野生型斑马鱼胚胎中hoxd3基因mRNA的表达谱

目的:为探讨hoxd3基因在斑马鱼发育过程中与血管形成可能的作用机制,用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交,观测hoxd3基因在野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达情况。方法:提取斑马鱼胚胎总RNA,经RT-PCR扩增斑马鱼hoxd3基因片段,将得到的hoxd3基因片段和pCS2+质粒经EcoR I、Xba I双酶切后插入pCS2+质粒中,挑选阳性克隆,通过双酶切、菌落PCR以及测序鉴定;将pCS2+-hoxd3重组子经EcoR I酶切线性化,经T3RNA体外转录体系合成地高辛标记hoxd3基因的反义mRNA探针。用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交。结果:构建和鉴定了pCS2+-hoxd3重组质粒,经斑马鱼全胚胎原位杂交检测hoxd3基因的表达,发现在Tuebingen野生型斑马鱼24 hpf-72 hpf胚胎的中脑后脑交界处以及后脑中可以观察到hoxd3基因的表达。结论:hoxd3基因在Tuebingen野生型斑马鱼胚胎发育早期的神经系统高表达,未发现在血管生成区域的表达。     

腺苷酸活化的蛋白激酶在食管鳞癌中的表达及其临床意义

【摘要】 目的探讨HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的作用机制,从而为进一步研究其在造血发育中的功能奠定基础。方法提取斑马鱼总RNA,利用RT-PCR克隆得到HOXC4基因片段,将克隆得到的基因片段和载体pCS2+用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,把基因片段插入pCS2+中,重组质粒经双酶切及测序鉴定后,采用T3RNA聚合酶体外转录体系制备地高辛标记的HOXC4基因反义mRNA探针,然后行全胚胎原位杂交。结果构建HOXC4-pCS2+重组质粒,获得地高辛标记的反义mRNA探针并且完成其在野生型斑马鱼中的全胚胎原位杂交,显示HOXC4基因在Tuebingen野生型斑马鱼神经系统高表达。结论得到HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的基本表达情况,为进一步研究该基因在造血发育过程中的功能奠定了基础。     

HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达

目的 探讨HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的作用机制,从而为进一步研究其在造血发育中的功能奠定基础.方法 提取斑马鱼总RNA,利用RT-PCR克隆得到HOXC4基因片段,将克隆得到的基因片段和载体pCS2+用限制性内切酶BamHⅠ和Xho Ⅰ双酶切后,把基因片段插入pCS2+中,重组质粒经双酶切及测序鉴定后,采用T3 RNA聚合酶体外转录体系制备地高辛标记的HOXC4基因反义mRNA探针,然后行全胚胎原位杂交.结果 构建HOXC4-pCS2+重组质粒,获得地高辛标记的反义mRNA探针并且完成其在野生型斑马鱼中的全胚胎原位杂交,显示HOXC4基因在Tuebingen野生型斑马鱼神经系统高表达.结论 得到HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的基本表达情况,为进一步研究该基因在造血发育过程中的功能奠定了基础.     

野生型斑马鱼胚胎中hoxd3基因mRNA的表达谱

目的:为探讨hoxd3基因在斑马鱼发育过程中与血管形成可能的作用机制,用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交,观测hoxd3基因在野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达情况。方法:提取斑马鱼胚胎总RNA,经RT-PCR扩增斑马鱼hoxd3基因片段,将得到的hoxd3基因片段和pCS2+质粒经EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切后插入pCS2+质粒中,挑选阳性克隆,通过双酶切、菌落PCR以及测序鉴定;将pCS2+-hoxd3重组子经EcoRⅠ酶切线性化,经T3RNA体外转录体系合成地高辛标记的hoxd3基因的反义mRNA探针。用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交。结果:构建和鉴定了pCS2+-hoxd3重组质粒,经斑马鱼全胚胎原位杂交检测hoxd3基因的表达,发现在Tuebingen野生型斑马鱼受精后24 h～72 h胚胎的中脑后脑交界处以及后脑中可以观察到hoxd3基因的表达。结论:hoxd3基因在Tuebingen野生型斑马鱼胚胎发育早期的神经系统高表达,未发现在血管生成区域的表达。     

