人自体血清培养的鼻中隔软骨细胞

目的：比较人自体血清和胎牛血清对人鼻中隔软骨细胞增殖和分化的影响。方法：实验于2004—08／2005—03在解放军第一军医大学珠江医院全军儿科中心实验室完成。①全血标本取自健康鼻中隔偏曲手术患者，男2例（分别为27岁和32岁），女1例（35岁），经患者知情同意。②自体血清的制备：抽取患者全血40mL，室温静置1h后，离心（1000r／min，30min）后取上清约加mL。③取手术患者的鼻中隔软骨分离软骨细胞进行原代培养，设人自体血清组和胎牛血清组，分别加含体积分数为0．1的自体血清和胎牛血清的1640培养基，并进行传代培养。④取第3代软骨细胞接种于培养板上培养，设人自体血清组、胎牛血清组和对照组（无血清培养），分别于培养后的第1，2，3，4，5，6天行四甲基偶氮唑盐检测。⑤取第2，3，4，5，6代软骨细胞接种于养板上培养，设人自体血清组、胎牛血清组和对照组，行软骨基质蛋白多糖含量（^35S-Na2SO4掺入量）测定。⑥取第2代软骨细胞，分别将人自体血清组和胎牛血清组的细胞接种于两个25mL的培养瓶中培养至细胞传代老化，观察细胞表型。 结果：①在体积分数为0．1的血清浓度下，人自体血清和胎牛血清对人鼻中隔软骨细胞增殖作用差异不明显（P〉0．05）。②人鼻中隔软骨细胞蛋白多糖合成量的比较显示两种血清对第2，3，4，5代软骨细胞软骨基质蛋白多糖的合成作用差异不明显（P〉0．05），但在第6代，人自体血清组软骨细胞蛋白多糖合成量明显高于胎牛血清组（P〈0．01）。③胎牛血清人鼻中隔软骨细胞到第6代几乎所有细胞变为梭形，人自体血清培养的软骨细胞到第7代以后才绝大部分变为梭形细胞，初步证实了人自体血清在维持鼻中隔软骨细胞表型方面也有一定的作用。 结论：人自体血清能够有效地促进软骨细胞增殖和蛋白多糖合成同时维持细胞表型。     

自体血清与胎牛血清培养兔关节软骨细胞的生物学特性

背景：目前培养软骨细胞多使用胎牛血清。但近年异种血清培养组织向临床应用的安全性受到质疑,因此自体血清培养越来越受到重视。目的：比较体积分数10%兔自体血清与体积分数10%胎牛血清培养兔关节软骨细胞生物学特性的差异。方法：兔自体血清培养液制备后,分离培养兔关节软骨细胞,分别在体积分数10%自体血清和体积分数10%胎牛血清中进行单层传代培养至1,3,5代,采用光镜观察细胞形态变化,绘制生长曲线评估细胞增殖速度,观察甲苯胺蓝染色、Ⅰ,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色结果,以流式细胞仪分析细胞Ⅰ,Ⅱ型胶原以及CD26,CD44的表达变化。结果与结论：①在细胞形态上自体血清和胎牛血清培养的软骨细胞差异不大。②自体血清培养的软骨细胞较胎牛血清培养的软骨细胞生长速度更快。③甲苯胺蓝染色结果示,无论是自体血清还是胎牛血清所培养的细胞,染色随代龄的增加逐渐变浅,细胞传至第5代时两组几乎均无异染。对于1代和3代细胞而言,自体血清培养的软骨细胞较胎牛血清所培养的软骨细胞较为深染。④Ⅰ型胶原的表达随代数的增加而增加,而Ⅱ型胶原的表达则随代数的增加而减少。在3代时自体血清培养的软骨细胞Ⅰ型胶原的表达水平低于胎牛血清培养的软骨细胞（P〈0.05）;在1代和3代时自体血清培养的软骨细胞Ⅱ型胶原的表达水平高于胎牛血清培养的软骨细胞（P〈0.05）。⑤CD26表达呈现先升高后降低的趋势,而CD44的表达不随传代数的增加而改变。提示同异体体积分数10%的胎牛血清相比,体积分数10%的自体血清培养的兔软骨细胞生长速度快,且在大部分指标上可以较好地保持细胞表型。     

