（I/R组，n=10）、单纯TTT干预组（TTT组）及正常对照组（n=6）进行比较。主要指标免疫组化染色RGC细胞数及RGC层细胞凋亡数。结果采用低阈值TTT可诱导BN大鼠视网膜神经节细胞HSP70及HSP27表达，且光镜下未出现明显视网膜脉络膜形态的改变。TTT＋I／R组RGC层细胞凋亡数量明显少于I／R组（P=0．048），且前者RGC层细胞数量明显多于后者（辟0．016）；TTT组与正常对照组比较RGC层细胞凋亡数量无显著性差异（P=0．882），但RGC层细胞数明显少于正常对照组（P=0．001）。结论低阈值TTT可诱导BN大鼠视网膜HSP70、HSP27表达，并在急性高眼压损伤下对大鼠RGC凋亡具有抑制作用。（眼科，2007,16：48—51）     

Raf-1激酶抑制蛋白(RKIP)对糖尿病大鼠视网膜神经损伤的保护作用

目的　探讨Raf-1激酶抑制蛋白(raf-1 kinase inhibitory protein,RKIP)通过p38-MAPK通路对糖尿病(DM)大鼠视网膜神经损伤的保护作用。方法　雄性SD大鼠48只,采用随机数字表法将大鼠分为对照组、空白组、糖尿病组、RKIP组,每组12只;空白组、糖尿病组和RKIP组大鼠腹腔注射链脲佐菌素建立DM模型。RKIP组和空白组于模型建成第2周玻璃体内分别注射携带RKIP基因片段重组慢病毒(LV-RKIP)和等量空白病毒,对照组和糖尿病组注射等量生理盐水。注射10周后利用Western blot和免疫荧光化学检测各组RKIP、p38丝裂原激活蛋白激酶(p38-mitogen-activated protein kinase,p38-MAPK) 、胶质细胞谷氨酸转运体(L-glutamate/L-asparate transporter,GLAST)和谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)在视网膜中的表达,HE染色检测各组视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)密度。结果　与对照组相比,糖尿病组p38-MAPK表达升高,RKIP、GLAST、GS表达下降,RGC密度减少(均为P<0.01);与糖尿病组相比,空白组各指标差异均无统计学意义(均为P>0.05),RKIP组p38-MAPK表达降低,RKIP、GLAST、GS表达升高,RGC密度增多(均为P<0.01)。结论　糖尿病视网膜病变早期注射RKIP可降低视网膜细胞中p38-MAPK表达量,提高GLAST、GS表达活性,改善Müller细胞功能,减少RGC损害,提示RKIP对糖尿病视网膜病变中视网膜神经细胞具有保护作用。     

色素上皮衍生因子对糖尿病大鼠视网膜谷氨酰胺合成酶表达的影响

目的　观察色素上皮衍生因子（PEDF）对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞谷氨酰胺合成酶（GS）表达的影响。方法　将Sprague-Dawley大鼠分为模型组、模型对照组、PEDF干预组（干预组）、干预对照组,每组均为8只大鼠。模型组、干预组、干预对照组大鼠链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠模型。模型组大鼠不作任何干预,模型对照组为相同月龄的正常大鼠,干预组大鼠左眼玻璃体腔注射0.1 μg/μl的PEDF 10 μl,干预对照组大鼠左眼玻璃体腔注射相同容积的磷酸盐缓冲液。采用免疫组织化学法和实时荧光聚合酶链反应（PCR）法检测视网膜GS和白细胞介素-1β（IL-1β）的表达变化。将视网膜Müller细胞置于高糖环境下培养,实验干预组中加入100 ng/ml PEDF,空白对照组加入相同容积的培养液,24 h后通过蛋白质免疫印迹（Western blot）法和实时荧光PCR法检测PEDF对Müller细胞GS和IL-1β表达的改变。流式细胞仪锚定蛋白-异硫氰酸荧光素和碘化丙啶（Annexin V-FITC-PI）双染色法检测100ng/mlPEDF对高糖状态下Müller细胞凋亡的影响。结果　实时荧光PCR法从基因水平和免疫组织化学法从蛋白质水平检测均显示,相对于模型对照组大鼠,模型组大鼠视网膜GS表达降低,而IL-1β的表达升高,实时荧光PCR法：GS: t=4.23, P＜0.01;IL-1β: t=16.73,P＜0.01;免疫组织化学法：GS:t=5.13,P＜0.01;IL-1β: t=9.32, P＜0.01;干预组大鼠玻璃体腔注射PEDF 48 h后,IL-1β的表达下降,GS的表达升高,与干预对照组比较,实时荧光PCR法：GS: t=3.87,P＜0.01;IL-1β: t=3.61,P＜0.05;免疫组织化学法：GS:t=3.32, P＜0.05;IL-1β: t=2.63, P＜0.05。在高糖环境下,通过实时荧光PCR法和Western bot 法检测均显示PEDF可以下调IL-1β的表达,而上调GS的表达,与空白对照组比较,实时荧光PCR法：GS: t=2.89, P＜0.05;IL-1β: t=3.37, P＜0.05;Western blot：GS: t=2.66, P＜0.05;IL-1β: t=3.23, P＜0.05。流式细胞仪检测结果显示,PEDF可以抑制高糖环境下Müller细胞的凋亡,实验组凋亡率与空白对照组凋亡率比较,差异有统计学意义(t=3.21,P＜0.05)。结论　对于糖尿病大鼠,PEDF可能通过下调视网膜Müller细胞中IL-1β的表达来上调GS的表达,从而改善谷氨酸循环,抑制神经节细胞的死亡      

