可溶性小鼠BTLA对树突状细胞表面B7-1和B7-2表达的影响

目的研究可溶性小鼠B/T淋巴细胞弱化因子（murine B and T lymphocyte attenuator ，mBTLA）-人IgG1 Fc融合蛋白（mBTLA-hIg）对树突状细胞表面共刺激分子表达的影响。方法克隆mBT／A基因，构建mBTLA胞外功能区和人IgG1Fc融合基因的真核表达载体（pmBTLA-hIg），并采用脂质体转染法，将pmBTLA-hIg质粒转染小鼠树突状细胞系（DC2．4）。采用RT-PCR、ELISA和Westem blot分别检测pmBTLA-hIg质粒转染DC中mBTLA基因mBNA的表达及细胞培养上清中mBTLA-hIg融合蛋白的表达；采用流式细胞术检测pmBTLA-hIg质粒转染对DC2．4表面共刺激分子B7-1（CD80）和B7-2（CD86）表达的影响。结果成功克隆了小鼠BT／A基因，并构建了真核表达载体；mBTLA-hIg融合基因转染的DC高表达mBTLA-hIg融合蛋白，并可结合到DC表面。表达可溶性mBTLA-hIg融合蛋白的DC2．4表面B7．1的表达上调，B7-2的表达下调，而且这种改变可被兔抗GST-mBTLA血清阻断。结论可溶性mBTLA-hIg融合蛋白对DC细胞表面研分子的表达具有调节作用，可能是BTLA反向信号作用于DC的结果。     

小鼠PD-1胞外段的克隆、原核表达及活性分析

目的小鼠PD-1胞外段(ePD-1)原核表达载体的构建、表达、纯化及其生物学效应初步研究。方法应用小鼠脾细胞总RNA,采用RT-PCR克隆PD-1胞外段基因,将其重组到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建原核表达载体pGEX-4T-1-ePD-1,转化至E.coli DH5α,筛选阳性菌落,进行酶切及测序鉴定。将测序正确的重组表达质粒pGEX-4T-1-ePD-1转化至E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot检测,同时通过蛋白质纯化仪纯化GST-ePD-1融合蛋白。利用流式细胞术和Alamar Blue法,检测纯化的PD-1胞外段融合蛋白对淋巴细胞增殖的影响,评价其生物学活性。结果成功构建重组质粒pGEX-4T-1-ePD-1,并在E.coli BL21(DE3)中获得了成功表达,利用蛋白质纯化仪得到纯化的GST-ePD-1融合蛋白。流式细胞术和Alamar Blue法结果均显示,不同浓度的融合蛋白作用于混合淋巴细胞,与阴性对照相比,可明显促进淋巴细胞的增殖。结论成功地克隆、表达和纯化了小鼠ePD-1蛋白,纯化的重组蛋白可有效促进淋巴...     

小鼠PD-L1胞外段基因的原核表达及活性分析

目的原核表达小鼠程序性死亡分子1配体胞外段(exPD-L1)蛋白基因并在体外初步验证其生物学活性。方法应用小鼠脾脏细胞总RNA,反转录PCR克隆exPD-L1基因序列,将其克隆到pGEX-4T-1载体中构建原核表达载体pGEX-4T-1-exPD-L1,经酶切和测序鉴定正确后,转化到E.coli BL21(D3)中,经IPTG诱导表达后,对包涵体蛋白进行复性和纯化。对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western blot法检测证明其正确后,采用GST pull-down检测融合蛋白和PD-1的相互作用,鉴定其生物学活性。结果成功构建重组质粒pGEX-4T-1-exPD-L1,并在宿主菌中成功表达相对分子质量(Mr)55 000的重组蛋白,包涵体成功复性和纯化后经Western blot法证明其正确表达,同程序性死亡分子1(PD-1)蛋白的GST pull-down结果表明融合蛋白具有生物学活性。结论成功克隆和表达小鼠exPD-L1蛋白,并证明其具有生物学活性。     