兔软骨细胞与脱细胞软骨基质的生物相容性

目的:将体外培养的兔软骨细胞种植到脱细胞软骨基质上,进行细胞形态学观察、细胞黏附及增殖活性的测定,检测制备的脱细胞软骨基质与软骨细胞的相容性,分析脱细胞软骨基质作为软骨组织工程支架的可能性。方法:实验于2005-03/09在哈尔滨医科大学附属第二医院科研中心完成。选取兔龄6个月的清洁级健康雄性日本大耳白兔,麻醉后无菌条件下显露兔双侧膝关节,切取股骨远端和胫骨近端关节软骨,经脱细胞处理制备成脱细胞软骨基质微粒作为软骨支架,并分离培养软骨细胞。将培养至第2代的软骨细胞用于实验,随机分为脱细胞基质组和空白对照组,每组复孔为6孔。脱细胞基质组将脱细胞基质颗粒单层铺满培养板孔底,接种软骨细胞。空白对照组单纯接种软骨细胞。倒置显微镜及扫描电镜观察软骨细胞与脱细胞软骨基质的黏附情况,通过四甲基偶氮唑盐法检测细胞接种2,6,12,24h细胞黏附性,测定细胞接种后1,3,5,7d时细胞的增殖活性,测定细胞培养1,2,3d时上清液中的羟脯氨酸含量。结果:①软骨细胞在脱细胞基质上黏附的形态学观察:扫描电镜观察脱细胞基质颗粒呈不规则多角形,软骨巢内的软骨细胞消失,表面粗糙不平。倒置相差显微镜下观察软骨细胞刚开始为小圆形,折光性较强,接种2h后有少量细胞开始黏附于脱细胞基质上,随时间的延长细胞黏附数量增加。②接种后不同时间点两组软骨细胞黏附情况的测定结果:与空白对照组比较,接种2h时脱细胞基质组软骨细胞黏附性明显降低(P<0.05),而在接种6,12,24h时两组基本相似(P>0.05)。③接种后不同时间点两组软骨细胞增殖能力的比较:接种1,3,5,7d时,脱细胞基质组软骨细胞增殖活性分别高于空白对照组21.4%,32.7%,32.5%,25.4%,差异显著(P<0.05)。④接种后不同时间点两组软骨细胞羟脯氨酸含量的比较:接种后第1,2天,脱细胞基质组上清液中的羟脯氨酸含量与空白对照组接近(P>0.05)。接种第3天时,脱细胞基质组羟脯氨酸含量高于空白对照组20.28%,差异显著(P<0.05)。结论:实验制备的脱细胞软骨基质能够明显刺激增殖软骨细胞,且与软骨细胞具有良好的相容性,为组织工程支架的应用提供了新的材料。     

