不同加载频率拉应力对髁突软骨细胞增殖分化的影响

目的:探讨不同加载频率的拉应力对髁突软骨细胞增殖、分化的影响。方法:体外分离2周龄新西兰兔髁突软骨细胞,对细胞施加2 h/d,为期3 d的不同频率(0 Hz、0.1 Hz、0.5 Hz、1 Hz)的拉应力。采用CCK8检测细胞增殖水平,实时荧光定量RT-PCR检测Sox9、Runx2、VEGF的表达。结果:细胞增殖水平在静止性(0 Hz)组显著高于周期性加力(0.1~1 Hz)组和对照组;Sox9、Runx2、VEGF表达在0.5 Hz组和1 Hz组显著高于静止性(0 Hz)组和对照组。结论:不同加载频率拉应力对髁突软骨细胞增殖分化有差异性影响。     

细胞冻存对髁突软骨细胞去分化特性的影响研究

目的 研究细胞冻存处理对髁突软骨细胞去分化特性的影响。方法 分离并体外培养2周龄新西兰大白兔双侧髁突软骨细胞, 将P1代冻存处理15 d后传代培养。采用倒置相差显微镜观察比较正常传代培养的P2代髁突软骨细胞（对照组）和经冻存处理后传代的P2代髁突软骨细胞（实验组）间的细胞形态;通过荧光定量PCR和Western免疫印迹技术检测和分析两组间软骨细胞标志物COL2、COL10、Sox9和Aggrecan基因和蛋白水平的表达差异,并使用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析。 结果 倒置相差显微镜观察发现实验组P2代髁突软骨细胞会出现一定程度的形态学改变;但是并未发现实验组和对照组之间COL2、COL10、Sox9和Aggrecan的表达有统计学意义的差异;实验组和对照组软骨标志基因的表达均会较P1代出现降低。 结论 体外培养髁突软骨细胞存在去分化现象,但细胞冻存处理并不会加速其去分化进程,所以体外培养的髁突软骨细胞可以通过冻存技术来实现髁突软骨细胞的暂存。     

雌激素浓度对大鼠髁突软骨细胞中雌激素受体表达的影响

目的:探索有利于原代髁突软骨细胞生长、促进Ⅱ型胶原蛋白(collagen type Ⅱ,Col Ⅱ)表达的有效雌激素浓度.方法:提取4周龄雌性SD大鼠髁突软骨细胞,进行髁突软骨细胞鉴定,并测定细胞生长曲线.应用不同浓度雌激素对软骨细胞进行处理后,CCK-8试剂盒对软骨细胞增殖进行测定,实时定量PCR(RT-PCR)及蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)技术测定软骨细胞雌激素受体(ertrogen receptor,ER)α、β和Col ⅡmRNA和蛋白的表达量.结果:与对照组相比,10-9mol/L的雌激素对软骨细胞增殖和ERα表达的促进作用优于其他组(P＜0.05);10-7mol/L的雌激素对Col Ⅱ的促表达作用优于其他组(P＜0.05);而雌激素浓度的变化会对ERβ的表达产生抑制作用,10-10mol/L较其他组为显著(P＜0.05).结论:雌激素在一定浓度下可促进髁突软骨细胞增殖及ERα和Col Ⅱ表达,抑制ERβ的表达.     

生长期兔髁突纤维软骨细胞和骨骺透明软骨细胞生物学特性的比较研究

目的 建立软骨细胞体外培养模型,研究纤维软骨和透明软骨的生物学差异。 方法 分离4周龄雌性兔双侧髁突软骨和膝关节骨骺软骨,采用胰酶和胶原酶联合消化的方法收集软骨细胞,分别进行体外培养并连续传代至P10。使用倒置显微镜观察细胞形态;采用阿利新蓝和Ⅱ型胶原免疫组化染色的方法分别对髁突纤维软骨细胞和骨骺透明软骨细胞进行鉴定;用细胞计数的方法绘制生长曲线;运用荧光定量PCR和Western印迹技术对软骨特异性指标Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原、SOX9和Aggrecan进行检测,并使用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学分析。 结果 倒置显微镜观察示,髁突纤维软骨细胞和骨骺透明软骨细胞形态均会随细胞传代而发生改变,且P2代以后改变明显;基因和蛋白水平的检测均证实P2代后软骨细胞去分化明显。阿利新蓝和Ⅱ型胶原免疫组化染色鉴定结果均为阳性,对照组为阴性。实时定量荧光PCR和Western印迹结果证明：在纤维软骨中,Ⅰ型胶原的表达量高于透明软骨;而Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原、SOX9和Aggrecan的表达量却明显低于透明软骨。 结论 使用本方法培养软骨细胞简单有效;髁突纤维软骨细胞和骨骺透明软骨细胞体外培养均存在去分化现象,且两者Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原、SOX9和Aggrecan的表达存在显著差异,生物学特性并不相同。     

