HCN2通道在炎症痛和神经病理痛发挥重要作用

痛觉感受器的动作电位发放频率是衡量痛程度的主要参考因素。而超级化激活环核苷酸门控阳离子通道(Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel,HCN)是影响动作电位发放频率的主要通道之一。HCN通道家族包含四个亚型,HCN1、HCN2、HCN3和HCN4,它们都表现为在膜电位-60至-90 mV时超极化引起的内向电流,称为Ih电流。在心肌,HCN通道的激活引起的电流是驱动心脏起搏的主要电流。四     

腰5脊神经结扎大鼠腰4背根神经节神经元超极化激活电流的变化

目的:研究腰5脊神经结扎(L5spinal nerve ligation,SNL)神经病理痛大鼠腰4背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)神经元超极化激活电流(Ih)及其通道超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(HCN)发生的可塑性变化。方法:以单侧L5SNL制备神经病理痛大鼠模型,运用全细胞膜片钳技术记录和分析背根神经节神经元Ih的表达和激活特性。结果:L5SNL之后,腰4 DRG神经元Ih的电流密度降低,单位电导下降,而翻转电位及电压依赖特性未发生显著性改变。结论:腰4DRG神经元Ih的这些变化可能贡献于L5SNL大鼠的神经病理痛。     

P物质诱导DRG神经元上超极化激活电流通道mRNA的表达

本研究运用RT PCR、细胞原位杂交分子生物学技术 ,以培养的DRG神经元为研究对象 ,观察P物质对超极化激活电流 (hyperpolarization activatedcationcurrent ,Ih)通道表达的影响。RT PCR结果表明 ,P物质浓度为 (mM ) 0 .5、5和 5 0与DRG神经细胞共培养一天 ,Ih通道mRNA表达无明显变化 ;共培养三天后 ,Ih通道mRNA表达明显上调 ;细胞原位杂交结果显示 ,中、小型DRG神经元上Ih通道的mRNA含量均明显增加 ,以小细胞增加最为显著。上述实验结果证明 ,P物质持续作用于DRG神经元 3天 ,可诱导Ih通道的表达 ,其中 ,小型细胞的变化较中型细胞更为明显。     

超极化激活的环核苷酸门控通道与心律失常新进展

随着心律失常发生机制研究的不断深入,有关超极化激活的环核苷酸(HCN)门控通道及其电流的研究也不断进展.越来越多的研究探讨HCN在心率变化、遗传性心律失常、心肌梗死心力衰竭后恶性心律失常发生中的重要作用,从而开发新的抗心律失常HCN通道药物,指导临床决策.     

荧光定量RT-PCR法检测超极化激活环核苷酸门控阳离子通道在窦房结中表达

目的:探讨超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide_gated cation channel,HCN)4种亚型在心脏窦房结组织中的表达.方法:准确切取心脏窦房结组织,从组织中分别提取RNA,反转录成cDNA后,应用SYBRGreen荧光染料建立荧光定量RT-PCR法,实时检测HCN各亚型表达,通过溶解曲线分析检测的特异性.结果:窦房结有HCN4、HCN2、HCN1 3种亚型的表达,且HCN4>HCN2>HCN1,所建立的荧光定量RT-PCR反应体系具有良好的特异性和敏感度.结论:成功应用SYBRGreen荧光染料建立定量RT-PCR体系,并检测到HCN4、HCN2、HCN1 3种亚型在窦房结中的表达.     

