人大肠癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库的构建和鉴定

目的:为获得大肠癌的特异性抗原基因,构建人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库.方法:从2株人大肠癌细胞CCL-187和CX-1中提取总RNA,分离纯化mRNA,并以此为模板合成第1链cDNA,用置换法合成第2链cDNA.双链cDNA经末端削平、EcoR Ⅰ接头连接、Xho Ⅰ酶切、过柱分级分离,除去＜400 bp片段.收集符合需要的cDNA片段与噬菌体ZAP Express载体连接,体外包装后获得人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库.结果:构建的人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体文库,原始库容量为2.3×109 pfμ/L,重组率97%.重组子插入cDNA片段平均大小1 kb以上.结论:成功地构建高质量的人大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库,为大肠癌的特异性抗原筛选奠定了基础.     

藜草花粉变应原λ噬菌体cDNA表达文库的构建及初步鉴定

目的:构建藜草花粉变应原λ噬菌体cDNA表达文库,并进行初步鉴定.方法:用TRIzol试剂抽提藜草花粉总RNA并分离mRNA.以纯化的mRNA为模板,以含有Xho I内切酶位点和18 by的Poly(dT)序列的引物,用ZAP Express cDNA合成试剂盒反转录合成cDNA.将cDNA修饰、分级纯化后,获得大于400 by的cDNA片段.将带有黏性末端的双链ds cD-NA与Uni-ZAP XR载体连接,采用ZAP Express cDNA文库合成试剂盒利用λ噬菌体构建藜草花粉λ噬菌体cDNA表达文库,用包装蛋白对合成的ds cDNA进行体外包装,以包装产物感染宿主菌XL1-Blue MRF即获得cDNA表达文库.用PCR方法检测cDNA表达文库的滴度和插人片段的大小.结果:构建的藜草花粉变应原λ噬菌体表达文库的滴度为9.7×10(8)pfu/L,重组率为100%,库容量为4.85pfu.插人片段的长度平均约为1.0 kb.结论:构建的cDNA表达文库的容量及插人片段的大小合适,适用于藜草花粉变应原cDNA克隆的筛选,为制备基因重组藜草花粉变应原疫苗奠定了基础.     

鸡B淋巴细胞cDNA T7噬菌体表达文库的构建与鉴定

目的:构建鸡B淋巴细胞cDNAT7噬菌体表达文库并对文库质量进行鉴定。方法:利用oligo(dT)-纤维素亲和层析从SPF雏鸡法氏囊细胞制备mRNA,合成的双链cDNA定向克隆到T7EcoR I/HindIII载体臂,包装并构建cDNA表达文库。对文库进行滴度测定和重组子测定。扩增文库并进行PCR鉴定插入序列的长度及分布。结果:文库初始滴度为5×107pfu/mL,扩增后滴度达到1.88×1010pfu/mL。插入片段平均长度1440bp,主要分布在750～2000bp之间。结论:构建的鸡B淋巴细胞cDNAT7噬菌体表达文库具有很高的质量,为进一步研究鸡B细胞发育以及传染性法氏囊病毒(IBDV)的分子致病机制奠定了实验基础。     

小鼠巨噬细胞cDNA酵母表达文库的构建与鉴定

目的 采用Gateway技术构建适合酵母表达的小鼠巨噬细胞cDNA文库并进行鉴定.方法 将小鼠巨噬细胞的mRNA分离纯化后,以生物素标记的寡聚胸苷酸Oligo(dT)为引物反转录后连接attB衔接子(attB Adapter),层析柱纯化,通过BP重组反应将500 bp以上的片段克隆到含attP衔接子的pDONRTM222载体,电转化入ElectroMAXTM DH10BTMT1 Phage Resistant Cells,构建Gateway入门cDNA文库,并完全随机挑取单菌落,提取质粒酶切鉴定重组子插入片段大小.构建Gateway目的 载体,通过LR重组反应将入门文库转入此目的 载体成为酵母表达文库,挑取单克隆鉴定重组子插入片段大小.结果 经鉴定,入门文库平均滴度为(6.80±0.10)×105 cfu/ml,文库总容量为7.48×106 cfu,平均插入片段为(2.20±0.20)kb,重组率为100%.酵母表达文库平均滴度为(3.24±0.10)×106 cfu/ml,文库总容量为3.89×107 cfu,平均插入的片段为(2.27±0.15)kb,重组率为95.83%(23/24).结论 构建的小鼠巨噬细胞cDNA入门文库和酵母表达文库都符合高质量文库的要求,可用于进一步的研究.     