Pax5基因在野生型斑马鱼全胚胎发育早期的表达

[摘要]：目的 构建斑马鱼pCS2+-pax5重组质粒,经体外转录合成斑马鱼pax5基因的反义mRNA探针。方法 提取斑马鱼胚胎总RNA后经RT-PCR克隆斑马鱼pax5基因片段,将得到的pax5基因片段和pCS2+质粒经EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切后插入pCS2+质粒中,通过对重组质粒进行双酶切、菌落PCR以及插入片段序列测定鉴定后,经T3 RNA体外转录体系合成地高辛标记的pax5基因的反义mRNA探针。结果 采用RT-PCR和pCS2+载体等相关技术获得了斑马鱼pax5基因克隆,经酶切、菌落PCR以及测序鉴定证明得到了pCS2+-pax5重组质粒以及pax5基因的反义mRNA探针,经过斑马鱼全胚胎原位杂交技术检测了斑马鱼pax5基因在野生型斑马鱼发育过程中的表达情况。结论 成功构建了pCS2+-pax5重组质粒、制备了pax5基因的反义mRNA探针以及完成了野生型斑马鱼不同时相的全胚胎原位杂交。     

Nodal信号通路相关基因NOMO1在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达

目的:研究斑马鱼NOMO1基因在早期胚胎发育过程中的时空表达情况?方法:首先克隆斑马鱼NOMO1同源基因全长cDNA,然后运用半定量RT－PCR技术初步检测NOMO1基因在斑马鱼早期胚胎的表达情况,最后通过原位杂交技术检测NOMO1基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的时空表达情况?结果:通过半定量RT－PCR及原位杂交技术显示NOMO1从受精卵时期开始即有表达,在24 hpf(受精后24 h)之前,NOMO1基因表达广泛,并主要集中在中?内胚层?从24 hpf开始其表达主要集中于神经系统如前脑?中脑?小脑?脊索前板?眼和耳囊等处?在心脏处也有少量表达?结论:NOMO1基因对斑马鱼早期胚胎发育具有一定的作用,推测NOMO1基因影响早期心脏发育?     

hoxb4转基因斑马鱼造血发育中rap1b基因的表达

目的 为了发现在早期造血发育中关键的调控因子,利用hoxb4转基因斑马鱼研究rap1b基因的表达变化情况,以期明确hoxb4与rap1b在早期造血发育中的关系.方法 选取过表达hoxb4的斑马鱼系为研究对象,分为3组:实验组(表达hoxb4-EGFP的斑马鱼),实验对照组(表达EGFP的斑马鱼),空白对照组(野生型斑马鱼).通过流式分选技术将实验对照组和实验组18hpf(斑马鱼胚胎受精发育18h)、24、30、36、48hpf胚胎中带有绿色荧光(enhanced green fluorescent protein,EGFP)信号的细胞分选出来,利用实时荧光定量PCR检测分选出的细胞中的rap1b基因的表达变化;然后收集野生型斑马鱼多时相胚胎,制备rap1b基因的反义mRNA探针,通过胚胎原位杂交观察探针在3组斑马鱼胚胎18、24、30、36、48hpf杂交信号表达部位.结果 qRT-PCR结果显示实验组30、36、48hpf的斑马鱼胚胎的rap1b基因的表达明显增强(P＜0.05);制备了rap1b基因的反义mRNA探针,胚胎整体原位杂交结果显示:rap1b基因在3组斑马鱼胚胎18 ～ 48 hpf之间神经发育和造血发育部位都有表达.结论 在过表达hoxb4转基因斑马鱼中rap1b基因表达有明显的升高趋势,提示rap1b基因与hoxb4基因可能共同参与调节早期造血发育过程.     