不同浓度血清对大鼠骨骺干细胞向软骨细胞分化的诱导效果比较

背景：血清成分复杂，其中不仅存在促细胞生长因子，同时也存在细胞生长抑制因子，因此合适的血清浓度对于体外培养细胞的增殖和分化至关重要。目的：比较不同浓度的胎牛血清对大鼠骨骺干细胞向软骨细胞分化的影响。设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2007—03／10在华中科技大学同济医学院附属同济医院矫形外科研究室完成。材料：纯系清洁级新生24h内的SD大鼠8只，用于制备骨骺干细胞。胎牛血清为Gibco公司产品。方法：免疫磁珠分离纯化FGFR-3阳性的骨骺干细胞，稳定传至第3代后，分别用含1．25％，2．5％，5％，10％胎牛血清的软骨诱导培养基进行干预，诱导14d。主要观察指标：BrdU．ELISA法检测细胞增殖活性。应用免疫荧光染色和RT—PCR法检测细胞Ⅱ型胶原的表达。结果：骨骺干细胞向软骨细胞诱导14d后，10％胎牛血清组细胞增殖活性显著高于1．25％，2．5％，5％胎牛血清组（P〈0．05）：10％胎牛血清组Ⅱ型胶原免疫荧光染色阳性程度及Ⅱ型胶原mRNA的表达均明显强于其他3组。结论：含10％胎牛血清的软骨诱导液更有利于骨骺干细胞向软骨细胞方向分化。     

兔骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的不同培养方法

背景：目前传统骨髓间充质干细胞的培养方法是应用异种血清为培养基，但其存在种间疾病传播、潜在免疫排斥反应甚至是伦理学争议等问题；且与卫生部公布的《组织工程化组织移植治疗技术管理规范》的要求相违背。自体富血小板血浆是生物自体的全血提取物，内含多种且含量丰富的生长因子。
　　目的：使用自体富血小板血浆替代传统异种血清，探讨其对兔骨髓间充质干细胞诱导分化为成骨细胞的影响，方法：从兔髂后上棘穿刺抽出8 mL骨髓并加肝素抗凝，密度梯度离心富集骨髓间充质干细胞，分为自体富血小板血浆组、胎牛血清组，分别加入含10%自体富血小板血浆、体积分数10%胎牛血清。在传至4代时将自体富血小板血浆组和胎牛血清组细胞各自分为实验组和对照组，实验组对培养及成分进行改变；对照组培养基不变。通过生长曲线测定各代细胞的增殖情况；通过对各组细胞进行碱性磷酸酶活性测定，判断其成骨分化状况。
　　结果与结论：骨髓间充质干细胞生长曲线可见各代细胞增殖良好。对第4代各组细胞进行碱性磷酸酶活性检测，培养第12天，第4代自体富血小板血浆实验组及胎牛血清实验组的碱性磷酸酶活性均显著高于其相应对照组；自体富血小板血浆组对照组、实验组碱性磷酸酶活性显著高于胎牛血清组的对照组、实验组，差异有显著性意义(P<0.01)。提示使用自体富血小板血浆替代异种血清培养骨髓间充质干细胞是一种安全可靠、操作简单、纯度活性高的诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化方法。     

骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养种子细胞特征及体内成软骨活性

目的:组织工程技术为解决关节软骨缺损修复这一难题提供了新的思路,但至今尚无一种细胞能完全满足软骨组织工程对种子细胞的要求.探讨以自体骨髓间充质干细胞与软骨细胞共培养为种子细胞修复关节软骨缺损的可行性,并评价修复效果.方法:实验于2005-03/2006-02在兰州大学骨科研究所组织工程实验室和连云港市东方医院骨科实验室完成.①取浓度为3×108 L-1的第2代骨髓间充质干细胞和软骨细胞,按2:1比例混匀共培养作为种子细胞,观察细胞的增殖和基质合成,绘制细胞生长曲线.②将细胞终浓度为3x 108 L-1的共培养细胞加入含有同种异体脱钙骨摹质的24孔培养板中进行接种培养2,4,6 d,计算共培养细胞与脱钙骨基质的黏附率.③取54只青紫兰兔制备全层关节软骨缺损模型,随机分为实验组、脱钙骨基质对照组、空白对照组,每组18只.实验组于软骨缺损处植入同种异体脱钙骨基质与共培养细胞;脱钙骨基质对照组植入脱钙骨基质;空白对照组不作任何植入.移植术后6,12周取出膝关节对修复组织进行大体、组织学评分和免疫组织化学观测.结果:54只青紫兰兔均进入结果分析.①共培养的软骨细胞基质合成丰富,细胞增殖加快.脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养第2,4,6天的黏附率分别为(46.50±1.40)%,(93.25±2.89)%和(88.34±0.76)%.②大体观察结果:实验组缺损修复组织呈软骨样,表面光滑平坦,与周围软骨整合的软骨细胞更为成熟,修复组织与软骨下骨结合牢固.脱钙骨基质对照组、空白对照组的修复组织呈纤维组织和无修复.③组织学评分:实验组优于脱钙骨基质对照组、空白对照组,差异具有显著性意义(P＜0.01),脱钙骨基质对照组与空白对照组比较差异无显著性意义(P＞0.05).④免疫组织化学染色显示实验组修复组织的细胞为透明软骨样细胞,柱状排列,Ⅱ型胶原染色阳性,与周围软骨及软骨下骨整合良好.结论:自体骨髓问充质干细胞与软骨细胞共培养作为种子细胞,骨髓间充质干细胞能增强软骨细胞的增殖,促进软骨细胞基质合成,缩短软骨细胞培养时间和减少传代次数,可节省大量的软骨细胞,与脱钙骨基质复合后能有效修复关节软骨缺损.     