rhIL-1β及TGF-β对髁状突软骨细胞增殖影响的研究

目的 :探讨rhIL 1β及TGF β对髁状突软骨细胞增殖的影响。 方法 :以酶消化法获得兔髁状突软骨细胞。用MTT法及PCNA免疫组化染色检测不同浓度rhIL 1β及TGF β对体外培养的兔髁状突软骨细胞增殖的影响。结果 :MTT检测 ,rhIL 1β( 10、2 0ng/ml)处理软骨细胞 4 8h后 ,可明显抑制软骨细胞增殖 ,经统计学检验 ,处理 3～ 6d有显著性差异 (P <0 .0 1,t检验 ) ;加入TGF β( 10、2 0ng/ml)可明显拮抗rhIL 1β对软骨细胞增殖的抑制作用 ,并且浓度愈高对rhIL 1β的抑制作用愈强。PCNA检测 ,rhIL 1β处理软骨细胞后PCNA阳性细胞率降低 ,随rhIL 1β的刺激浓度增加 ,阳性率明显降低 ;加入外源性TGF β可以使PCNA的阳性率提高。 结论 :rhIL 1β对髁状突软骨细胞增殖具有抑制作用 ,外源性TGF β对该作用具有明显的拮抗效应     

静压力下兔髁突软骨细胞COL2A1、SOX9、COL1A1和ALP的表达变化

目的 研究兔髁突软骨细胞对静压力的分子生物学响应。方法：体外分离培养4周龄健康雌性新西兰大白兔髁突软骨细胞,使用形态学观察,COL2A1和SOX9免疫细胞化学染色方法对P2代髁突软骨细胞进行鉴定;100kPa静压力条件下,分别对P2代髁突软骨细胞进行0、1、2、3和4 h的加压处理;采用CCK-8检测压力加载后各组细胞活性的变化;通过Western免疫印迹分析髁突软骨细胞COL2A1、SOX9、COL1A1和ALP的表达变化。采用SPSS19.0软件包对数据进行统计学分析。结果：兔髁突软骨细胞呈多角形,“铺路石”样排列,细胞爬片COL2A1和SOX9免疫细胞化学染色鉴定结果为阳性。100kPa静压力加载1 h时,细胞活性显著降低（P=0.04）,但在2~4 h后,细胞活性恢复并与对照组无显著差异。Western印迹结果显示,压力加载3 h和4 h时,COL2A1、SOX9、COL1A1和ALP的表达显著升高。其中,在压力加载4 h组ALP的表达量比3 h组低。结论：兔髁突软骨细胞对压力微环境的改变具有一定的适应能力,100kPa静压力加载4 h不会对髁突软骨细胞活性产生不可逆损伤。适宜的压力加载对髁突软骨细胞的成软骨和成骨能力有促进作用。髁突软骨细胞压力微环境的改变,可能影响颞下颌关节适应性改建和颞下颌关节紊乱病的病理过程。     