超极化激活环化核苷酸门控通道基因转染猪骨髓间充质干细胞

背景:研究证实超极化激活环化核苷酸门控通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated,HCN)电流在调控心脏的自发搏动中起着非常重要的作用.目的:观察HCN2基因重组腺病毒转染后猪骨髓间充质干细胞目的基因的表达及电生理特征.设计、时间及地点:细胞一基因学体外观察,于2007-07/2008-03在解放军第二军医大学胸心外科实验室完成.材料:Yorkshire猪由解放军第二军医大学动物所提供,HCN2质粒由意大利Dario DiFrancesco教授惠赠,重组腺病毒Ad.HCN2由本实验室采用Ad5系统构建并保存.方法:Percoll密度梯度离心+贴壁法体外分离纯化猪骨髓间充质干细胞,以感染复数=50进行Ad.HCN2转染,同时设立未转染组和转染Ad.Null组.主要观察指标:通过RT-PCR、免疫荧光染色检测各组细胞HCN2 mRNA和蛋白的表达,用全细胞膜片钳检测各组细胞电生理学变化.结果:未转染组和转染Ad.Null组均未见扩增片段,而Ad.HCN2扩增后在250-500 bp可见扩增片段,与携带HCN2基因的质粒扩增出的片段位置相同.转染后细胞核染色强度明显弱于胞膜和胞浆,与HCN2蛋白的分布相符合,未转染组及转染Ad.Null组无HCN2蛋白阳性表达.全细胞膜片钳可记录到起搏电流,其激活电位约为-60 mV,完全激活电位-140 mV,呈电压依赖性,当给予4 mmol/L CsCI后,内向的起搏电流即被明显抑制:未转染组及转染Ad.Null组细胞均无起搏电流.结论:通过起搏基因HCN2重组腺病毒载体可成功转染猪骨髓间充质干细胞,使其能够表达HCN2通道蛋白,全细胞膜片钳可检测到起搏电流.     

心外膜窦房结电图指导窦房结细胞取材的价值

目的探索经心外膜窦房结电图指导窦房结细胞取材的准确性。方法长白山乳猪12只,行心外膜窦房结电图标测,A波前出现圆顶形或上斜形波形为窦房结电图,又称为"P前波",于"P前波"处取材行窦房结细胞培养及超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(HCN4)免疫荧光定量测定。结果窦房结电图指导下窦房结细胞取材,培养的细胞有3种形态,即梭形、三角形与不规则形。培养梭形细胞较多,搏动频率较快;同时免疫荧光证实HCN4通道蛋白密度较高。结论窦房结电图提高窦房结细胞的取材的准确性。     

心脏电子起搏器时代与生物起搏替代的前沿话题

植入电子起搏器是目前治疗症状性缓慢心律失常的主要方法,然而它存在许多缺点.能否利用分子生物学原理发展生物起搏器成为大家关注的热点.通过转染编码If电流的超极化激活环核苷酸门控通道基因,过度表达超极化激活环核苷酸门控通道,增加心脏舒张期内向电流,从而在窦房结被抑制时提供起搏作用,这种利用基因治疗和细胞治疗构建的生物起搏在不久的将来可能会成为电子起搏器最为理想的替代方法.目的:总结超极化激活环核苷酸门控通道基因构建生物起搏的研究进展.检索策略:由该论文的研究人员应用计算机检索.Pubmed数据库1979-01/2007-06的相关文献.检索词"hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated nnel;biological pacemaker",并限定文章语言种类为English.共检索到157篇文献,对资料进行初审,纳入标准:①与生物起搏及超极化激活环核苷酸门控通道基因密切相关.②同一领域选择近期发表或在权威杂志上发表的文章.排除标准:重复性研究.文献评价:文献的来源主要是超极化激活环核苷酸门控通道基因的基础实验.所选剧的36篇文献中,10篇为综述,其余均为临床或基础实验研究.资料综合:①在4种异构体中超极化激活环核苷酸门控通道1,2,4是心脏中的主要部分,超极化激活环核苷酸门控通道3只在胚胎起搏细胞中有低水平表达.起搏活性小的区域(如心室肌),超极化激活环核苷酸门控通道2的表达占优势;而起搏活性高的区域超极化激活环核苷酸门控通道4的表达占优势.此外,超极化激活环核苷酸门控通道2在整个发育阶段,是心室的主要异构体,超极化激活环核苷酸门控通道2:超极化激活环核苷酸门控通道4的相当表达量在乳鼠为5:1,成年鼠为13:1.②超极化激活环核苷酸门控通道通道缺陷可导致病窦综合征.③到目前为止.转染编码If电流的超极化激活环核苷酸门控通道基因被认为是最有可能实现生物起搏的.结论:基因治疗和细胞治疗必将成为改善生物"起搏"功能最理想的方法,以超极化激活环核苷酸门控通道基因和细胞为主的生物起搏在缓慢性心律失常治疗中必将占有一席之地.     