小干扰RNA保护大鼠视网膜神经节细胞的实验研究

 目的 通过大鼠视神经夹伤模型,研究小干扰RNA（siRNA）对视网膜神经节细胞（RGC）的保护作用。设计 实验研究。 研究对象 SPF级SD大鼠54只。方法 54只SD大鼠随机分为A、B、C三组,每组18只。均选取右眼为实验眼,左眼为正常对照。在球后2 mm处用40 g压力微型视神经夹夹持视神经60 s,做视神经夹伤模型。建立模型后当天,A、B、C三组分别给予玻璃体注射10 μg、20 μg siRNA和生理盐水。视神经夹伤后10天,每组取6只大鼠用荧光金做逆行标记,14天时取标记后的大鼠双眼眼球标本做视网膜铺片并拍摄照片,RGC计数。计算RGC存活率（右眼RGC数/左眼RGC数×100%）。每组其余12只大鼠进一步用蛋白印迹法检测视网膜组织中caspase-3蛋白的表达水平。主要指标 RGC存活率,caspase-3蛋白的表达水平。结果 A、B、C组RGC存活率分别为53.63%±7.35%、57.86%±6.00%、45.00%±4.37%（F=7.11,P=0.029）,其中A组与C组（P=0.025）,B组和C组（P=0.002）之间均有显著性差异;A 组和B组之间无显著性差异（P=0.24）。A、B、C三组视网膜组织中Caspase-3蛋白与内参灰度比值分别为0.20±0.02、0.19±0.02、0.24±0.03（F=9.73,P=0.02）。其中A组与C组（P=0.005）,B组和C组（P=0.001）之间均有显著性差异;A 组和B组之间无显著性差异（P=0.418）。结论 小干扰RNA能有效保护大鼠视神经夹伤模型的RGC,提高RGC的存活率。     

APP17肽对糖尿病视网膜神经元表达NT-3和星形胶质细胞增殖的影响

目的　观察糖尿病早期视网膜神经元表达 NT- 3和星形胶质细胞增殖情况 ,并观察 APP17肽的作用。方法　用链脲佐菌素 (streptozotocin,STZ)复制 Wistar大鼠糖尿病模型 ,于模型建立 2周后 ,皮下注射 APP17肽 ,1月后处死大鼠取视网膜 ,进行神经免疫组化 ,观察 APP17肽对糖尿病早期视网膜神经元中神经营养因子 3(neurotrophin- 3,NT- 3)和星形胶质细胞中胶质原纤维酸性蛋白 (glial fibrillary acidi protein,GFAP)表达的影响。结果　同正常对照组相比模型组 (DM组 )视网膜神经元 NT- 3阳性细胞数明显减少 ,但APP17+DM组阳性细胞数多于 DM组 (P<0 .0 1) ,并且对照组与 APP17+DM组中星形胶质细胞 GFAP阳性数少于 DM组 (P<0 .0 1)。结论　在糖尿病视网膜病变早期存在视网膜神经细胞 NT- 3表达减少及星形胶质细胞增生 ,APP17肽可明显改善早期糖尿病大鼠视网膜神经元的表达 ,提示对神经视网膜具有保护作用     

