大鼠TGF-β1 mRNA表达水平的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法的建立

目的　建立检测大鼠TGF- β1mRNA表达水平的SYBRGreenⅠ荧光定量RT- PCR方法。方法　摸索SYBRGreenⅠ工作液的配制方法,筛选PCR反应液,优化反应中引物和MgCl2 的浓度,以actin为对照,建立大鼠TGF -β1mR NA表达水平的SYBRGreenⅠ荧光定量RT PCR方法并检测大鼠肾皮质TGF -β1mRNA表达水平。结果　SYBRGreenⅠ工作液,4 0倍水溶液稳定性好,最佳反应稀释度为1∶1 0 0 0 0。大鼠TGF β1表达水平的SYBRGreen荧光定量PCR方法,TGF- β1和actin的最佳MgCl2 反应浓度分别为2 5mM和3 5mM ,引物浓度分别为0 . 8μM和0. 5μM ,特异扩增产物的熔解温度分别为88 1和88 .6℃,因此选择在85℃时收集荧光信号。正常大鼠TGF- β1的Ct值在2 9 0 3,actin的Ct值在2 4 .86 ,扩增效率分别为0 . 995和1 . 0 8。结论　通过优化反应条件和特异性分析,成功地建立了特异、敏感的大鼠TGF- β1mRNASYBRGreenⅠ荧光定量RT PCR。SYBRGreenⅠ荧光定量PCR快速、敏感、特异、经济,可以满足临床和科研的需要。     

实时荧光定量RT—PCR检测肺癌中PUMA mRNA的表达

目的 建立检测肺癌PUMA mRNA的实时荧光定量RT-PCR方法,初步探讨PUMA mRNA表达水平与肺癌发生发展的关系.方法 以GAPDH作为内参照基因,应用实时荧光定量RT-PCR,检测PUMA mRNA在肺癌组织中的表达水平.结果 建立了应用实时荧光定量RT-PCR检测肺癌PUMA mRNA的方法.熔解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳结果证实了PCR反应的特异性;相对定量结果显示,40例肺癌患者的肿瘤组织、对应的癌旁组织、远癌组织和10例肺良性病变组织中均有PUMA tuRNA的表达,表达水平在肺癌与肺良性病变之间、肺癌各病理类型之间差异均无统计学意义(P>0.05).结论 应用SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR可以特异、准确、快速地分析不同肺组织中PUMA mRNA的表达差异.非小细胞肺癌的发生发展与PUMA mRNA的表达无明显相关性.     

超极化激活环核苷酸门控的超极化阳离子通道在神经系统中的分布与功能

对超极化激活环核苷酸门控的超极化阳离子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel,HCN)的研究起源于Ih的发现,1976年Noma首次报道在家兔心脏窦房结组织记录到一种超极化激活的内向电流,称为If.随后在感光细胞和海马CA1区的锥体细胞也记录到这种超极化激活的内向电流,称为Iq.在神经系统,这种超极化激活电流称为Ih.1997年发现介导Ih的离子通道HCN,此后2年间陆续克隆出多种HCN通道,其中在哺乳动物有4种,分别为HCN1、HCN2、HCN3、HCN4.这4种HCN亚型在异源细胞表达中都表现出同源聚合、超极化激活、cAMP调节的非选择性阳离子电流,但其动力学、稳态电压依赖性和cAMP对它们的调节表现不同.随着HCN的成功克隆,从90年代末开始,对HCN分子结构、特征、分布和功能进入了全面的研究.     

SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测生存素基因的方法建立及条件优化

目的建立SYBRGreenⅠ染料实时定量PCR检测生存素（Survivin）基因定量的方法。方法根据PCR产物荧光强度、循环阈值（Ct值）、标准曲线斜率、相关系数和熔解曲线优化反应体系中各组分的量及反应条件，对引物二聚体消除策略和Ct值获取方式进行评价。并用该方法检测43份胃癌组织Survivin基因扩增情况。结果SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR体系扩增Survivin的最佳组成和条件是：Taq酶2．5U／100μl、MsCl2 2mmol／L、引物浓度0．2μmol／L和退火温度58℃；在PCR循环延伸结束后设置1个低于特异产物退火温度值2℃的荧光读取温度，能有效消除引物二聚体对定量检测的影响；以二次倒数最大值方式确定Ct值，能避免主观因素所致误差。研究建立的SYBRGreenⅠ染料实时定量PCR检测Survivin基因含量方法的灵敏度为10拷贝／μl，线性范围10^1～10^4拷贝μl（r=0．9997），批内变异系数（CV）1．13％-1．91％，批间CV3．31％-4．50％；胃癌组织中Sttrvivin基因扩增率为13．9％（6／43）。结论优化后的SYBRGreenI实时定量PCR方法具有方便、经济、灵敏度高和重复好等特性，可用于Survivin基因含量分析。     

TrkB-shiRNA质粒转染心脏微血管内皮细胞

背景:脑源性神经营养因子与其受体TrkB在心脏与骨骼肌内皮细胞存在表达,在心脏血管系统的发育中及骨骼肌缺血时能有效促进血管新生,但其促血管新生的细胞与分子机制尚不清楚.目的:应用针对脑源性神经营养因子受体TrkB的shiRNA质粒对心脏微血管内皮细胞进行转染,观察TrkB 3种亚型的表达及心脏微血管内皮细胞的生长状况和形态,初步探讨脑源性神经营养因子TrkB通路在心脏微血管内皮细胞中的调控作用.方法:使用TrkB-shiRNA质粒转染大鼠心脏微血管内皮细胞,应用荧光实时定量PCR检测TrkB的3个亚型,TrkB-FL、TrkB-T1及TrkB、T2 mRNA的表达,并观察经转染的心脏微血管内皮细胞的增殖情况.结果与结论:应用TrkB-shiRNA质粒转染心脏微血管内皮细胞后,TrkB 3种亚型在转染后的4 d内mRNA表达均下降(P<0.05或P<0.01),且经转染的心脏微血管内皮细胞的生长变慢.说明TrkB-shiRNA质粒可沉默心脏微血管内皮细胞的TrkB-FL、TrkB-T1及TrkB-T2的表达,且TrkB表达被抑制可能会影响心脏微血管内皮细胞的增殖.     