超极化激活环化核苷酸门控通道2基因转染后293T细胞中目的基因的表达

背景:研究证实超极化激活环化核苷酸门控通道电流在调控心脏的自发搏动中起着非常重要的作用。目的:观察超极化激活环化核苷酸门控通道2基因重组质粒转染后293T细胞中目的基因在核酸和蛋白质水平的表达。方法:采用脂质体转染试剂Lipofectamine2000将含全长超极化激活环化核苷酸门控通道2基因的质粒CMV-hHCN2-3xHA-IRES-EGFP转染至293T细胞中。结果与结论:用脂质体转染试剂Lipofectamine2000成功地将质粒CMV-hHCN2-3xHA-IRES-EGFP转染至293T细胞中。反转录PCR定性地检测到在100-250bp处可见高度特异DNA的条带,与携带超极化激活环化核苷酸门控通道2基因的质粒扩增出的片段位置相同。经过RT-PCR、Western-blot方法检测提示超极化激活环化核苷酸门控通道2基因在mRNA和蛋白水平都有高表达。表明质粒CMV-hHCN2-3xHA-IRES-EGFP成功转染后的293T细胞中超极化激活环化核苷酸门控通道2基因可以在核酸和蛋白水平表达。     

超极化激活环化核苷酸门控通道2基因转染后293T细胞中目的基因的表达

背景：研究证实超极化激活环化核苷酸门控通道电流在调控心脏的自发搏动中起着非常重要的作用。目的：观察超极化激活环化核苷酸门控通道2基因重组质粒转染后293T细胞中目的基因在核酸和蛋白质水平的表达。方法：采用脂质体转染试剂Lipofectamine2000将含全长超极化激活环化核苷酸门控通道2基因的质粒CMV-hHCN2-3xHA-IRES-EGFP转染至293T细胞中。结果与结论：用脂质体转染试剂Lipofectamine2000成功地将质粒CMV-hHCN2-3xHA-IRES-EGFP转染至293T细胞中。反转录PCR定性地检测到在100-250bp处可见高度特异DNA的条带,与携带超极化激活环化核苷酸门控通道2基因的质粒扩增出的片段位置相同。经过RT-PCR、Western-blot方法检测提示超极化激活环化核苷酸门控通道2基因在mRNA和蛋白水平都有高表达。表明质粒CMV-hHCN2-3xHA-IRES-EGFP成功转染后的293T细胞中超极化激活环化核苷酸门控通道2基因可以在核酸和蛋白水平表达。     

HCN通道调控痛觉相关神经元兴奋性突触传递的研究进展

超极化激活环核苷酸门控阳离子(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation, HCN)通道广泛表达于中枢和周围神经系统,通过调控痛觉相关神经元的突触传入和电活动,在慢性疼痛的发生和维持过程中起着至关重要的作用。本文将HCN通道对痛觉相关神经元兴奋性突触传递的调控作用及机制加以综述,以期为慢性疼痛的治疗提供新思路。     

超极化13C磁共振的进展及应用

【摘要】近年来，超极化对比剂在MRI应用中得到了积极的发展。通过动态核极化(dynamic nuclear polarization，DNP)的方法使原子核自旋极化达到热平衡之上来增强分子磁共振信号，这一过程称为“超极化”(hyperpolarization，HP)。该技术克服了传统磁共振信号低、不能实时监测体内代谢过程的缺点。超极化13C磁共振成像在多种癌症及其他疾病的代谢影像学中显示出了一定的价值。本文综述了常用的超极化13C生物探针、超极化状态的获取、超极化13C 磁共振动物及临床研究的进展，并展望了其发展趋势。     

炎症痛敏大鼠背根神经与细胞Ih通道特征的变化及其参与痛？…

目的：超极化激活电流（Ｉｈ）通道对神经元动作电位的爆发超重要作用,本工作检验其在炎症痛中的作用。方法：用完全弗氏佐剂诱发关节炎模型,用全细胞电流钳、电压钳技术研究炎症后大鼠背根神经节（ＤＲＧ）细胞Ｉｈ通道的特性。结果：炎症大鼠ＤＲＧ细胞Ｉｈ通道的翻转电位、最大电流密度没有改变,说明Ｉｈ通道的结构及表达的数量没有变化。但Ｉｈ通道的半激活电位向去极化移动,说明Ｉｈ的活性增加;电流钳记录表明,炎症大鼠Ｄ     