人类纤维化心脏瓣膜噬菌体表达文库的构建及质量分析

目的: 各种病因引起的心脏瓣膜纤维化是导致心脏瓣膜功能丧失的主要原因,样本来源有限和不可重获性是其分子机制研究的瓶颈。本研究旨在成功获取患者纤维化瓣膜的遗传信息物质,为探明瓣膜病变的分子机制提供直接证据。方法: 心脏换瓣手术中取纤维化瓣膜组织,提取高质量RNA,用SMART技术合成cDNA第1链,再用长距离PCR合成双链cDNA,经 Sfi I酶切后过柱分级收集长片段cDNA,经T4 DNA连接酶催化连接入λTriplEx2载体,最后经λ噬菌体包装后构建成原始文库,用PCR、X-gal等方法进行文库质量鉴定。 结果: 成功构建了纤维化心脏瓣膜噬菌体表达文库,原始文库滴度为8× 10⁹ pfu/L,重组率为99%,外源基因片段大小在500到3 000 bp之间,其中81.25%片段大于1 000 bp。 结论: 成功构建了高质量的人类纤维化心脏瓣膜噬菌体表达文库,该文库的库容量足够代表人类基因的复杂性,高重组率能保障功能筛选的高效性,长片段更有助于全长基因的获得和表达。     

人骨肉瘤9901细胞cDNA表达文库的构建和鉴定

目的:构建骨肉瘤9901细胞cDNA表达文库,为筛选骨肉瘤特异性抗原创造条件。方法:从9901细胞中提取总RNA,分离mRNA,反转录合成双链cDNA,末端削平,和EcoR I适配子连接。磷酸化EcoR I适配子5’端,过Sephacryl一S400柱除去小于400 bp的cDNA片段,与噬菌体λgt11(载体)连接,用包装蛋白体外包装后形成初级cDNA文库。取适量包装体系倍比稀释后感染E.coli Y1090,测定文库克隆数、重组率,用PCR法测定cDNA插入片段的大小。最后扩增cDNA文库。结果:建成含1.5×106个重组子的骨肉瘤9901细胞cDNA表达文库,重组率为94.3％。重组子中插入的外源片段不小于 0.5 kb,平均长约1.4 kb。结论:达到良好文库的质量标准,适合进一步筛选目的cDNA克隆。     

金仓鼠神经管cDNA文库的建立

目的　构建金仓鼠神经管cDNA文库,以筛选与神经管发育及神经管畸形发生相关的基因。　方法 　用TRIZOLReagent提取金仓鼠神经管总RNA;用LD PCR法反转录合成双链cDNA;经蛋白酶K消化、SfiⅠ酶切、 CHROMASPIN 400柱分离去除小于500bp的片段;将cDNA与载体λTriplEX2按一定比例连接;经体外包装,建立 cDNA的噬菌体表达文库。　结果　cDNA文库容量为1.5×106pfu ml,重组率为99%,平均插入片段大于1kb。　 结论　我们初步构建的金仓鼠神经管cDNA文库为高效的cDNA文库。     

应用抑制消减杂交技术构建结核分枝杆菌差异表达基因消减cDNA文库

目的:构建结核分枝杆菌H37Rv与H37Ra的差异表达基因消减文库,分离结核分枝杆菌差异表达cDNA片段.方法:利用抑制性消减杂交技术分析结核分枝杆菌强毒株H37Rv和弱毒株H37Ra的基因组mRNA的表达差异,并进行两轮消减杂交和两次PCR,将第二次PCR产物与pGEM-T载体相连,电击转化大肠杆菌E.coff DH5α进行文库扩增和蓝白斑筛选,RT-PCR承鉴定差异表达文库.结果:以结核分枝杆菌强毒株H37Rv的cDNA为检测子的正相杂交和以弱毒株H37Ra的cDNA为检测子的反相杂交各自高表达或特异性表达的片段都得到选择性扩增,成功构建了差异表达cDNA文库 A库和B库.所长出的菌落中90%为白色克隆,其中单一条带的克隆占75%和80%,片段大小集中在100～800 bp之间.结论:利用SSH技术成功构建了结核分枝杆菌强毒株H37Rv和弱毒株H37Ra差异表达基因消减cDNA文库,该消减文库的建立为进一步筛选、克隆这两种菌株之间差异表达的新基因奠定了基础.     