小鼠抗人前B细胞白血病同源盒基因3多克隆抗体的制备与鉴定

目的制备前B细胞白血病同源盒基因3(PBX3)多克隆抗体。方法采用反转录PCR扩增PBX3基因区序列,并重组入原核表达载体pGEX-4T-1,重组载体转化BL21大肠杆菌,异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导GST-PBX3融合蛋白的表达。SDS-PAGE纯化融合蛋白,并用GST-PBX3融合蛋白免疫BALB/c小鼠,收集经过免疫的小鼠血清即抗PBX3的多克隆抗血清,采用间接ELISA检测其效价,通过免疫细胞化学技术及Western blot法鉴定其特异性。结果成功构建pGEX-4T-1/PBX3原核表达载体,转化BL21菌株后可高效表达GST-PBX3融合蛋白,且以不可溶包涵体形式存在。SDS-PAGE纯化蛋白并免疫小鼠产生的抗PBX3血清可特异识别细胞外源过表达的PBX3蛋白,同时可检测到细胞外源性PBX3蛋白的细胞内定位情况。结论获得效价和特异性良好的PBX3多克隆抗体。     

小鼠IL-17A-GST融合蛋白的克隆表达

目的: 构建含有小鼠IL-17A(mIL-17A)基因的重组原核表达载体,获得高效表达mIL-17A 的基因工程菌,以及较高产量的mIL-17A蛋白.方法:以PMA 活化后小鼠脾脏单个核细胞的总RNA 逆转录合成的cDNA为模板,PCR 法扩增mIL-17A的编码序列,并分别亚克隆至pMD18-T 载体和原核表达载体pGEX-4T-1 中,经酶切和DNA测序鉴定后,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定.结果:PCR 产物大小及其双酶切鉴定均证明所克隆的基因是mIL-17A,DNA 序列测定进一步证实与GenBank 报道的序列完全一致成功构建了重组原核表达载体pGEX-4T-1/mIL-17A,并在大肠杆菌中高效表达出相对分子质量(Mr)约40 000的具有可溶性的融合蛋白,且Western blot证实确为目的蛋白结论: 成功构建了基因重组体pGEX-4T-1/mIL-17A;并制备出可溶性IL-17A-GST融合蛋白. E3),IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定.结果:PCR 产物大小及其双酶 鉴定均证明所克隆的基因是mIL-17A,DNA 序列测定进一步证实与GenBank 报道的序列完全一致成功构建了重组原核表达载体pGEX-4T-1/mIL-17A,并在大肠杆菌中高效表达出相对分子质量(Mr)约40 000的具有可溶性的融合蛋白,且Western blot证实确为目的蛋白结论: 成功构建了基因重组体pGEX-4T-1/mIL-17A;并制备出     

人GST-PTEN融合蛋白的原核表达和纯化

目的构建人第10号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源缺失的基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)原核表达质粒,使其在原核细胞中高效表达并进行纯化。方法将全长片段插入原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组子pGEX-4T-1-PTEN,转化BL-21感受态细胞。经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达PTEN融合蛋白的可诱导性表达,通过SDS-PAGE电泳、Western印迹分析证实蛋白表达的特异性。并用谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-Stransferase,GST)亲和层析对融合蛋白进行纯化。结果成功构建了原核表达载体pGEX-4T-1-PTEN,并将PTEN融合蛋白的成功表达,通过SDS-PAGE电泳、Western印迹分析,证实了蛋白表达的特异性。并对蛋白进行了纯化,获得了GST-PTEN融合蛋白的纯品。结论成功表达、纯化了GST-PTEN融合蛋白,为进一步研究PTEN蛋白的功能及其与其它功能性蛋白的相互作用研究奠定了基础。     

人B7-2(CD86) IgV+C段高效原核表达及活性测定

目的克隆、表达B7-2(IgV+C)并进行体外功能测定.方法用聚合酶链反应(PCR)技术从B7-2 cDNA中克隆B7-2(IgV+C),在此基础上构建表达B7-2(IgV+C)的原核表达载体pGEX-4T-3/hB7-2(IgV+C);SDS-PAGE检测蛋白表达,蛋白经变性、复性后在体外协同抗CD3单抗刺激人T细胞,3H-TdR掺入法检测T细胞的活化程度.结果在原核表达载体中成功地克隆了B7-2(IgV+C),SDS-PAGE表明在相对分子质量(Mr)55×103处有hB7-2(IgV+C)/GST融合蛋白的高效表达,其表达量占菌体总蛋白的33%.体外实验证明,此融合蛋白可协同抗CD3单抗刺激人T细胞活化.结论重组蛋白B7-2(IgV+C)在第一信号存在下可活化T细胞,即具有共刺激活性.     