胰岛素样生长因子结合蛋白-2参与斑马鱼胚胎心血管系统发育的实验研究

 目的 通过显微注射吗啡啉修饰的反义寡核苷酸制作斑马鱼IGFBP-2基因表达下调的动物模型,观察IGFBP-2表达下调导致斑马鱼胚胎心脏血管发育的异常表型及其对心脏发育相关基因表达的影响。方法 胚胎整体原位杂交验证IGFBP-2基因在斑马鱼胚胎发育早期的时空表达谱。特异抑制IGFBP-2基因启动子的吗啡啉（morpholino,MO）和标准对照吗啡啉（Con-MO）由Gene-Tools公司设计合成。设置0.05、0.10、0.25和1.0 mmol/L 4个不同浓度梯度的IGFBP-2 MO注射组,观察不同注射浓度对斑马鱼胚胎心脏异常表型发生率和死亡率的影响,并与Con-MO注射组以及野生型（Wild type,Wt）对照组比较。详细记录0.25 mmol/L浓度 IGFBP-2 MO注射组不同发育时段斑马鱼胚胎心脏发育的异常表型。荧光显微镜下观察IGFBP-2 EGFP重组质粒单独以及与IGFBP-2 MO或Con-MO共注射后12hpf胚胎的绿色荧光表达。原位杂交比较IGFBP-2 MO注射组与Wt组斑马鱼心房标记基因Amhc的表达情况;观察IGFBP-2基因下调的Vmhc-EGFP转基因斑马鱼心室特异性绿色荧光的变化;显微血管荧光造影显示IGFBP-2 MO注射组与Wt组胚胎外周血管发育的差异。结果 斑马鱼胚胎早期的发育过程中,IGFBP-2基因在眼球、中脑和肝脏先后表达。0.25 mmol/L浓度MO注射组12 hpf存活的胚胎在48 hpf有59.6%发生心脏发育的异常表型,包括心管搏动无力、心包水肿和房室环化障碍,部分胚胎发生心房扩大、房室反流伴循环瘀滞,且畸形随发育时间推移加重。接受单独显微注射IGFBP-2 EGFP重组质粒和与Con-MO共同注射的Wt胚胎12 hpf出现明显的绿色荧光表达,而重组质粒与IGFBP-2 MO共同注射的胚胎几乎无荧光表达,证实MO下调斑马鱼胚胎IGFBP-2基因的有效性。48 hpf胚胎整体原位杂交显示IGFBP-2 MO注射组心房特异标记基因Amhc的表达下调;48 hpf IGFBP-2基因下调的Vmhc-EGFP转基因斑马鱼心室特异绿色荧光蛋白的表达减弱;60 hpf IGFBP-2 MO注射组显微血管荧光造影显示体节间血管显影稀疏紊乱。结论 显微注射IGFBP-2 MO能够有效实现斑马鱼胚胎的IGFBP-2基因下调。IGFBP-2基因下调导致斑马鱼胚胎心脏血管的异常表型,并抑制心脏发生基因Amhc和Vmhc的表达。IGFBP-2在斑马鱼胚胎心血管系统的正常发育过程中起到重要作用。     

rpl15在斑马鱼胚胎中的表达形式探究

目的探究rpl15基因在野生型斑马鱼胚胎中的表达形式。方法利用NCBI和Ensemble数据库进行rpl15基因的共线性分析和Rpl15蛋白质序列相似性分析,使用MEGA X软件绘制进化树;构建pCS2~+-rpl15重组质粒,再利用T3聚合酶制备地高辛标记的rpl15反义RNA探针,用全胚胎原位杂交检测rpl15基因的mRNA水平的表达;通过Western blot检测24、48和72 hpf斑马鱼胚胎中Rpl15蛋白的表达。结果在进化过程中,rpl15基因相对保守。构建了pCS2~+-rpl15重组质粒,原位杂交结果显示在24 hpf,rpl15基因在斑马鱼的几乎所有细胞中广泛表达;到48 hpf,rpl15在中枢神经系统的表达最强并且在胰腺的表达也开始显现; 72 hpf仍然可见rpl15在后脑中的表达以及胰腺、肝和肠道中的表达。Western blot结果显示24、48和72 hpf斑马鱼胚胎中Rpl15蛋白的相对表达量随时间增加而增多。结论系统观察了斑马鱼发育过程中rpl15的表达部位及表达水平的变化,为斑马鱼rpl15缺失模型的建立提供了实验基础。     