FAM20C在小鼠下颌髁突发育过程中的时空表达

目的 观察小鼠髁突发育过程的不同阶段,FAM20C在髁突软骨中的时空表达特点,试探究其在小鼠髁突发育过程中的可能作用机制。方法 苏木精-伊红(HE)染色和改良番红O-固绿染色观察胚胎17.5 d和出生后0、7、21 d 4组小鼠髁突软骨及软骨下骨的形态学变化。免疫组化染色观察相应时间点FAM20C在小鼠髁突软骨组织中的定位及表达。测量FAM20C阳性表达的平均光密度值,并进行单因素方差分析。结果 HE染色和改良番红O-固绿染色结果表明:随着软骨内骨化的进展,髁突软骨细胞层长度减少,软骨下骨体积增加,下颌髁突体积增大;免疫组化结果表明:4组小鼠髁突软骨组织中均有FAM20C阳性表达,FAM20C主要表达于髁突软骨增殖软骨细胞层和前肥大软骨细胞层,少量表达于肥大软骨细胞层及软骨下骨层,随着髁突发育,FAM20C表达逐渐减少。统计学结果显示,各时间点FAM20C阳性表达差异有统计学意义(P<0.01)。结论 FAM20C参与小鼠下颌髁突发育,可能通过调节髁突软骨细胞的增殖和分化在髁突形成中发挥重要作用。     

IGF-1信号通路相关蛋白在大鼠髁突软骨细胞增殖分化中的表达

目的:研究胰岛素样生长因子-1(IGF-1)信号转导通路在大鼠髁突软骨细胞增殖分化调控过程中相关基因的表达。方法:体外单层培养并鉴定出生后1、7、14、28 d共4组SD大鼠髁突软骨细胞。免疫组织化学方法检测细胞内IGF-1表达情况,Real-time PCR及Western印迹法检测细胞内IGF-1R、Bcl-2、Bax mRNA及蛋白表达。饥饿培养24 h后,实验组加入质量浓度为100 ng/mL的重组大鼠IGF-1细胞因子(rrIGF-1)继续培养24、48 h,CCK-8检测细胞增殖情况,Real-time PCR技术检测各组髁突软骨细胞内IGF-1R、IGF-2R、Raf1、GSK-3、IGFBP3、NF-κB、Bcl-2、Bax、integrin、TGF-βmRNA表达情况;对照组培养液不加rrIGF-1。结果:各鼠龄组SD大鼠髁突软骨细胞内IGF-1表达均阳性,IGF-1R mRNA及蛋白表达相对平稳,Bcl-2、Bax mRNA及蛋白表达逐渐增强,在出生14 d后表达下降(P<0.05)。加入100 ng/mL rrIGF-1后,髁突软骨细胞增殖速度显著增加,细胞凋亡减少,Real-time PCR结果显示实验组IGF-1R、GSK-3、Bax、integrin mRNA表达整体呈下降趋势;IGF-2R、Raf1、IGFBP3、NF-κB、Bcl-2、TGF-βmRNA表达水平总体呈上调趋势,差异有统计学意义。结论 :IGF-1介导的信号转导途径参与了髁突软骨细胞的增殖、分化以及软骨形成早期的调控,并可能与integrin、TGF-β等其他蛋白相互作用,共同参与髁突发育过程。     

压应力对体外培养兔髁突软骨细胞CTGF基因表达的影响

目的:观察不同压应力状态下,兔髁突软骨细胞结缔组织生长因子(CTGF)mRNA表达水平的变化.方法:半定量RT-PCR方法检测兔髁突软骨细胞在压应力作用下CTGF mRNA的表达变化.结果:在一定压应力范围内,兔髁突软骨细胞CTGF的表达,随着压应力增大而显著增强(P相似文献   

RUNX蛋白在不同发育时期小鼠髁状突中的表达

目的：探索小鼠髁状突形态发育及此过程中RUNX蛋白的表达变化及意义。方法：取胚胎14．5d（E14．5）至出生后7．5d（P7．5）的小鼠下颌骨,制备髁突矢状位切片,苏木素一伊红（HE）染色观察。免疫组化方法检测RUNX蛋白表达分布。结果：E14．5开始,髁突间充质细胞聚集,而后逐渐分化出完整的软骨细胞分层,髁突逐渐由半圆变扁平。免疫组化示RUNXl、2阳性信号主要位于增殖层、前软骨细胞层及部分肥大层细胞,RUNX3阳性信号主要位于前软骨细胞层及肥大层。髁突前后部,RUNXl、2在前软骨细胞层的信号强度较肥大层更高。RUNX整体的表达呈现双峰曲线。结论：髁突前后部成熟较晚,更易发生改建。RUNXl、2协同作用于软骨细胞分化早期,RUNX3调节作用于软骨细胞成熟期。     