小鼠肺炎链球菌脂蛋白SPD_1609多克隆抗体的制备

目的制备肺炎链球菌脂蛋白SPD_1609的小鼠多克隆抗体。方法通过PCR扩增肺炎链球菌D39菌株中的spd_1609基因,连接到原核表达载体pGEX-4T-1上,构建重组质粒pGEX-4T-1609。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶-SPD_1609(GST-1609)融合蛋白。利用GST亲和层析柱纯化GST-1609融合蛋白,纯化后的融合蛋白用凝血酶(thrombin)外切酶切掉GST标签,进一步通过GST亲和层析得到SPD_1609蛋白。用纯化的不含GST标签的SPD_1609蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,用ELISA检测抗体的效价, Western blot法检测抗体的特异性。结果成功构建了原核表达载体pGEX-4T-1609,经GST亲和层析柱分离纯化后可得到相对分子质量(M_r)35 000的SPD_1609蛋白,蛋白纯度在95%以上。ELISA检测结果显示纯化后的SPD_1609蛋白可诱导小鼠产生特异性免疫应答,免疫小鼠血清抗体的效价达1∶40 960, Western blot法检测显示此多克隆抗体可以特异地识别原核表达和肺炎链球菌细胞内表达的SPD_1609蛋白。结论成功制备具有较好特异性的SPD_1609蛋白的小鼠多克隆抗体。     

EB病毒融合蛋白ZtaN-p23在大肠杆菌中的表达、纯化及活性鉴定

目的:克隆EB病毒立即早期蛋白ZtaN和衣壳蛋白p23,构建原核表达载体,并在大肠杆菌中表达融合蛋白,为后续利用蛋白进行疾病诊断奠定基础。方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从B95-8细胞中分别扩增出目的基因BZLF1N和BLRF2,利用融合PCR法将两个基因进行连接,构建重组质粒pGEX-4T-1-BZLF1N-BLRF2,并转化大肠杆菌BL21(DE3)。加入IPTG诱导表达融合蛋白ZtaN-p23,通过SDS-PAGE和Western blot确定蛋白表达量及活性鉴定。结果:重组质粒pGEX-4T-1-BZLF1N-BLRF2经双酶切鉴定和序列分析正确,证实已成功构建原核表达载体;SDS-PAGE显示诱导的蛋白Mr约46 000,与预期值一致;对融合蛋白表达条件进行优化后,发现其主要以包涵体的形式存在于细胞中;亲和层析结果显示纯化后的ZtaN-p23纯度>95%;Westernblot显示ZtaN-p23具有良好的生物活性。结论:成功构建原核表达载体pGEX-4T-1-BZLF1N-BLRF2,并在大肠杆菌中进行了表达纯化,融合蛋白显示出良好的活性。     

PA28γ蛋白原核表达纯化及其多克隆抗体制备

目的蛋白酶体激活亚单位3（PA28γ）的表达、纯化及其多克隆抗体的制备。方法利用pGEX-4T-1原核表达系统表达PA28γ蛋白，经T-A克隆、亚克隆至pGEX-4T-1表达载体；将重组质粒转化到大肠杆菌BL-21-STAR（DE3），诱导表达PA28γ蛋白，通过Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化融合蛋白（GST-PA28γ）；并用其免疫BALB／c小鼠制备多抗血清，对表达产物和多抗血清进行Westem-blot鉴定。结果成功构建原核表达质粒PA28γpGEX-4T-1。且测序正确；获得高纯度的PA28γ蛋白及其高效价的多克隆抗体血清，并得到Westem-blot证实。结论成功利用基因重组技术制备了PA28γ蛋白和抗PA28γ多克隆血清，为该蛋白的生物学功能研究奠定了基础。     

