IGF-1、IGF-1R及Bcl-2,Bax在大鼠髁突软骨发育中的表达及作用

目的探讨大鼠髁突软骨发育过程中IGF-1、IGF-1R及凋亡相关因子Bcl-2、Bax的表达、分布以及可能发挥的作用。方法获取出生后1、7、14、28d SD大鼠髁突,甲苯胺蓝染色观察软骨结构。免疫组化染色检测IGF-1、IGF-1R、Bcl-2、Bax在各年龄组SD大鼠髁突软骨的分布。Western blot及real-time PCR分别检测各年龄组软骨细胞内IGF-1、IGF-1R、Bcl-2、Bax蛋白及mRNA的表达。结果甲苯胺蓝染色结果显示随年龄递增,大鼠髁突软骨逐渐变薄,宽度增加。免疫组化染色显示IGF-1、IGF-1R、Bcl-2在增殖层至肥大软骨细胞浅层分布最明显,Bax主要表达在成熟层及肥大层。Real time PCR及Western blot结果表明出生后的IGF-1 mRNA的表达逐渐降低,至28d时表达开始增强,IGF-1R蛋白及mRNA出生后稍有波动但表达相对平稳,Bcl-2、Bax蛋白及mRNA表达逐渐增强,至出生14d时表达开始下降(P<0.05)。结论 IGF-1、IGF-1R及凋亡相关因子Bcl-2、Bax的表达及分布相关,共同参与调控髁突软骨的发育。     

咀嚼力降低对大鼠髁突软骨中Bax和Bcl-2 mRNA表达的影响

目的：探讨咀嚼力降低对发育期大鼠下颌髁突软骨中凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2 mRNA表达水平的影响.方法：40只18 d雄性大鼠随机分为2组.一组喂以标准的硬食,另一组以粉末状软食喂养.于大鼠4周、5周、6周、7周龄时取其髁突软骨以RT-PCR方法检测其中Bax和Bcl-2mRNA的表达水平.结果：正常硬食组大鼠髁突软骨中Bax mRNA和Bcl-2 mRNA的表达均随时间延长而降低.软食对Bcl-2mRNA表达的影响不大,但却使Bax mRNA表达上调.软食组Bax mRNA与Bcl-2 mRNA的比值在6周和7周时明显高于硬食组p＜0.05）.结论：咀嚼力降低使发育期大鼠髁突软骨Bax mRNA表达水平和Bax mRNA/Bcl-2 mRNA的比值上升,但对Bcl-2 mRNA影响不大.     

间歇性完全鼻阻塞对幼年大鼠髁突软骨细胞凋亡影响的研究

目的 研究幼年大鼠在双侧间歇性鼻阻塞情况下双侧髁突软骨细胞的凋亡情况,来尝试探讨间歇性鼻阻塞对张口呼吸儿童髁突软骨发育的影响。方法 将20只4周龄大鼠（Sprague-Dawley rat,SD rat）分为2组,A组：双侧鼻阻塞组,常氧条件下鼻孔双侧阻塞8 h（8.00AM-16.00PM）,持续35 d;B组：对照组 ,常氧条件下饲养 。2组给予同样的饮食以及饮水,然后分别取出双侧髁突,用甲醛保存做成石蜡切片,同时进行caspase-3以及Bcl-2,Bax蛋白免疫组化染色。以观察在双侧鼻阻塞对髁突前斜面中上部软骨细胞增殖以及凋亡的影响,以及双侧间歇性鼻阻塞情况下Bcl-2基因家族的调控机制以及与下颌骨生长发育的关系。结果 在间歇性双侧完全鼻阻塞情况下,SD幼年大鼠双侧髁突软骨细胞凋亡较对照组明显增加。结论 双侧鼻阻塞的未成年大鼠前斜面中上部髁突细胞Bcl-2蛋白以及Bax蛋白,Caspase-3, Bax蛋白表达均较对照组增加,Bcl-2蛋白表达数量实验组较对照组表达减少,髁突软骨细胞凋亡数量较对照组明显增加。     