单侧前牙反牙合大鼠髁突异常分化的软骨细胞中CaMKⅡ的表达变化

目的:研究实验性单侧前牙反牙合(unilateral anterior crossbite,UAC)对大鼠髁突软骨的致病意义及对促软骨细胞分化的CaMKⅡ表达的影响。方法:40只6周龄SD雌性大鼠,随机等分为UAC组和对照组,其中UAC组左侧上下切牙各戴一套筒冠并形成反牙合关系,对照组不作处理。于实验开始后4周和8周取材,HE和番红O染色观察髁突软骨的组织形态变化,免疫组织化学染色观察CaMKⅡ的表达,Real-time PCR测量相关基因表达水平的变化。结果:UAC组髁突软骨细胞分化异常,软骨变薄,基质减少,且随时间的延长而加重(P<0.05),CaMKⅡ阳性细胞百分数以及CaMKⅡ和Mmp-13的mRNA表达水平上调,但促增殖的Pcna以及软骨基质Col2a1、 Aggrecan的mRNA的表达水平下调。结论:UAC可导致髁突软骨异常分化并伴有CaMKⅡ的高表达。     

大鼠颌骨与胫骨骨髓基质细胞生物学特性和基因表达差异的比较

目的 :比较大鼠颌骨来源骨髓基质细胞(M-BMSCs)与胫骨来源骨髓基质细胞(T-BMSCs)生物学特性的差异。方法:体外通过全骨髓贴壁法,分离和培养SD大鼠M-BMSCs和T-BMSCs,取第3代细胞用于:1流式细胞检测鉴定表面标志;2MTT、细胞周期、克隆形成率检测细胞增殖能力差异;3成骨、成脂诱导及染色检测细胞多项分化潜能;4碱性磷酸酶(ALP)活性、染色、免疫荧光染色检测细胞成骨活性的差异;5荧光定量PCR检测Wnt1、Wnt5a、Hoxa11、Runx2、Ocn、Col I的表达差异和成骨诱导后各基因的表达变化。结果:1 M-BMSCs和T-BMSCs阳性表达CD29、CD44,阴性表达CD45;2MTT、细胞周期检测、克隆形成率显示T-BMSCs细胞增殖能力较高;3M-BMSCs在成骨诱导后矿化能力更强;而T-BMSCs成脂诱导形成脂滴的能力更强;4M-BMSCs表达ALP的水平更高;5荧光定量PCR示2种细胞的Wnt1、Wnt5a、Hoxa11、Runx2、Ocn、ColⅠ表达存在差异。结论:体外培养的M-BMSCs和TBMSCs有着不同的生物学特点,其相关基因Wnt1、Wnt5a、Hoxa11、Runx2、Ocn、ColⅠ的表达上存在差异。     

牵张力对大鼠髁突软骨细胞增殖及相关因子表达的影响

目的:观察牵张力对大鼠髁突软骨细胞增殖、炎性因子及Hedgehog通路基因的表达影响,探讨牵张力对软骨细胞的调控。方法:体外培养软骨细胞并鉴定。用Flexcell 4000TM加力板对细胞施加0.5 Hz,0%、3%和15%的牵张应变,作用4 h后检测细胞增殖情况,对比PCNA、Caspase-3、COL II、IL-1β、TNF-α及Hedgehog通路基因Ihh、Ptc和Smo的表达变化。结果:与对照组相比,3%组细胞增殖速度增加,PCNA、COLII、Ihh、Ptc和Smo的mRNA表达增加,15%组Caspase-3、IL-1β和TNF-α表达增加,而PCNA、Smo表达降低。与3%组相比,15%组细胞增殖速度降低,PCNA、COL II、Ihh和Smo表达降低,而Caspase-3、IL-1β表达增高。结论:不同强度牵张力对大鼠髁突软骨细胞增殖活性及炎性因子表达作用不同。Hedgehog通路对牵张力敏感,可能参与了力学刺激对软骨细胞的调控。     