氯通道ClC-2融合蛋白的原核表达及体外磷酸化

目的：检测ClC-2是否能被促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）磷酸化，为进一步研究其在细胞增殖、分化过程中的调控机制提供基础。方法：从含有家兔ClC-2cDNA的质粒pSPORT1中PCR扩增ClC-2胞浆内的羧基端DNA编码序列，构建重组载体pGEX-4T-1／ClC-2CT；重组质粒经酶切、测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21菌株；经异丙基β-D-硫代半乳糖（IPTG）诱导后，通过Gluthathion Sepharose4B亲和层析柱纯化融合蛋白；并行融合蛋白的体外磷酸化实验。结果：酶切、测序鉴定重组载体pGEX-4T-1／ClC-2CT构建正确，并纯化得到GST／ClC-2CT融合蛋白。而且该融合蛋白能被MAPK磷酸化，而GST不能被MAPK磷酸化。结论：氯通道ClC-2能被MAPK磷酸化。     

GST-hVinexin融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的构建GST-hVinexin融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达。方法从COS-7细胞中提取mRNA,反转录为cDNA。用PCR方法扩增出hVinexin基因全长,通过BamHI和SalI酶切位点将其定向插入pGEX-4T-2载体中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-hVinexin,并转化E.coli DH5α,通过限制性内切酶酶切电泳和DNA测序鉴定正确后,转入E.coli BL21中,经异丙基硫代β-D半乳糖苷大量诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定。结果电泳后酶切结果证实hVinexin大小为990bp,测序证明成功构建了原核表达质粒GST-hVinexin,并诱导表达GST-hVinexin融合蛋白,进一步用Western blot方法验证了其融合蛋白的表达。结论成功构建了GST-hVinexin原核表达载体,并在原核细胞大肠埃希菌表达,为进一步纯化Vinexin及研究其结构与功能提供了前提基础。     

人LIGHT胞外区基因的克隆及融合蛋白的表达

目的：克隆人LIGHT胞外区基因（hsLIGHT），构建其原核表达质粒，并诱导其在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法：采用RT-PCR方法从HL60细胞中扩增hsLIGHT，将其克隆人原核表达质粒pGEX-4T-2，构建其重组表达质粒pGEX-4T-2／hsLIGHT，以不同浓度IPTG诱导表达，于不同时间经SDS-PAGE和Western blot分析、鉴定。结果：经RT-PCR扩增获得的hsLIGHT序列与Genebank报道的LIGHT基因胞外区序列完全一致；SDS-PAGE和Westernblot分析证实重组质粒可表达出相对分子量为47000的蛋白，与GST-hsLIGHT融合蛋白分子量一致。结论：成功完成了人LIGHT胞外区基因的克隆及其原核表达质粒的构建，在大肠杆菌E-coli BL21中经IPTG诱导表达了融合蛋白GST-hsLIGHT，为进一步探讨LIGHT的抗肿瘤生物学活性、探索肿瘤免疫治疗新方法奠定了基础。     

人神经系统特异表达RNA结合蛋白HuC cDNA的克隆、表达及纯化

目的克隆人神经系统表达RNA结合蛋白HuC的cDNA并原核表达纯化。方法提取人神经母细胞瘤SHSY5Y细胞株总RNA,经RT-PCR扩增得到人HuC全长cDNA的克隆。将HuC cDNA克隆到原核表达载体pGEX4T-3载体中,并转化到大肠杆菌中,在获得高效表达后,利用GST纯化系统,对HuC重组蛋白进行纯化。结果经过表达及纯化条件的摸索,最终获得重组HuC蛋白。结论HuC蛋白是一种神经系统表达RNA结合蛋白,重组HuC蛋白的获得为HuC抗体的制备及进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

原核表达载体GST-RUNX3的构建及其在大肠杆菌表达

目的 构建GST/RUNX3融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达.方法 利用Kpn1和Xho1位点酶切pcDNA3.1-RUNX3质粒,将获得的1300bp RUNX3编码序列插入到pGEX-4T-2中,构建pGEX-4T-2-RUNX3质粒,并转化Ecoli DH5α,筛选阳性重组子,酶切鉴定和...     