体外周期性单轴压应力下髁突软骨细胞Raf激酶抑制蛋白(RKIP)的动态变化研究

目的:探讨体外周期性单轴压应力对大鼠髁突软骨细胞的Raf激酶抑制蛋白(RKIP)及其mRNA变化的早期影响,以助于阐明力学引起细胞应答反应的分子机制。方法:利用四点弯曲细胞力学加载仪对第3代大鼠髁突软骨细胞进行体外周期性单轴压应力加载,力值为4000μstrain,时间为0、15、30、60、120、240min。采用实时荧光定量PCR技术和Western blot免疫印迹技术研究大鼠髁突软骨细胞在周期性单轴压应力作用下RKIP及其mRNA变化。结果:大鼠髁突软骨细胞RKIP mRNA和蛋白表达呈现几乎相反的趋势。RKIP mRNA的表达于30min上升(P<0.001),60min达到高峰后迅速回落,低于细胞的正常基态水平;而RKIP的蛋白表达30min开始下调(P<0.001),持续至120、240min时回升。结论:RKIP在髁突软骨细胞的早期力学应答机制中可能扮演着相当重要的作用,其蛋白和mRNA水平表达变化不同,转录水平的调控最终要影响蛋白水平的表达。     

单侧前牙反牙合对大鼠下颌髁突软骨内CaR、PTHrP表达的影响研究

目的　探索单侧前牙反牙合（unilateral anterior crossbite,UAC）对大鼠下颌髁突软骨内钙离子敏感受体（calcium-sensing receptor,CaR）、甲状旁腺激素相关蛋白（parathyroid hormone-related protein,PTHrP）分子表达以及软骨细胞增殖和发育的影响。方法　选择6周龄雌性SD大鼠48只,根据实验时间点（2、4、8周）随机分为3大组,每大组再随机分为2组（对照组、UAC实验组）,每组动物数量8只。对SD大鼠施加UAC刺激,于2、4、8周后分别处死各组大鼠,对颞下颌关节软骨进行CaR、PTHrP、PTHrP 受体（PPR）分子的免疫组化染色,提取软骨内mRNA进行增殖标志分子、软骨细胞表型分子和终末分化相关分子的Real-time PCR检测。结果　UAC实验组大鼠髁突软骨2周时即开始出现CaR的表达增高,4周时继发有PTHrP的表达上调,但是其惟一受体PPR的表达从2周时即显著降低;增殖标志分子和软骨细胞表型分子的表达从2周时开始显著降低,终末分化相关分子的表达从4周开始显著增高。结论　UAC可导致下颌髁突软骨内CaR、PTHrP表达改变,进而影响软骨细胞的增殖和分化状态。     

胰岛素样生长因子-Ⅰ及其与髁突软骨发育的调控

出生后的髁突软骨处于复杂的力学微环境中,其生长改建的生物学基础是髁突软骨细胞的增殖和分化。胰岛素样生长因子(IGF)-Ⅰ是髁突软骨生长发育过程中重要的生长因子之一。在细胞学水平,IGF-Ⅰ受胰岛素样生长因子连接蛋白(IGFBP)调控,通过与其受体的结合、激活来发挥生物学效应,其中包括调控细胞增殖、分化及程序性死亡,加快髁突软骨基质合成,参与髁突软骨细胞内力学信号的转导等。本文就IGF-Ⅰ及其受体,IGFBP及IGF-Ⅰ调控髁突软骨发育及其机制的研究作一综述。     