程序性坏死特异性抑制剂-1对高糖环境下牙周膜干细胞增殖和成骨分化的影响

目的探讨程序性坏死特异性抑制剂-1（Nec-1）对高糖环境下牙周膜干细胞（PDLSC）的增殖和成骨分化的影响。 方法体外克隆培养的PDLSC，按照如下处理方法分为3组：对照组（5 mmol/L葡萄糖）、高糖组（25 mmol/L葡萄糖）和高糖+Nec-1组（25 mmol/L葡萄糖+30 μmol/L Nec-1）。通过蛋白免疫印迹（Western blot）检测细胞坏死性凋亡相关分子RIP1、RIP3的表达，噻唑蓝（MTT）比色法检测各组细胞增殖活力，通过茜素红染色、碱性磷酸酶（ALP）定量检测和实时荧光定量PCR等方法分析PDLSC的成骨分化情况。使用SPSS 26.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析比较各组间细胞增殖活力（MTT吸光度A值）、ALP表达含量及成骨相关基因（COL1、RUNX2、OCN）相对表达水平，并用LSD-t检验进行组间多重比较。 结果Western blot结果显示，高糖组PDLSC的RIP1和RIP3的表达较对照组明显增加，而高糖+Nec-1组的RIP1和RIP3的表达明显弱于高糖组。PDLSC培养7 d后，高糖组增殖活力较对照组明显降低，其吸光度A值（0.67 ± 0.06）显著低于对照组（1.23 ± 0.12），差异有统计学意义（t = 9.652，P<0.001）；而Nec-1抑制后，PDLSC的增殖活力明显增加，高糖+Nec-1组吸光度A值（1.12 ± 0.11）显著高于高糖组（0.67 ± 0.06），差异有统计学意义（t = 8.185，P<0.001）。经矿化诱导后，高糖组PDLSC 14 d时形成的矿化结节、7 d时ALP表达含量（3.42 ± 0.37）和成骨相关基因COL1（1.86 ± 0.16）、RUNX2（1.55 ± 0.23）、OCN（1.08 ± 0.20）的相对表达量均较对照组均显著减少，差异均有统计学意义（t_ALP = 13.149，t_COL1 = 14.257，t_RUNX2 = 7.593，t_OCN = 8.606，P均<0.001）；而Nec-1抑制后，PDLSC的成骨分化增加，高糖+Nec-1组PDLSC 14 d时形成的矿化结节、7 d时ALP表达含量（6.06 ± 0.26）和成骨相关基因COL1（3.64 ± 0.30）、RUNX2（2.53 ± 0.26）、OCN（2.14 ± 0.30）的相对表达量较高糖组均显著升高，差异均有统计学意义（t_ALP = 13.033，t_COL1 = 11.636，t_RUNX2 = 6.332，t_OCN = 6.573，P均<0.001）。 结论体外培养条件下，高糖环境抑制了PDLSC的增殖和成骨分化，而Nec-1明显改善了高糖环境下PDLSC的增殖和成骨分化。     

TGF-β2诱导小鼠腭突细胞成软骨分化的研究

目的 探讨转化生长因子β2(transforming growth factor-β2,TGFβ2)诱导小鼠腭突细胞成软骨分化的作用.方法 取胎龄13.5天的小鼠分离培养腭突细胞,并分别加入不同的细胞因子进行成软骨诱导培养.A组为空白对照组,B组为TGFBR1(转化生长因子受体1)抑制剂-SD208组,C组为加入TGF-β2组,D组SD208+TGF-β2组.通过比较蛋白聚糖、蛋白聚糖半定量,以及软骨标志基因的表达水平,评价各组细胞因子诱导腭突细胞成软骨能力大小及作用.结果 在TGF-β2作用下腭突细胞向软骨细胞分化,TGF-β2组蛋白聚糖及软骨相关基因表达量最高,显著高于A、B、D组(P<0.01).B、D组蛋白聚糖及软骨相关基因的表达量较A组明显降低(P<001).结论 腭突细胞在TGF-β2诱导下具有成软骨分化能力.     