褪黑素通过Müller细胞保护糖尿病视网膜神经节细胞的机制

目的　探讨褪黑素对糖尿病视网膜Müller细胞的影响及其对视网膜神经节细胞的保护作用。方法　SD大鼠54只随机分为对照组、糖尿病组和褪黑素治疗组，糖尿病组和褪黑素治疗组制造糖尿病模型。造模后，对照组和糖尿病组大鼠腹腔注射体积分数10%乙醇溶液，褪黑素治疗组大鼠腹腔注射褪黑素溶液（10 mg·kg^-1）。3个月后，试剂盒检测视网膜中丙二醛（malondialdehyde，MDA）和还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）的含量，Western blot检测视网膜中神经胶质酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）及谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）的表达变化，免疫组织化学染色观察GFAP阳性染色的空间分布并进行定量分析，高效液相色谱检测视网膜中谷氨酸含量变化，HE染色计数视网膜神经节细胞密度。结果　对照组及褪黑素治疗组GFAP免疫阳性染色主要局限于视网膜神经纤维层，而糖尿病组GFAP阳性染色几乎贯穿视网膜全层。与对照组相比，糖尿病组视网膜MDA含量增加而GSH含量减少，GFAP表达增加而GS表达减少，谷氨酸含量增加，视网膜神经节细胞密度明显下降（均为P<0.01）。褪黑素治疗组与对照组各指标相比差异均无统计学意义（均为P>0.05）。结论　褪黑素能抑制糖尿病视网膜的氧化应激反应，恢复视网膜Müller细胞功能酶GS的含量，减少视网膜内谷氨酸堆积，保护视网膜神经节细胞。     

糖尿病大鼠早期视网膜小胶质细胞活化与神经节细胞损害的关系

目的　观察糖尿病早期视网膜小胶质细胞的活化特征与视网膜神经节细胞（RGC）损害的关系。方法　20只成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠,采用链脲佐菌霉素腹腔注射方法制作糖尿病动物模型,分为糖尿病1、3个月组及相应正常对照组,每组5只大鼠。对所有大鼠行上丘定位注射逆行标记RGC,分别用免疫组织化学法标记视网膜铺片、冰冻切片小胶质细胞和RGC,共聚焦显微镜下观察小胶质细胞细胞形态及分布特征。结果　糖尿病组视网膜铺片小胶质细胞胞体增粗,形态不规则。与对照组相比,糖尿病3个月组RGC层发生吞噬的小胶质细胞密度显著增加（t=3.83,P＜0.01）。与对照组相比,糖尿病大鼠1、3月个组RGC层小胶质细胞平均密度均显著增加（t=2.71,4.22;P＜0.05）;糖尿病大鼠3个月组RGC层小胶质细胞平均密度较糖尿病1个月组显著增加（t=7.45,P＜0.0001）。糖尿病早期小胶质细胞与RGC数量之间存在相关关系（r=0.9,P＜0.05）。结论　糖尿病早期小胶质细胞活化与RGC损伤关系密切。     

牛磺酸对高糖刺激大鼠视网膜Müller细胞GLAST和GS表达的影响

目的:通过检测牛磺酸对高糖刺激大鼠视网膜Müller细胞谷氨酸转运蛋白(glutamate-aspartate transporters,GLAST)和谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)表达的影响,探讨牛磺酸保护糖尿病引起视网膜损伤的机制。方法:高糖培养大鼠视网膜Müller细胞,分正常对照组(NC)、高糖组(high glucose,HG,25mmol/L)、高糖+0.1mmol/L牛磺酸(taurine,T)干预组(HG+0.1T)、高糖+1mmol/L牛磺酸干预组(HG+1T)、高糖+10mmol/L牛磺酸干预组(HG+10T)。用免疫荧光化学法和Western-blotting检测大鼠视网膜Müller细胞中GLAST和GS的表达。结果:高糖培养后,大鼠视网膜Müller细胞中GLAST和GS的表达明显减少(P<0.05),与高糖组相比,1mmol/L和10mmol/L牛磺酸干预可明显增加GLAST和GS的表达(P<0.05)。结论:牛磺酸增加Müller细胞中GLAST和GS的表达抑制糖尿病引起的视网膜Müller细胞功能改变。     