雌激素浓度对大鼠髁突软骨细胞中雌激素受体表达的影响

目的:探索有利于原代髁突软骨细胞生长、促进Ⅱ型胶原蛋白(collagen type Ⅱ,Col Ⅱ)表达的有效雌激素浓度.方法:提取4周龄雌性SD大鼠髁突软骨细胞,进行髁突软骨细胞鉴定,并测定细胞生长曲线.应用不同浓度雌激素对软骨细胞进行处理后,CCK-8试剂盒对软骨细胞增殖进行测定,实时定量PCR(RT-PCR)及蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)技术测定软骨细胞雌激素受体(ertrogen receptor,ER)α、β和Col ⅡmRNA和蛋白的表达量.结果:与对照组相比,10-9mol/L的雌激素对软骨细胞增殖和ERα表达的促进作用优于其他组(P＜0.05);10-7mol/L的雌激素对Col Ⅱ的促表达作用优于其他组(P＜0.05);而雌激素浓度的变化会对ERβ的表达产生抑制作用,10-10mol/L较其他组为显著(P＜0.05).结论:雌激素在一定浓度下可促进髁突软骨细胞增殖及ERα和Col Ⅱ表达,抑制ERβ的表达.     

甲状旁腺相关蛋白及其受体PTH1R及Ihh信号在鼠胚髁突软骨中的分布特征

目的探讨甲状旁腺相关蛋白(PTHrP)及其受体PTH1R及Ihh信号在髁突软骨发育过程中的分布特征及意义。方法取E14~18 d鼠胚,以免疫组化及原位杂交染色方法,检测PTH1R抗体及PTHrPI、hh mRNA在下颌髁突软骨发生过程中的分布特征。结果在鼠胚下颌髁突软骨发育过程中,PTHrP、PTH1R主要表达于软骨膜间质细胞、软骨细胞及大部分肥大软骨细胞中,Ihh主要位于肥大软骨细胞上层及其与扁平细胞层交界处,PTHrP及Ihh信号可能通过自分泌和(或)旁分泌作用调控髁突软骨细胞的增殖和分化。结论鼠胚下颌髁突软骨发育过程中,PTHrP、PTH1RI、hh的分布特征与其在生长板分布不同,提示PTHrP可能对髁突全层软骨细胞均具有增殖促进作用。     

单侧前牙反牙合大鼠髁突异常分化的软骨细胞中CaMKⅡ的表达变化

目的:研究实验性单侧前牙反牙合(unilateral anterior crossbite,UAC)对大鼠髁突软骨的致病意义及对促软骨细胞分化的CaMKⅡ表达的影响。方法:40只6周龄SD雌性大鼠,随机等分为UAC组和对照组,其中UAC组左侧上下切牙各戴一套筒冠并形成反牙合关系,对照组不作处理。于实验开始后4周和8周取材,HE和番红O染色观察髁突软骨的组织形态变化,免疫组织化学染色观察CaMKⅡ的表达,Real-time PCR测量相关基因表达水平的变化。结果:UAC组髁突软骨细胞分化异常,软骨变薄,基质减少,且随时间的延长而加重(P<0.05),CaMKⅡ阳性细胞百分数以及CaMKⅡ和Mmp-13的mRNA表达水平上调,但促增殖的Pcna以及软骨基质Col2a1、 Aggrecan的mRNA的表达水平下调。结论:UAC可导致髁突软骨异常分化并伴有CaMKⅡ的高表达。     

IGF-1对体外培养髁突软骨细胞增殖与凋亡的影响

目的：：研究IGF-1对IL-1β诱导的颞下颌关节软骨细胞增殖与凋亡的影响。方法：组织块培养法分离培养人髁突软骨细胞,通过细胞形态观察和免疫细胞化学染色进行鉴定。将培养的细胞分为：对照组、IL-1β组(10μg/L)、 IL-1β+IGF-1组(0、1、10、50、100μg/L), MTT法检测各组细胞增殖能力变化,流式细胞仪检测细胞周期分布以及细胞凋亡情况,Western blot检测各组细胞中凋亡相关因子Bcl-2、Bax和Caspase-3以及p38 MAPK/NF-κB蛋白表达变化。结果：人髁突软骨细胞生长状态良好,甲苯胺蓝染色胞质呈深蓝色,II型胶原呈阳性表达。与对照组比较,IL-1β组细胞增殖能力、Bcl-2/Bax比值明显降低,早凋与晚凋细胞百分数、Caspase-3、p38 MAPK/NF-κB蛋白表达均明显增加;与IL-1β组比较,1~100μg/L IGF-1预处理组细胞增殖能力、Bcl-2/Bax比值逐渐上升(P<0.05),细胞凋亡率、Caspase-3、p38 MAPK /NF-κB蛋白表达则逐渐下调(P<0.05),均呈现一定的浓度依赖性。结论：IGF-1可抑制IL-1β诱导的髁突软骨细胞凋亡并减轻p38 MAPK/NF-κB的活化。     