胃癌下调基因组cDNA抑制消减文库的建立及鉴定

目的 建立胃癌下调基因组cDNA抑制消减文库并鉴定。方法 采用高灵敏度的抑制消减杂交技术，建立五人份正常胃粘膜mRNA(Tester)抑制消减杂交胃癌mRNA(Driver)的差异表达文库，用PCR及差异表达克隆菌转膜反向杂交判定其消减效率。结果 所构建胃癌下调基因抑制消减杂交cDNA文库，消减效率高，胃癌下调基因在正常胃粘膜及胃癌组织中的差异表达符合率达86％。结论 成功建立了用于筛选胃癌下调基因的抑制消减杂交cDNA文库。     

白纹伊蚊T7噬茵体展示cDNA文库的构建

为筛选白纹伊蚊与相关蚊媒病毒相互作用的基因,本文构建了白纹伊蚊Aedes albopictusT7噬菌体展示eDNA文库,分离与纯化白纹伊蚊mRNA,所得mRNA经反转录合成双链cDNA后,在双链cDNA末端加上定向EcoRI／HindIn接头使其两端分别带EcoRI和Hind11I黏性末端;接着用MiniColumn纯化收集300bp以上的双链cDNA片段连接于T7 Select 10—3b载体;经体外包装后,以BLT5403为受体菌构建1v7噬菌体展示cDNA文库。所建文库的库容量经测定为1．7×10’pfu／mL,扩增后文库滴度为2．5×10^（15）pfu／mL。对从原始文库中随机挑取的50个噬菌斑进行PCR鉴定,重组率为95％以上;阳性克隆片段长度分布在200～2000bp,其中有90％的插入片段大于300bp。本文所构建的白纹伊蚊T7噬菌体展示cDNA文库,满足cDNA文库的基本要求,可以用于筛选白纹伊蚊与相关蚊病毒相互作用的基因。     

人高迁移率族蛋白B1原核表达及其高亲和噬菌体融合肽的筛选

目的 构建谷胱甘肽巯基转移酶（GST）标记的人高迁移率族蛋白B1（HMGB1）融合蛋白表达载体并在原核细胞中表达.应用噬菌体展示技术筛选HMGB1的高亲和肽.方法 用RT-PCR方法扩增HMGB1 cDNA,构建于原核表达载体pGEX4T-1并转化大肠杆菌,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导GST-HMGB1蛋白表达;Ni^2＋-NTA和多粘菌素B亲和层析柱进行纯化重组HMGB1蛋白.以重组HMGB1蛋白为靶分子,进行4轮噬菌体展示环七肽库的筛选,从第4轮洗脱物中随机挑选20个单克隆噬菌体扩增后进行ELISA鉴定,用酶标仪测定450 nm处的吸光度值.对获得的阳性单克隆噬菌体分别进行扩增、纯化,并对DNA测序,以确定插入七肽的氨基酸序列.结果 RT-PCR扩增HMGB1 cDNA大小约648 bp,成功构建了pGEX4T-1-HMGB1重组质粒并纯化了HMGB1蛋白,其相对分子质量为65000.经过4轮筛选后,噬菌体富集了74倍（第4轮与第1轮回收量分别为5.2×10^8、7.0×10^6 pfu）,随机挑取的20个噬菌体克隆中9个可与HMGB1结合,测序发现其中的6个序列一致,均为DYFVSSV.结论 筛选到1个可与HMGB1高亲和结合的噬菌体展示七肽,其对HMGB1活性的拮抗效应有待进一步阐明.     

日本血吸虫尾蚴cDNA文库的免疫学筛选及EST序列的分析

目的为获得日本血吸虫（Schistosoma japonicura，Sj）转化生长因子β1（TGF—β1）基因的部分或全长cDNA序列。同时验证用针对某一蛋白的抗体筛选表达文库是否可以得到相应蛋白对应的基因序列。方法采用兔抗鼠TGF—β1血清，对Sj尾蚴cDNA表达文库进行免疫学筛选，对阳性克隆进行PCR扩增后，将大于500bp的克隆进行复筛，对复筛阳性的克隆进行测序和生物信息学鉴定。结果对大约10^6个噬菌斑进行了初筛。共获得7个阳性克隆；经过PCR扩增后，其中有4个克隆大于500bp，复筛获得3个持续阳性克隆；对测序后的阳性克隆进行生物信息学鉴定，得到的三个克隆均与日本血吸虫辅酶Q10氧化还原酶（SjCHGC）基因具有高的同源性（Bhata分值都大于200）。结论SjCHGC蛋白与兔抗鼠TGF—β1抗体的反应为交叉反应，用抗某一蛋白的抗体筛选表达文库得到相应蛋白的基因序列的方法不一定可行。     

Polymerase chain reaction-based construction of cDNA libraries from minute amounts of third-stage and fourth- and fifth-stage larvae of Dictyocaulus viviparus