Müller细胞在视网膜损伤中对视神经节细胞影响的研究进展

Müller细胞是视网膜中主要神经胶质细胞，贯穿视网膜全层。尽管近年来针对Müller细胞功能的研究较多，但是Müller细胞和视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)的相互作用关系仍不完全清楚。目前已知生理状态下Müller细胞的许多功能和RGCs密切相关，例如Müller细胞已经证实为神经元祖细胞的来源，调节视网膜细胞间质K⁺水平和谷氨酸代谢，维持视网膜内能量代谢和营养支持等。在视网膜损伤时，Müller细胞相关功能对RGCs的影响也十分重要。因此，本文就此研究进展进行综述，以期为视网膜中视神经的保护治疗提供新的思路。     

缺氧对视网膜Müller细胞中谷氨酸转运体及未折叠蛋白相关因子XBP1、CHOP表达的影响

目的研究体外缺氧刺激后视网膜Müller细胞是否存在未折叠蛋白反应(unfol-dedprotein reaction,UPR),及其与L-谷氨酸/L-天门冬氨酸转运体(glutamate-aspartatetrans-porters,GLAST)的关系。方法出生3～7d大鼠视网膜组织采用胰蛋白酶消化法培养视网膜Müller细胞,氯化钴(CoCl2)200μmol·L-1对视网膜Müller细胞进行体外缺氧干预,干预时间为0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h;UPR诱导剂二硫苏糖醇(DTT)2mmol·L-1刺激视网膜Müller细胞为阳性对照,干预时间为0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h。采用实时荧光定量PCR检测GLAST与UPR相关因子X盒结合蛋白1、C/EBP同源蛋白的表达并分析其相关性。结果视网膜Müller细胞鉴定:细胞免疫荧光染色示90%以上细胞GS、GLAST表达阳性;流式细胞仪检测结果:Müller细胞的GLAST表达阳性率为(84.66±3.51)%。缺氧刺激后,GLAST与X盒结合蛋白1、C/EBP同源蛋白在Müller细胞上均有表达,缺氧早期呈上升趋势,干预后24h表达最强,后呈下降趋势。DTT干预组表达趋势与缺氧干预组一致。结论体外缺氧刺激后视网膜Müller细胞存在UPR,其相关因子的变化与GLAST的变化趋势一致,提示UPR可能是调控GLAST变化的原因之一。     

经瞳孔温热疗法对大鼠视神经钳夹视网膜神经节细胞的保护作用

目的探讨经瞳孔温热疗法（TTT）阈下反应对BN大鼠视神经钳夹后视网膜神经节细胞（RGCs）的保护作用。方法采用阈下TTT对BN大鼠视网膜进行照射后3d,通过逆行标记RGCs的方法,对TTT＋视神经钳夹组（A组）、TTT＋假手术组（B组）、单纯视神经钳夹组（C组）和空白对照组（D组）在视神经钳夹后1、2、4周进行RGCs计数并比较;检测视网膜TTT阈下反应的热休克蛋白70（HSP70）表达;观察TTT阈下反应对视网膜的影响。结果视神经钳夹后4周,A组RGCs数显著高于C组（P=0.006）,而1周和2周时2组之间差异无统计学意义（P〉0.05）;各时间点B组和D组的RGCs数差异无统计学意义（P〉0.05）。视网膜经阈下TTT干预后,HSP70表达高于对照眼。阈下TTT照射能引起视网膜组织形态上的改变。结论阈下TTT可显著提高视神经钳夹4周后RGCs的存活数量;其保护机制可能与诱导视网膜内源性HSP70表达、启动内源性保护机制有关。     