大鼠背根神经节机械敏感性离子通道的生物物理学性质

目的探讨新生大鼠背根神经节(DRG)的机械敏感性离子通道(MS通道)生物物理学性质。方法取出新生大鼠DRG细胞,培养2~4d后,应用细胞贴附式和内面向外式膜片钳技术对细胞膜上的MS通道电流进行记录,对通道生物物理学性质,如压力-电流关系、电位-电流关系、动力学和离子选择性等进行了分析。采用的机械刺激方式为负压抽吸。结果压力可引起大鼠背根神经节上的机械敏感性非选择性阳离子通道开放,压力恒定时,电流恒定;去除压力,电流回到基线水平。在平衡溶液中,通道的电位-电流关系近似为直线。在膜电位为正值时,通道电流表现为外向电流,同时表现出外向整流特性,+40~+60mV电流的弦电导为(96.2±3.6)pS;当膜电位为负值时,通道电流表现为内向电流,-60~0mV斜率电导为(62.5±0.4)pS。通道的平均逆转电位为(-2.3±0.8)mV。通道的动力学分析表明压力可使短开放时间和长开放时间都明显升高,长关闭时间明显减少,而短关闭时间变化不大。结论分析了大鼠DRG神经元细胞膜上的MS通道的生物物理学性质,有助于进一步了解大鼠背根神经节神经元细胞电活动的机制。     

P物质通过PKCε抑制GABA激活电流

目的:揭示P物质(substance P,SP)在背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)神经元对GABA激活电流的调节机制.方法:运用金细胞膜片钳记录技术,在新鲜分离的DRG神经元记录GABA激活电流,以及SP对该电流的调节.结果:使用GABA(1～1000 μmol/L)能引起大多数DRG神经元(89.8％,114/127)产生浓度依赖性的内向电流,这一内向电流是由GABAA受体介导的,GABA (100 μmol/L)激活内向电流的幅值为1.9±0.6 nA(n=21).预加SP (0.001～1μmol/L)能明显抑制GABA激活的内向电流,SP对GABA激活内向电流的抑制作用能被选择性的NK1受体的阻断剂spantide (20 μmol/L,n=7)阻断,但不能被选择性NK2和NK3受体的阻断剂L659187(1μmol/L,n=7)和SR142801(1 μmol/L,n=7)阻断.SP对GABA激活内向电流的抑制作用也能被胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM、磷脂酶C(phospholipase C,PLC)的抑制剂U73122、蛋白激酶C(proteinkinase C,PKC)的抑制剂chelerythrine所阻断.另外,SP对GABA激活内向电流的抑制作用能被PKCε的阻断剂epilon Ⅴl-2特异性地阻断.结论:预加SP激活NK1受体,通过激活G-蛋白-PLC-Ca2+-PKCε途径磷酸化GABAA受体,抑制GABA激活内向电流,表明SP可通过抑制GABA介导的突触前抑制(pre-synaptic inhibition)易化伤害性信息在初级感觉的传递(尤其是痛觉).     

超极化磁共振波谱的原理和应用

通过动态核极化(dynamic nuclear polarization,DNP)的方法使原子核自旋极化达到热平衡之上来增强分子磁共振10,000倍以上的信号,这一过程称为超极化(hyperpolarization,HP)。溶解性DNP允许超极化分子以液体形式转移至生物体内,可实时观测体内的生物灌注、代谢产物的运输和代谢反应。该技术的发明克服了传统磁共振信号低,不能实时监测体内代谢过程的缺点。本文旨在介绍动态核极化的定义和技术、常用的超极化生物探针、超极化磁共振波谱图像的结果分析以及初步的动物实验和临床试验结果。     

血管紧张素Ⅱ对新生大鼠心室肌细胞HCN通道的影响机制的探讨

目的明确血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对新生大鼠心肌细胞超极化激活环核苷酸门控离子通道(HCN)电流的影响及其机制。方法用胶原蛋白酶技术分离新生SD大鼠心室肌获得单一的心室肌细胞,用全细胞膜片钳技术记录HCN通道电流(If);提取心肌细胞膜蛋白,用Western blot检测HCN蛋白的表达。结果 (1)将心室肌细胞暴露于AngⅡ(100mol/L)20min后,If显著增大(P <0.05);(2)AngⅡ增大If电流可被酪氨酸蛋白激酶抑制剂Genistein或PP2显著抑制;增大的通道酪氨酸磷酸化水平也被减小(P <0.05);(3)用硫氧还原蛋白受体阻断剂显著抑制AngⅡ增大的If(P <0.05);(4)If也可被非特异性蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)抑制剂显著增大(P <0.05)。结论 AngⅡ增大If,是通过ROS依赖性的酪氨酸蛋白激酶及其相关的硫氧还原蛋白系统,调控HCN通道的活性和表达。这将为氧化应激引起的细胞损伤和离子通道重构的调控的研究提供一个新的视点,为临床更有效地防治心律失常提供新的理论依据和治疗策略。     