铜绿假单胞菌外毒素衍生物PE38KDEL的原核表达载体构建及其鉴定

目的 构建铜绿假单胞菌外毒素衍生物(PE38KDEL)的原核表达载体并对其表达的蛋白进行鉴定.方法 采用PCR方法扩增本实验所需要的PE38KDEL基因片段,再通过酶切及连接反应构建原核表达载体pGEX-4T-1-PE38KDEL,重组载体经过限制性内切酶酶切、PCR扩增鉴定及DNA序列测定证实插入片段正确后,转化感受态大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳后及蛋白免疫印迹法分别测定其大小和特异性.结果 经鉴定证实原核表达载体pGEX-4T-1-PE38KDEL构建成功,且在大肠杆菌BL21中获得了PE38KDEL与GST的融合表达,且表达蛋白产物的分子质量大小与预期值一致,并可被PE的特异性抗体所识别.结论 PE38KDEL在大肠杆菌中获得了高效的融合表达,为下一步研究其功能奠定了基础.     

BirA酶基因表达载体的构建、原核表达及表达产物的活性鉴定

目的:构建生物素-蛋白连接酶(BirA酶)基因的表达载体,并在大肠杆菌BL-21(DE3)中表达具有生物学活性的BirA酶。方法:用PCR法扩增BirA酶基因。将PCR产物克隆入pGEX-4T-2中构建BirA酶-GST融合蛋白基因的重组表达载体pGEX-BirA。经测序验证后,在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,表达产物采用谷胱苷肽-琼脂糖层析柱进行纯化。以带有生物素酶底物肽(BirAsubstratepeptide,BSP)的HLA-A2-肽复合物为底物,用ELISA和Westernblot鉴定表达产物的生物素化活性。结果:构建了pGEX-BirA原核表达质粒,并在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达Mr为61300的BirA酶-GST融合蛋白,表达产物经谷胱苷肽-琼脂糖层析柱纯化后,得到N端带有GST标签的BirA酶蛋白。ELISA和Westernblot的结果显示,表达产物能使HLA-A2-肽复合物生物素化。结论:成功地制备了具有生物学活性的Bi-rA酶,为研究蛋白质分子的相互作用提供了有效的制剂。     

人GRP78蛋白的原核表达、纯化及抗原活性鉴定

目的:构建原核表达质粒pGEX-4T-1 -GRP78,诱导表达、纯化后检测GRP78蛋白的抗原活性.方法:利用PCR方法从本实验室已构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)上扩增GRP78基因,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组载体pGEX-4T-1 -GRP78.转化至大肠杆菌BL21( DE3)中诱导表达,再将所表达的融合蛋白进行纯化.经SDS-PAGE分析后,将所得产物用Thrombin切割;进一步包板后用ELISA法对其抗原活性进行评价.结果:酶切和测序结果均证实GRP78原核表达载体构建正确,可诱导表达;ELISA检测显示纯化后的人GRP78抗原具有免疫原性.结论:成功构建了人GRP78基因的原核表达载体,获得了纯化的GRP78蛋白,该蛋白具有良好的抗原活性,为进一步研究以GRP78为基础的肝细胞癌的血清学检测提供了抗原.     

人UNC5CL原核蛋白的表达及多克隆抗体的制备和鉴定

目的:构建UNC5CL基因的原核表达载体,纯化GST-UNC5CL融合蛋白,并以其为抗原免疫家兔,制备抗人UNC5CL多克隆抗体,并鉴定其反应性和特异性。方法:用PCR方法扩增UNC5CL基因(表达其280-518位氨基酸)片段并克隆至pGEX-4T-2原核表达载体中,转化大肠杆菌BL21诱导融合蛋白GST-UNC5CL(aa 280-518)表达;所获得的可溶性蛋白经亲和层析纯化,免疫家兔制备抗血清,再采用ELISA、Western blot和免疫组化的方法检测抗体的效价及特异性。结果:测序证实原核重组质粒构建成功;经IPTG诱导,可表达Mr为52 000的GST-UNC5CL(aa280-518)的融合蛋白;谷胱甘肽亲和层析柱纯化的融合蛋白免疫家兔制备的抗血清经Western blot和免疫组化检测证实可识别目的蛋白。结论:制备了兔抗人UNC5CL的多克隆抗体,且抗体对内源性UNC5CL具有较好的反应性和特异性,为进一步研究UNC5CL的功能奠定了基础。