ALK2对小鼠髁突软骨细胞增殖分化的影响

目的:探讨ALK2对小鼠髁突软骨细胞增殖及成软骨分化的作用。方法:采用酶消化法提取小鼠髁突软骨细胞并鉴定。体外采用siRNA沉默小鼠髁突软骨细胞中Alk2基因的表达,通过MTT法检测细胞增殖。通过实时定量RT-PCR方法检测软骨细胞标志基因的表达。结果:倒置显微镜观察体外培养的小鼠髁突软骨细胞形态。免疫组化染色显示COLⅠ强阳性,AGGRECAN弱阳性,COLⅡ弱阳性。Pellet培养后实时定量RT-PCR检测发现ColⅡ,ColⅩ和ColⅠ表达上调。证实所分离的细胞是髁突软骨细胞。MTT结果显示Alk2沉默后细胞数量增加,实时定量RT-PCR结果显示Alk2沉默后软骨细胞基因表达下调,并有显著统计学意义。结论:ALK2抑制小鼠髁突软骨细胞的增殖,促进小鼠髁突软骨细胞的成软骨分化。     

Time course of expression of bcl-2 and bax in rabbit condylar chondrocytes following forward mandibular positioning

OBJECTIVE: To clarify the expression of Bcl-2 and Bax following forward mandibular positioning (FMP) in the condylar chondrocytes of rabbits. MATERIALS AND METHODS: Sixty rabbits at 8 weeks of age were randomly allocated to the experimental group (n = 36) and control group (n = 24). Rabbits in the experimental group were induced to FMP by a functional appliance. Six rabbits from the experimental group and four from the control group were sacrificed after 3 days and 1, 2, 4, 8, and 12 weeks, respectively. All the right temporomandibular joints (TMJs) were collected and the expression of Bcl-2 and Bax was evaluated by immunohistochemical staining. RESULTS: The results showed the expression pattern of Bcl-2 and Bax during 12 weeks after FMP. The expression of Bcl-2 reached the highest level at 1 week, whereas Bax reached its maximal expression after 4 weeks. Subsequently, the expression of Bcl-2 and Bax gradually decreased. The ratio of Bcl-2/Bax began to decrease 3 days after FMP and continued to decline until 12 weeks. CONCLUSIONS: FMP with functional appliances could change the expression of Bcl-2 and Bax, which is related to apoptosis in condylar chondrocytes.     

Effects of transforming growth factor beta 1 on the plasminogen activation system,collagen and integrin synthesis,and proliferation of rabbit mandibular condylar chondrocytes

The objective of this study was to identify the mechanism by which mandibular condyle chondrocytes regulate the extracellular matrix. Primary rabbit condylar chondrocytes were isolated, cultured, and treated with transforming growth factor beta 1 (TGF-β1). Cells were then assayed for the following: urokinase-type plasminogen activator (uPA) and its inhibitor (PAI-1), collagen types I and II, β1 integrin expression, and proliferative activity. TGF-β1 induced synthesis of collagen type II, αVβ1 integrin, and PAI-1. TGF-β1 induced the growth of chondrocytes and suppressed the synthesis of uPA. Chondrocyte regulation of the extracellular matrix is mediated by TGF-β1. Synthesis of collagen type II, αVβ1 integrin, and PAI-1 is induced, while uPA is suppressed. Also, TGF-β1 induces cellular growth.     