同种异体血清体外培养兔膝关节软骨细胞的增殖

背景:兔关节软骨细胞体外单层培养采用胎牛血清培养基易去分化,有必要寻找合适培养基来提高兔关节软骨细胞培养质量。目的:观察同种异体兔血清对体外培养的兔膝关节软骨细胞增殖能力的影响。方法:以0.4%链霉蛋白酶和0.025%Ⅱ型胶原酶分离成年兔膝关节软骨细胞,将获得的软骨细胞随机分为实验组和对照组。实验组以体积分数10%异体兔血清+DMEM/F12培养;对照组以体积分数10%胎牛血清+DMEM/F12培养,传代培养至4代。结果与结论:实验组前4代软骨细胞增殖较对照组慢,但软骨细胞形态未发生明显改变而对照组软骨细胞出现去分化现象。提示体积分数10%异体兔血清培养利于维持软骨细胞增殖和形态的稳定,是较好的获取大量优良软骨细胞的体外培养方式。     

体外培养人鼻中隔软骨细胞合成硫酸糖胺多糖的检测

背景：软骨细胞的培养及稳定传代是转基因、构建组织工程化软骨组织及异体移植的前提条件。目的：定量检测体外培养人鼻中隔软骨细胞合成分泌硫酸糖胺多糖的变化情况，评价其对不同代次软骨细胞生物学功能活性。设计、时间及地点：对比观察的细胞学实验，于2004-01／2005—07在暨南大学组织移植与免疫教育部重点实验室完成。材料：人鼻中隔软骨细胞来自鼻中隔偏曲患者手术切除的软骨组织，患者对实验内容知情同意。方法：胶原酶消化分离原代人鼻中隔软骨细胞传代培养至第7代。主要观察指标：阿尔新蓝比色法测定各代细胞外基质的硫酸糖胺多糖含量，光镜观察甲苯胺蓝染色后细胞形态。结果：原代软骨细胞具有最高的硫酸糖胺多糖分泌活性，至第4代则出现了非常明显的下降，第4代以后很低下。甲苯胺蓝染色显示原代细胞对甲苯胺蓝呈明显的蓝色异染反应，第3代异染反应明显减弱，第4代以后异染反应微弱，其结果与硫酸糖胺多糖含量变化相一致。结论：人鼻中隔软骨细胞在体外培养过程中，随传代次数的增加而功能活性逐渐降低，第3代以后的细胞不适于作为人软骨组织工程种子细胞和用于细胞生物学等方面研究。     