单侧前牙反牙合对大鼠下颌髁突软骨内CaR、PTHrP表达的影响研究

目的　探索单侧前牙反牙合（unilateral anterior crossbite,UAC）对大鼠下颌髁突软骨内钙离子敏感受体（calcium-sensing receptor,CaR）、甲状旁腺激素相关蛋白（parathyroid hormone-related protein,PTHrP）分子表达以及软骨细胞增殖和发育的影响。方法　选择6周龄雌性SD大鼠48只,根据实验时间点（2、4、8周）随机分为3大组,每大组再随机分为2组（对照组、UAC实验组）,每组动物数量8只。对SD大鼠施加UAC刺激,于2、4、8周后分别处死各组大鼠,对颞下颌关节软骨进行CaR、PTHrP、PTHrP 受体（PPR）分子的免疫组化染色,提取软骨内mRNA进行增殖标志分子、软骨细胞表型分子和终末分化相关分子的Real-time PCR检测。结果　UAC实验组大鼠髁突软骨2周时即开始出现CaR的表达增高,4周时继发有PTHrP的表达上调,但是其惟一受体PPR的表达从2周时即显著降低;增殖标志分子和软骨细胞表型分子的表达从2周时开始显著降低,终末分化相关分子的表达从4周开始显著增高。结论　UAC可导致下颌髁突软骨内CaR、PTHrP表达改变,进而影响软骨细胞的增殖和分化状态。     

Comparison of the effects of hydrostatic compressive force on glycosaminoglycan synthesis and proliferation in rabbit chondrocytes from mandibular condylar cartilage, nasal septum, and spheno-occipital synchondrosis in vitro

We have developed a simple in vitro model whereby precise quantities of compressive force can be applied to cultured chondrocytes from craniofacial cartilage: mandibular condylar cartilage (MCC), nasal septal cartilage (NSC), and spheno-occipital synchondrosis (SOS). Using this model, we found that hydrostatic compressive force stimulated glycosaminoglycan (GAG) synthesis, a cartilage phenotype, in MCC and SOS chondrocytes and DNA synthesis in MCC, NSC, and SOS chondrocytes. These stimulations were dependent on force magnitude and duration, reaching maximal GAG synthesis at 27 hours and maximal DNA synthesis at 20 hours after application of force. The maximal increase of GAG synthesis induced by compressive force was about 60% at 100 gm/cm2 for 5 minutes in nonstimulated MCC chondrocytes and 40% at 50 gm/cm2 for 1 minute in nonstimulated SOS chondrocytes. The maximal increase in DNA synthesis, produced by a compressive force of 50 gm/cm2 for 1 minute, was 50% in NSC chondrocytes, 50% in SOS chondrocytes, and 30% in MCC chondrocytes. There was no stimulation of GAG synthesis in NSC chondrocytes. These observations suggest that extrinsic force regulates craniofacial growth by controlling the differentiation and proliferation of chondrocytes in the craniofacial skeleton and that the difference in their responses to compressive force may reflect differences in the characteristics of these cells and their physiologic function in vivo.     

Cartilage formation by serial passaged cultured chondrocytes in a new scaffold: Hybrid 75:25 poly(L-lactide-ε-caprolactone) sponge

PURPOSE: This study was designed to determine whether multipled chondrocytes immersed in a new scaffold, 75:25 poly(L-lactide-epsilon-caprolactone) sponge coated with type I collagen (75-PLC scaffold), could be used to generate cartilage tissue in vivo and to evaluate the correlation between cartilage generation and the phenotype of the proliferated chondrocytes. MATERIALS AND METHODS: Rat chondrocytes were suspended in 75-PLC scaffold at a density of 1 x 10 7 cells/mL after proliferation in a monolayer for 1 (P1) to 4 passages (P4) and implanted in nude mice for 4 weeks. Cells were characterized by the expression of genes encoding type II collagen, aggrecan, and type I collagen by Northern hybridization, and consequently, the newly formed tissue was evaluated histologically. RESULTS: The expression of aggrecan messenger RNA gradually decreased with the passaged cultures; however, the expression of type I collagen messenger RNA increased with time. The cartilage formations in all specimens were found not only in P1 chondrocytes but also in P2 chondrocytes, although when P3 chondrocytes were grafted, approximately 50% of cartilage formation was still observed up to but not beyond P4. CONCLUSION: It is suggested that cartilage tissue is generated with cultured chondrocytes up to P2 but not beyond P4. Northern blot analysis is useful for the assessment of whether the cells are capable of regeneration.