构建人HCN4基因重组腺病毒载体及其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率

背景:超极化激活及环化核苷酸门控阳离子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel,HCN)基因由于具有不增加诱发心律失常的风险、能够接受自主神经系统调节等优势,成为目前最受关注的生物起搏备选基因.目的:构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体,并测定其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率.设计、时间及地点:细胞-基因学体外实验,于2008-02/09在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成.材料:SD大鼠10只,由中山大学实验动物中心提供.携带目的基因人HCN4 cDNA的质粒pcDNA3.1-HCN4、人胚肾293细胞、大肠杆菌DH5α由中山大学附属第二医院林百欣实验中心保存.腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV、骨架质粒pAdxsi购自北京诺赛基因组研究中心有限公司.方法:质粒pcDNA3.1-HCN4用Hind Ⅲ+Xba Ⅰ双酶切后回收HCN4片段,亚克隆至pShuttle-CMV中,得到重组穿梭质粒;1-Ceu Ⅰ+1-Sce Ⅰ双酶切处理pShuttle-CMV-HCN4,回收CMV-HCN4片段,亚克隆至腺病毒骨架载体pAdxsi,得到重组腺病毒质粒;重组腺病毒质粒酶切线性化后,应用脂质体法转染293细胞进行包装扩增,得到重组腺病毒AdHCN4;应用AdHCN4转染大鼠骨髓间充质干细胞.主要观察指标:重组腺病毒质粒载体的鉴定,重组腺病毒的鉴定及滴度测定,重组腺病毒的感染效率.结果:构建的重组穿梭质粒pShuttle-CMV-HCN4用Hind Ⅲ+Xho Ⅰ双酶切,得到大小为3 600 bp(HCN4)和5 100 bp(pshutIle-CMV)两个片段,DNA测序结果证实人HCN4基因的全长序列已正确插入到pShuttle-CMV穿梭质粒中;重组腺病毒质粒pAdxsi-CMV-HCN4用Xho Ⅰ酶切得到7个片段,而作为对照的空腺病毒质粒只得到6个片段;重组腺病毒质粒在293细胞中包装后产生的重组腺病毒对293细胞有致病作用;重组腺病毒AdHCN4 PCR鉴定可见657 bp的阳性扩增条带;经多次重复感染后,病毒滴度检测达2.5×10~(11) PFU/mL.成功转染AdHCN4的大鼠骨髓间充质干细胞可表达绿色荧光蛋白,当病毒感染复数值为800,转染效率最高,达90%.结论:实验成功构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体,并可在体外有效转染大鼠骨髓间充质干细胞.     

TRPM8的研究进展

瞬时受体电位通道(transient receptor potential,TRP)是位于细胞膜上的一类重要的阳离子通道超家族。TRP通道分布广泛,调节机制各异,通过感受细胞内外环境的各种刺激,参与痛觉、机械感觉、味觉的发生和维持细胞内外环境的离子稳态等众多生命活动,具有调节肌肉收缩、递质释放、细胞增殖、细胞分化、基因转录、细胞凋亡及细胞死亡等作用。TRP通道亚型TRPM8是一种非选择性阳离子通道,最初作为一种前列腺特异性蛋白被克隆出来,现发现在结肠癌、肺癌、乳腺癌以及皮肤来源的恶性肿瘤中均有表达。TRPM8可以被冷刺激和薄荷醇激活,TRPM8参与温度觉和疼痛觉调控,并可调节血管收缩和扩张,尤其是TRPM8在调节细胞生长和死亡方面具有重要的作用,为我们研究肿瘤的发生发展提供了重要的研究线索。     

VRAC通道与脑内兴奋性氨基酸释放的研究进展

大多数哺乳动物的细胞发生细胞肿胀时可激发一种阴离子电流[1,2],在生理情况下主要是氯离子电流,所以通常又称为肿胀激活的氯离子电流(ICL,swell),将其通道称为体积调节性阴离子通道(volume regulated anion channel,VRAC)[3].