PI3K/Akt信号通路对高糖状态下视网膜Müller细胞的影响

目的　探讨PI3K/Akt信号通路对高糖状态下视网膜Müller细胞的影响及机制。方法　本实验分两部分,动物实验:雄性SD大鼠随机分成对照组、糖尿病组、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factors-1,IGF-1)组、IGF-1+LY294002(PI3K/Akt信号通路抑制剂)组。后三组采用链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)(50 mg·kg^-1)诱导成为糖尿病模型。模型诱导成功后,IGF-1组给予IGF-1 (80 g·L^-1) 5 μL玻璃体内注射给药,IGF-1+LY294002组给予5 μL(IGF-1+ LY294002)(80 μg·L^-1)玻璃体内注射给药。细胞实验:对培养的Müller细胞进行不同处理,分为对照组(空白对照)、高糖组(30 mmol·L^-1葡萄糖)、IGF-1组(30 mmol·L^-1葡萄糖+80 μg·L^-1 IGF-1)、IGF-1+LY294002组［30 mmol·L^-1葡萄糖+80 μg·L^-1(IGF-1+ LY294002)］。HE染色检测大鼠视网膜内核层(inner nuclear layer,INL)细胞密度,免疫荧光染色检测大鼠视网膜神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acid protein,GFAP)表达及Müller细胞Caspase-3表达,TUNEL染色检测细胞凋亡情况,Western blot检测p-Akt、NF-κB、Caspase-3蛋白相对表达水平。结果　动物实验中,与对照组相比,糖尿病组及IGF-1+LY294002组GFAP表达均明显增加,INL细胞密度均明显降低(均为P<0.05);与糖尿病组相比,IGF-1组GFAP表达明显下降,INL细胞密度明显增加(均为P<0.05)。细胞实验中,与对照组相比,高糖组及IGF-1+LY294002组细胞凋亡率和NF-κB、Caspase-3蛋白相对表达水平均明显增加,p-Akt蛋白相对表达均明显降低(均为P<0.05);而与高糖组相比,IGF-1组细胞凋亡率、NF-κB及Caspase-3蛋白相对表达均明显下降,p-Akt蛋白相对表达明显增加(均为P<0.05)。结论　激活PI3K/Akt通路可对抗高糖状态下视网膜Müller细胞凋亡,其机制可能与下调NF-κB、Caspase-3蛋白表达有关。     

胶质纤维酸性蛋白在青光眼大鼠视网膜神经胶质细胞中的表达

目的:探讨胶质纤维酸性蛋白(GFAP)在青光眼大鼠视网膜Müler细胞上的诱导表达情况及可能的意义。方法:采用烧灼涡静脉的方法制作大鼠青光眼模型,分别于术后2h;1,3d;1,2,3wk取材,制作视网膜矢状位冰冻切片和视网膜铺片,进行GS/GFAP免疫荧光双标。提取视网膜总蛋白行GFAP免疫印迹半定量分析。结果:视网膜矢状位切片可见,正常大鼠视网膜中,GFAP阳性染色只出现在神经节细胞层的星形胶质细胞上,而Müller细胞不表达GFAP。制作青光眼模型术后2h,Müller细胞上出现GFAP阳性染色,术后1,3d,GFAP的表达显著增加,到术后1wk,GFAP在Müller细胞上的表达量达到高峰,一直持续到术后3wk,免疫印迹半定量分析与以上结果吻合。术后1wk视网膜铺片中清晰可见Müller细胞足板出现GFAP的诱导表达。结论:高眼压时GFAP在Müller细胞上的诱导表达尤其在足板处的强烈表达是Müller细胞对眼压升高产生的一种反应,GFAP可能是一种潜在的有用的生物标记物。     

In vivo expression of neurotrophins and neurotrophin receptors is conserved in adult porcine retina in vitro