大鼠髁突软骨细胞冻存复苏后的生物学特性观察

目的观察低温冻存1月后,不同年龄大鼠髁突软骨细胞的生物学特性。方法体外培养出生后1天、7天、14天、28天共4组SD大鼠髁突软骨细胞。对冻存复苏后的细胞进行形态学观察;甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色检测其对糖胺聚糖(GAG)、Ⅱ型胶原的合成能力;台盼蓝拒染试验测定细胞成活率;MTT法观察细胞增殖能力;实时定量-聚合酶链式反应(real time-PCR)检测冻存后细胞增殖核抗原(PCNA)基因表达情况。结果低温冻存后,各年龄组大鼠髁突软骨细胞仍能保持软骨细胞特有的形态及特性;细胞成活率均大于90%;生长曲线近似"S"型;冻存后各年龄组细胞pcna基因表达较冻存前无显著统计学差异(P>0.05)。结论低温冻存1月后的大鼠髁突软骨细胞成活率高,并保持了其生物学特性及增殖活性。     

Immunohistochemical analysis of Bcl-2 and Bax oncoproteins in rabbit craniomandibular joint

The purpose of this study was to elucidate the expression of proto-oncogene Bcl-2 (anti-apoptotic) and Bax (pro-apoptotic) in fibrocartilage of the disc and hyaline cartilage of the condyle in the rabbit craniomandibular joint (CMJ). Ten New Zealand white rabbit heads were used. Sections were processed by the immunohistochemical techniques using mouse anti-Bcl-2 and anti-Bax antibodies. Intensity levels of immunostaining in condylar cartilage were quantified by a computer-image system. Immunoreactivity for Bcl-2 was mainly observed in the cytoplasm of the reserve cell and chondrocytic cell layers. A mild heterogeneous Bax expression was detected in the cytoplasm of chondrocytes of the upper hypertrophic layer and a few cells of the chondrocytic layer. The cytoplasm of chondrocytes in the disc exhibited a high intensity for Bcl-2, while Bax activity was only sporadically observed. We have shown that Bcl-2 and Bax proteins are present in CMJ cartilage and their expression patterns suggest that these oncoproteins are involved in chondrocyte survival or death via apoptotic pathways.     

Bcl-2和Bax在牵张应变诱导HPDLCs凋亡中的表达研究

目的：研究牵张应变诱导人牙周膜细胞（HPDLCs）凋亡过程中细胞凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达变化情况。方法：体外培养HPDLCs,利用动态机械应变细胞加载装置对HPDLCs加载20%动态牵张应变24h,通过real-time PCR检测Bcl-2和Bax在mRNA水平上的表达差异。结果：HPDLCs加载后,呈现栅栏状相互平行排列趋势,排列方向垂直于牵张力方向。Bcl-2和Bax基因表达显著增加,Bcl-2/Bax比值显著下降,有明显统计学意义（P〈0.05）。结论：牵张应变诱导人牙周膜细胞凋亡过程中,Bcl-2家族起到了重要作用。     

牵张力对大鼠髁突软骨细胞增殖及相关因子表达的影响

目的:观察牵张力对大鼠髁突软骨细胞增殖、炎性因子及Hedgehog通路基因的表达影响,探讨牵张力对软骨细胞的调控。方法:体外培养软骨细胞并鉴定。用Flexcell 4000TM加力板对细胞施加0.5 Hz,0%、3%和15%的牵张应变,作用4 h后检测细胞增殖情况,对比PCNA、Caspase-3、COL II、IL-1β、TNF-α及Hedgehog通路基因Ihh、Ptc和Smo的表达变化。结果:与对照组相比,3%组细胞增殖速度增加,PCNA、COLII、Ihh、Ptc和Smo的mRNA表达增加,15%组Caspase-3、IL-1β和TNF-α表达增加,而PCNA、Smo表达降低。与3%组相比,15%组细胞增殖速度降低,PCNA、COL II、Ihh和Smo表达降低,而Caspase-3、IL-1β表达增高。结论:不同强度牵张力对大鼠髁突软骨细胞增殖活性及炎性因子表达作用不同。Hedgehog通路对牵张力敏感,可能参与了力学刺激对软骨细胞的调控。