地高辛标记斑马鱼cd99l2基因RNA探针的制备

目的 制备用于斑马鱼胚胎早期cd99l2基因时空表达检测的地高辛标记RNA探针.方法 设计引物,构建cd99l2/pGM-T重组质粒,用SacII和SalI分别进行酶切得到线性化DNA片段,以Sp6 RNA聚合酶和T7RNA聚合酶转录合成地反义和正义地高辛标记的RNA探针,用整体原位杂交法检测斑马鱼胚胎早期cd99l2基因的表达.结果 成功构建了cd99l2/pGM-T重组质粒,体外转录获得反义和正义RNA探针,反义探针杂交检测证实cd99l2基因在斑马鱼胚胎早期发育过程中中枢神经系统呈现高表达,正义探针未检测到表达信号.结论 本研究制备的反义cd99l2 RNA探针,兼顾了特异性和敏感性,能有效检测斑马鱼胚胎早期cd99l2基因的定位表达,而正义探针可以作为阴性对照,为进一步探究cd99l2基因在斑马鱼发育过程中的作用机制奠定了基础.     

吉非替尼对斑马鱼胚胎发育及肿瘤耐药基因表达的影响

目的 研究吉非替尼对斑马鱼早期胚胎发育及abcb4肿瘤耐药基因表达的影响.方法 实验动物采用斑马鱼,实验分为吉非替尼组、阿霉素和吉非替尼的混合液组、空白对照组.将吉非替尼稀释成不同浓度梯度的药液,分别处理受精后0.5～1.5 h(0.5～1.5 hpf)的斑马鱼胚胎,观察胚胎和幼鱼的死亡率、孵化率及畸形率变化.统计各浓度不同时间点的胚胎死亡率,计算出IC50的数值;统计48 hpf和72 hpf的胚胎孵化率及120 hpf的畸形率;收集不同组别的斑马鱼胚胎,通过实时荧光定量PCR,检测斑马鱼胚胎中abcb4基因的表达量.结果 计算出吉非替尼在斑马鱼胚胎中的IC50为16.18 μmol/L.与对照组比较,高剂量吉非替尼(≥20 μmol/L)显著抑制胚胎的孵化,并有明显的胚胎致死效应和致畸效应;吉非替尼组的斑马鱼胚胎abcb4基因的mRNA水平变化不显著,而阿霉素和吉非替尼的混合液组的abcb4基因的mRNA水平有明显变化(P＜0.05).结论 吉非替尼对斑马鱼早期胚胎中abcb4肿瘤耐药基因的表达水平无明显影响(P＞0.05),但是吉非替尼能逆转易耐药药物阿霉素的耐药作用,提示使用斑马鱼可以构建肿瘤耐药模型.     