兔软骨细胞与脱细胞软骨基质的生物相容性

目的：将体外培养的兔软骨细胞种植到脱细胞软骨基质上，进行细胞形态学观察、细胞黏附及增殖活性的测定，检测制备的脱细胞软骨基质与软骨细胞的相容性，分析脱细胞软骨基质作为软骨组织工程支架的可能性。 方法：实验于2005-03／09在哈尔滨医科大学附属第二医院科研中心完成。选取兔龄6个月的清洁级健康雄性日本大耳白兔，麻醉后无菌条件下显露兔双侧膝关节，切取股骨远端和胫骨近端关节软骨，经脱细胞处理制备成脱细胞软骨基质微粒作为软骨支架，并分离培养软骨细胞。将培养至第2代的软骨细胞用于实验，随机分为脱细胞基质组和空白对照组，每组复孔为6孔。脱细胞基质组将脱细胞基质颗粒单层铺满培养板孔底，接种软骨细胞。空白对照组单纯接种软骨细胞。倒置显微镜及扫描电镜观察软骨细胞与脱细胞软骨基质的黏附情况，通过四甲基偶氮唑盐法检测细胞接种2，6，12，24h细胞黏附性，测定细胞接种后1，3，5，7d时细胞的增殖活性，测定细胞培养1，2，3d时上清液中的羟脯氨酸含量。 结果：①软骨细胞在脱细胞基质上黏附的形态学观察：扫描电镜观察脱细胞基质颗粒呈不规则多角形，软骨巢内的软骨细胞消失，表面粗糙不平。倒置相差显微镜下观察软骨细胞刚开始为小圆形，折光性较强，接种2h后有少量细胞开始黏附于脱细胞基质上，随时间的延长细胞黏附数量增加。②接种后不同时间点两组软骨细胞黏附情况的测定结果：与空白对照组比较，接种2h时脱细胞基质组软骨细胞黏附性明显降低（P〈0．05），而在接种6，12，24h时两组基本相似（P〉0．05）。③接种后不同时间点两组软骨细胞增殖能力的比较：接种1，3，5，7d时。脱细胞基质组软骨细胞增殖活性分别高于空白对照组21．4％．32．7％,32．5％，25．4％，差异显著（P〈0．05）。④接种后不同时间点两组软骨细胞羟脯氨酸含量的比较：接种后第1，2天，脱细胞基质组上清液中的羟脯氨酸含量与空白对照组接近（P〉0．05）。接种第3天时，脱细胞基质组羟脯氨酸含量高于空白对照组20．28％，差异显著（P〈0．05）。 结论：实验制备的脱细胞软骨基质能够明显刺激增殖软骨细胞，且与软骨细胞具有良好的相容性，为组织工程支架的应用提供了新的材料。     

小牛与胎牛血清对体外培养骨髓基质细胞增殖与分化的影响

目的:观察小牛血清和胎牛血清对体外培养骨髓基质细胞增殖和分化的影响。方法:实验于2001-01/2004-12在吉林大学中日联谊医院骨科完成。①取四五月龄新西兰大白兔20只,体外培养骨髓基质细胞。②将传代培养的第2代骨髓间充质细胞按1×10/的细胞密度培养24h后,弃掉4孔培养液,用磷酸盐缓冲液洗3次。加入含有不同浓度胎牛血清及新生牛血清的HamF12培养基继续培养24h,采用四甲基偶氮唑盐比色分析法观察两种血清对骨髓基质细胞增殖和分化的影响,用酶联免疫检测仪测定各孔在570nm波长处的光吸收值。结果:①小牛血清及胎牛血清均有明显促进骨髓间充质干细胞增殖的作用,随着血清浓度的增加,光吸收值也随之增大。②同一浓度下的胎牛血清比小牛血清具有更明显的促进骨髓间充质干细胞增殖的作用。③10%浓度的胎牛血清对骨髓间充质干细胞的增殖作用最为显著。结论:小牛血清及胎牛血清均有明显促进骨髓基质细胞增殖的作用,胎牛血清在骨髓间充质细胞的体外增殖过程中,与小牛血清相比较,可使细胞的增殖更加活跃。