PURPOSE. To characterize and compare the expression of neurotrophins (NTs) and their receptors within adult porcine retinal ganglion cells (RGCs) in vivo and in vitro. METHODS. The distribution of nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), neurotrophin-3 (NT-3) and -4 (NT-4), and their high-affinity receptors TrkA, TrkB, TrkC and low-affinity receptor p75, was analyzed in adult porcine retinal sections by immunohistochemistry. In addition, adult porcine retinas were dissociated and cultured in four different conditions: control, semipure RGCs, supplemented with BDNF, or seeded on Müller glia feeder layers. Double immunostaining was performed with antibodies to NTs or their receptors combined with neurofilament antibody to identify RGCs in culture. RESULTS. In vivo, immunolabeling of NGF was very faint, BDNF was especially prominent in RGCs and inner nuclear layer cells, NT-3 stained widespread nuclei, and NT-4 was undetectable. TrkA immunoreactivity was visible in the nerve fiber layer, TrkB staining was within RGC bodies, TrkC was undetectable, and p75 was widely expressed across the retina, within the Müller glia. Expression of neurotrophins and their receptors was maintained in all four models of adult RGCs in vitro, showing that expression was not influenced by substrate or culture conditions. We observed prominent staining of TrkA within growth cones, and a clear expression of p75 within a subpopulation of RGCs in vitro. CONCLUSIONS. These findings demonstrate that the expression of NTs and their receptors within adult porcine RGCs is maintained in vitro, under conditions of limited interaction with neighboring neurons and deprived of afferent inputs and target tissue. TrkA may be involved in regeneration of nerve terminals.     

水通道蛋白4基因对慢性高眼压小鼠视网膜中胶质纤维酸性蛋白表达的调控

背景 本课题组先前的研究发现,神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）在慢性高眼压模型小鼠视网膜星形胶质细胞和Müller细胞中表达增加,这一改变与视网膜神经节细胞（RGCs）的改变及疾病的发生及发展密切相关.水通道蛋白4（AQP4）在视网膜主要存在于神经胶质细胞中,青光眼发病过程中AQP4与GFAP表达的关系尚不清楚. 目的 研究慢性高眼压状态下AQP4基因在慢性高眼压情况下是否能够调控视网膜神经胶质细胞中GFAP的表达,探讨AQP4基因在青光眼RGCs损害中的作用.方法 利用小鼠巩膜外静脉烧烙法（烧烙静脉3～4支）建立雄性小鼠AQP4基因敲除（AQP4-/-）小鼠及其同背景雄性野生型（WT）小鼠左眼慢性高眼压模型,均取右眼作为对照眼.选择造模成功的两种小鼠各30只,分别于术后1、3、7、14和28 d各取6只小鼠用Icare回弹式眼压计测量小鼠眼压,分别于相应时间点分离取小鼠视网膜,通过Western blot 法检测AQP4-/-小鼠及WT小鼠视网膜神经胶质细胞中GFAP水平的变化,用t检验、三因素方差分析及SNK-q检验分析实验数据.结果 造模后1、3、7、14和28 d,AQP4-/-小鼠实验眼眼压均明显高于对照眼,差异均有统计学意义（t=15.29、16.02、13.77、14.34、12.40,均P＜0.05）;上述各时间点WT小鼠实验眼眼压均明显高于对照眼,差异均有统计学意义（t=17.65、14.91、15.97、13.41、12.53,均P＜0.05）.正常情况下AQP4-/-小鼠与WT小鼠视网膜组织中均有GFAP表达,WT小鼠对照眼、实验眼造模后1、3、7、14和28 d,视网膜中GFAP的表达量（GFAP/β-actin）分别为1.00±0.00、1.99 ±0.29、4.05±0.69、4.47±0.48、3.21±0.35、3.25±0.53;AQP4-/-小鼠对照眼、实验眼术后1、3、7、14和28 d视网膜中GFAP相对表达量（GFAP/β-actin）分别为1.00±0.00、1.69±0.31、2.27±0.55、2.79±0.39、1.93±0.31和1.54±0.40;造模后不同时间点小鼠视网膜中GFAP表达量差异有统计学意义（F=9.54,P＜0.05）,WT小鼠随着造模后时间的延长,视网膜总GFAP的表达量逐渐升高,而AQP4-/-小鼠视网膜中总GFAP的相对表达量逐渐下降,差异均有统计学意义（P＜0.05）.正常情况下WT小鼠与AQP4-/-小鼠视网膜组织中GFAP/β-actin差异无统计学意义（P＞0.05）,WT小鼠术后3、7、14和28 d视网膜中GFAP的表达值均显著高于AQP4-/-小鼠,差异均有统计学意义（t=4.51、7.95、6.12、5.76,P＜0.01）. 结论 慢性高眼压状态下AQP4基因可以上调小鼠视网膜神经胶质细胞中GFAP的表达,从而引起视网膜神经胶质细胞的活化,导致RGCs的损害.AQP4可能成为治疗青光眼的新靶点.