g6pd基因在野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达

目的: 观察g6pd基因在野生型斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达情况。方法: 利用基因数据库和BLAST软件分别进行g6pd基因的共线性分析和G6pd蛋白质序列相似性分析。原位杂交技术观察不同时相斑马鱼胚胎中g6pd基因的表达;构建g6pd-EGFP-pCS²⁺重组质粒,并将其显微注射入斑马鱼胚胎内,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达;蛋白质印迹法检测24、48、72 hpf斑马鱼胚胎中G6pd蛋白的表达量;改良G6pd定量比值法检测24、48、72 hpf斑马鱼胚胎中G6pd酶活性。结果: g6pd基因在进化过程中相对保守,斑马鱼与人类的G6pd蛋白质相似度为88%,斑马鱼与小鼠的G6pd蛋白质相似度为87%。原位杂交试验结果显示,g6pd基因主要表达于斑马鱼的造血组织,显微注射g6pd-EGFP-pCS²⁺重组质粒后观察的结果与原位杂交试验结果一致。24、48、72 hpf斑马鱼胚胎中G6pd蛋白相对表达量分别为1.44±0.03、1.47±0.05、1.54±0.02,差异无统计学意义（P > 0.05）;G6pd酶活性分别为1.74±0.17、1.75±0.12、1.71±0.22,差异无统计学意义（P > 0.05）。结论: 成功观察到斑马鱼体内g6pd基因表达部位及其变化规律,并测定了不同发育时相斑马鱼胚胎中G6pd蛋白表达和酶活性,为建立斑马鱼G6PD缺乏症模型奠定了基础。     

ripply1在斑马鱼早期胚胎背腹发育中的作用

目的 探究ripply1基因在斑马鱼早期背腹轴发生过程中的作用。方法 利用斑马鱼整封原位杂交技术揭示ripply1基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达模式，通过显微注射技术在胚胎1细胞期注射ripply1的mRNA来高表达Ripply1蛋白并在后期观察胚胎背腹标记基因的变化及胚胎形态变化。利用Tol2转基因技术构建ripply1启动子驱动的GFP转基因鱼。结果 原位杂交结果显示ripply1基因在斑马鱼原肠早期胚盾期特异表达在胚盾处，即预定的背部。高表达ripply1后，在胚盾期背部标记基因表达范围扩大，腹部标记基因表达减弱，受精后24小时胚胎表现出严重的背部化表型：头部增大，腹部卵黄延伸减弱，尾部躯干及尾部区域减少，有的甚至形成了第二个体轴。得到的转基因鱼揭示ripply1母源表达，并且转录起始位点上游1200个碱基驱动的GFP能模拟内源基因的表达图式。结论 ripply1可能参与斑马鱼胚胎早期背腹轴的发生。     

COX基因在斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达

目的克隆斑马鱼COX-1、COX-2a基因,研究其在斑马鱼胚胎早期发育中的表达情况。方法提取24 h斑马鱼胚胎的总RNA,制备DIG标记的COX-1、COX-2a RNA反义探针,整胚原位杂交研究COX-1、COX-2a在斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达。结果 COX-1在囊胚期和原肠胚期为弥散性表达,18 h集中表达在后部躯干,到24 h,COX-1在输尿管和远端脊索处有表达,24～36 h,头部表达量高,48 hCOX-1的表达弱。COX-2a在原肠胚期前不表达,在10.8 h开始表达,位于前端神经外胚层,在26 h,COX-2a在前脑、小脑和后脑有特异性表达。结论明确了COX-1、COX-2a基因在斑马鱼胚胎发育过程中的表达模式,为研究该基因功能提供了一定的理论基础。     

非肌性肌球蛋白II-C在斑马鱼胚胎发育过程中的表达*

目的：分析NM II-C在斑马鱼胚胎发育过程中表达的时空变化。方法：收集不同发育阶段的斑马鱼胚胎，应用整体原位杂交技术研究NM II-C在斑马鱼胚胎发育过程中的表达变化情况。结果：受精后17和22小时，NM II-C由原先的广泛表达渐渐集中于前脑、中脑和后脑；受精后26和36小时，NM II-C表达分布到整个中枢神经系统；受精后48小时，NM II-C表达在脊髓变得很弱，主要集中于大脑。结论：揭示了NM II-C基因在斑马鱼胚胎发育过程中的时间和空间上的表达进程，为进一步探讨其在发育中的调控作用提供了实验基础。     