 A strategy is described for the amplification and cloning of cDNA from minute amounts of Dictyocaulus viviparus larvae. Initially, third-stage larvae (L3) were used to establish the procedure. Amplification of cDNA synthesized from approximately 400 ng total RNA from 5,000 L3 generated products that were more than 800 bp in length. The unidirectional cloning of amplified cDNA products led to the construction of a UNI ZAP cDNA library with 1×10⁶ clones. Screening with a homologous oligo(dT)-primed digoxigenin-labeled cDNA probe as well as sequencing of seven randomly picked clones confirmed the successful cloning of lungworm cDNA. Subsequently, approximately 600 ng total RNA was isolated and polymerase chain reaction (PCR) products of up to 2,400 bp were amplitied from 400 fourth- and fifth-stage larvae (L4/L5). Cloning of these products resulted in a L4/L5 cDNA library of D. viviparus consisting of 5×10⁵ recombinant clones. In all, 11 clones were randomly picked and sequenced, all revealing typical mRNA/cDNA characteristics. Comparison of the predicted amino acid sequence of the 5′ end of clone DvL5/7 revealed 100% homology with the actin gene of several other helminths. Received: 3 July 1996 / Accepted: 12 August 1996     

类风湿关节炎滑膜组织cDNA文库的构建及自身抗原的筛选和鉴定

目的 通过SEREX（serological analysis of recombinant cDNA expression library）技术对类风湿关节炎滑膜组织cDNA文库进行初步筛选,得到新的类风湿关节炎自身抗原.方法 利用SMART技术构建类风湿关节炎患者滑膜组织cDNA文库,并对该文库进行SEREX筛选,获得特异性结合阳性克隆,对阳性克隆同源性分析.然后进行酶联免疫吸附实验（ELISA）验证,分析该阳性克隆对于类风湿关节炎诊断临床敏感度和特异度.结果 构建cDNA文库滴度约为6.89×10^6 pfu/mL,筛选文库获得12个阳性克隆,同源性分析3个阳性克隆插入片段为已知蛋白,分别是：Filaggrin、SERPINE2和p68.进行血清学初步验证,抗-Filaggrin和抗-SERPINE2具有高敏感度和低特异度,而抗-p68具有高敏感度和高特异度.结论 抗-Filaggrin、抗-SERPINE2和抗-p68对于类风湿关节炎的诊断具有不同的敏感度和特异度.     

云南个旧肺鳞癌YTMLC-90细胞株cDNA文库构建和鉴定

目的 :构建云南个旧肺鳞癌YTMLC 90细胞株的cDNA文库。方法 :从培养的人肺鳞癌YTMLC 90细胞株中提取总RNA ,利用经修饰的oligo(dT)引物 (含SfiⅠB酶切位点 )合成cDNA第1链。同时 ,根据真核生物mRNA 5′端帽子结构的特点 ,利用SMART核苷酸 (含SfiⅠA酶切位点 )作为cDNA第 1链在mR NA 5′端延伸出去的模板。以此序列为引物 ,利用LD PCR(long distancePCR)合成双链cDNA。双链cDNA经SfiⅠ (ⅠA和ⅠB)酶切和过柱分级分离后 ,克隆入经SfiⅠ酶切的载体λTripIE× 2 ,经体外包装即为cDNA文库。结果 :人肺癌细胞株YTMLC 90的cDNA文库中 ,含有 1.0 1× 10 9pfu/L个重组子 ,重组率为 93.2 %。将该文库扩增后 ,克隆数可达 5 .2 4× 10 12 pfu/L ,插入cDNA的长度为 75 0～ 30 0 0bp。结论 :所构建的cDNA文库具有较好的质量 ,为进一步筛选、克隆肺癌特异性表达基因奠定了基础。     

人高迁移率族蛋白B1原核表达及其高亲和噬菌体融合肽的筛选

目的 构建谷胱甘肽巯基转移酶(GST)标记的人高迁移率族蛋白B1(HMGB1)融合蛋白表达载体并在原核细胞中表达.应用噬菌体展示技术筛选HMGB1的高亲和肽.方法 用RT-PCR方法扩增HMGB1 cDNA,构建于原核表达载体pGEX4T-1并转化大肠杆菌,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导GST-HMGB1蛋白表达;Ni2+-NTA和多粘菌素B亲和层析柱进行纯化重组HMGB1蛋白.以重组HMGB1蛋白为靶分子,进行4轮噬菌体展示环七肽库的筛选,从第4轮洗脱物中随机挑选20个单克隆噬菌体扩增后进行ELISA鉴定,用酶标仪测定450 nm处的吸光度值.对获得的阳性单克隆噬菌体分别进行扩增、纯化,并对DNA测序,以确定插入七肽的氨基酸序列.结果 RT-PCR扩增HMGB1 cDNA大小约648 bp,成功构建了pGEX4T-1-HMGB1重组质粒并纯化了HMGB1蛋白,其相对分子质量为65000.经过4轮筛选后,噬菌体富集了74倍(第4轮与第1轮回收量分别为5.2×108、7.0×106 pfu),随机挑取的20个噬菌体克隆中9个可与HMGB1结合,测序发现其中的6个序列一致,均为DYFVSSV.结论 筛选到1个可与HMGB1高亲和结合的噬菌体展示七肽,其对HMGB1活性的拮抗效应有待进一步阐明.