MMP21基因表达下调对斑马鱼心脏环化的影响

目的 探讨基质金属蛋白酶21(matrix metallopeptidase 21,MMP21)基因表达下调对斑马鱼胚胎发育的影响.方法 在斑马鱼胚胎1～2细胞期采用显微注射吗啡啉反义寡核苷酸(morpholino antisense oligonucleotides,MO)的方法下调MMP21基因的表达.10体节期用RT-PCR方法检测MMP21-MO的有效性.设置0.5、0.75、1 mmol/L和1.5 mmol/L 4个不同浓度梯度的MMP21-MO注射组,以标准对照吗啡啉反义寡核苷酸(Con-MO)注射组和野生型(WT)组为对照.体视显微镜下观察各组斑马鱼胚胎发育情况,统计分析不同注射浓度斑马鱼胚胎死亡以及畸形数量.整胚原位杂交检测心脏特异性标志物(cardiac myosin light chain 2,cmlc2)在受精后28 h(hours post fertilization,hpf)及受精后48 h的表达,体视显微镜下观察受精后72 h斑马鱼胚胎心脏,分析各时间点斑马鱼心脏环化情况.通过计数各组斑马鱼胚胎受精后24、48及72 h心率和测量各组胚胎受精后72 h时心室收缩分数(ventricular shortening fraction,VSF),评价MMP21基因表达下调对斑马鱼心脏功能的影响.结果 MMP21-MO能够有效抑制MMP21基因的表达.MMP21-MO对斑马鱼胚胎发育的影响存在一定的剂量反应关系.1 mmol/L MMP21-MO注射组胚胎畸形率最高,死亡率较低,畸形主要表现为心前区水肿、心脏环化异常、心脏搏动减弱和心率减慢.整胚原位杂交结果显示MMP21基因的表达下调导致心脏特异标志物cmlc2 mRNA在受精后28 h和受精后48 h时期异常表达,提示心脏环化前期阶段(cardiac jogging)和心脏环化(cardiac looping)过程异常.受精后72 h体视显微镜下观察斑马鱼心脏形态同样发现MMP21-MO注射组斑马鱼心脏环化异常.与对照组比较MMP21-MO注射组胚胎心率减慢,心室收缩分数下降.结论 MMP21基因表达下调导致斑马鱼心脏环化异常及心功能受损,MMP21基因可能在斑马鱼心脏环化过程中发挥重要作用.     

ptges3a基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达

目的克隆斑马鱼前列腺素E合酶3a(prostaglandin E synthase 3a,ptges3a)基因,研究其在斑马鱼胚胎早期发育中的表达情况。方法提取斑马鱼胚胎的总RNA,制备DIG标记的ptges3a RNA反义探针,整胚原位杂交研究ptges3a在斑马鱼胚胎早期发育过程的表达。结果 ptges3a在shield期前普遍性表达,10体节期在后脑神经龙骨处有特异性表达,18体节期在后脑有特异性表达,在26 hpf时期头部表达较多,并且在肾小管有特异性表达,36 hpf ptges3a在头部较高表达。结论 ptges3a可能参与了脑部发育和肾小管形成。     

isthmin 1对斑马鱼胚胎汇聚延伸运动的影响

目的在原肠期,斑马鱼胚胎细胞进行着外包(epiboly)、内卷(involution)以及汇聚延伸(convergence and extension)运动,对于胚胎的形态发生起关键作用。本文旨在研究isthmin 1(ism1)在斑马鱼胚胎发育中的表达图谱,并进一步探讨其在原肠期胚胎汇聚延伸运动中的功能。方法通过原位杂交技术,检测ism1在斑马鱼早期胚胎发育中的表达图谱;利用过表达和特异敲降等实验技术,活体拍照及原位杂交检测ism1对胚胎汇聚延伸运动的影响。结果整胚原位杂交实验结果显示ism1是合子表达的基因,在30%外包时期开始表达于胚胎背部,原肠期表达在整个胚胎边缘区,尤其在胚盾部位表达更为明显。活体拍摄及原位杂交结果表明,与野生型斑马鱼胚胎相比,过表达或敲低ism1均会使胚胎的汇聚延伸运动受到影响。结论 ism1是调控斑马鱼胚胎原肠期汇聚延伸运动的重要基因。