实时定量逆转录PCR检测慢性淋巴细胞白血病MDM4基因mRNA的表达及其临床意义

本研究旨在探讨慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者鼠双微体4(MDM4)基因mRNA的表达情况及其在CLL预后中的意义.采用SYBRGreenⅠ荧光染料行实时定量逆转录PCR(qRT-PCR)方法检测66例CLL患者白血病细胞MDM4 mRNA的表达,以β-actin为内参照物,以2(-△Ct)方法计算MDM4的相对定量值...     

大鼠骨髓间充质干细胞移植梗死心肌HCN2及HCN4基因的表达

背景:研究表明在多种心脏疾病后的心室肌中HCN2和HCN4表达异常,且与室性心律失常密切相关.骨髓间充质干细胞移植可修复受损心肌,但对梗死后心室离子通道重构的影响仍不清楚.目的:检测大鼠骨髓间充质干细胞移植入梗死心肌后左心室HCN2和HCN4的表达变化.方法:取3周龄SD大鼠5只,Percoll法分离培养骨髓间充质干细胞.成年健康雄性SD大鼠30只,随机分为4组:DMEM组、细胞移植组大鼠建立急性心肌梗死模型,假手术组只穿线不结扎,正常对照组不进行任何干预.造模后4周,DMEM组在梗死边缘区和中心区分5点注入DMEM培养液,细胞移植组同法注入第3代骨髓间充质干细胞悬液200 μL,细胞数5×10~6个.采用RT-PCR及Western-blot法检测左心室HCN2,HCN4在mRNA及蛋白水平的表达.结果与结论:正常心肌区:各组HCN2,HCN4 mRNA及蛋白的表达基本相似(P > 0.05).梗死边缘区:DMEM组HCN2,HCN4 mRNA及蛋白的表达明显多于正常对照组、假手术组(P < 0.05);细胞移植组HCN2,HCN4 mRNA及蛋白的表达明显少于DMEM组(P < 0.05).梗死中心区:DMEM组HCN2,HCN4 mRNA及蛋白的表达明显少于正常对照组、假手术组(P < 0.05);细胞移植组HCN2,HCN4 mRNA及蛋白的表达与DMEM组基本相似(P > 0.05).提示急性心肌梗死后梗死边缘区HCN2,HCN4基因在mRNA和蛋白水平的表达升高,骨髓间充质干细胞移植可能通过下调梗死边缘区HCN2,HCN4的表达来降低心律失常.     

双重荧光定量RT-PCR法检测柯萨奇病毒A2和A5型

目的建立同时检测柯萨奇病毒A2和A5型(CVA2、CVA5)的双重实时荧光定量RT-PCR法。方法用Primer Express3.0软件设计高度特异性引物和荧光标记探针。通过优化反应体系,建立标准曲线,并评价双重荧光定量RT-PCR法的特异性、灵敏度和重复性。用建立的方法检测367例疑似手足口病患儿的粪便标本,并对阳性结果测序验证。结果荧光定量RT-PCR结果表明本实验所选的引物和探针可特异性检测并区分出CVA2、CVA5亚型,与其他肠道病毒的阳性核酸未发生交叉反应。该方法最低检测限达到102copies/m L,批内变异系数(CV)均1.49%。367份临床标本中CVA2型阳性23份,阳性率6.3%;CVA5阳性11份,阳性率3%,检测阳性结果与测序结果一致。结论成功建立了在单管中同时检测并鉴别CVA2、CVA5型的双重实时荧光定量RT-PCR检测方法。该方法具有较好的灵敏度、特异性、重复性,可用于CVA2、CVA5型引起的暴发疫情的快速筛查和手足口病的流行病学的研究。     

荧光定量RT-PCR实时检测心脏移植患者外周血单核细胞16种免疫排斥基因整体表达变化的初步研究

目的 探讨外周血单核细胞免疫排斥相关基因的检测时心脏移植排斥反应的诊断价值.方法 采取心脏移植术患者外周血,应用实时荧光定量RT-PCR技术,观察心脏移植术后不同时期外周血单个核细胞中与免疫排斥相关多个基因系统的mRNA表达水平,并与术前和正常组的基因表达水平对照.结果 心脏移植术前外周血单个核细胞16种与免疫排斥相关候选基因的mRNA的相对表达量与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05).初步筛选出与机体免疫排斥状态有更大相关性的7种基因,术后3个月内心脏功能稳定组较术前和正常对照组ITGA4、FKB、IL1R-2 mRNA表达水平上调,PF4、ITGAM、TGFβ1、RHOU表达水平降低.这与临床观察的移植术后1～3个月免疫排斥概率最大相吻合.结论检测外周血单个核细胞基因mRNA表达水平的荧光定量RT-PCR方法 简便快速、特异、重复性好、可信度高,但在检测心脏移植排斥反应方面值得进一步深入研究.     

实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测火器伤骨折愈合过程中骨形态发生蛋白的表达

目的应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测兔火器伤骨折愈合过程中骨形态发生蛋白（BMP）-2mRNA水平。方法建立外固定架固定一期治疗兔股骨火器伤骨折的动物模型和BMP-2mRNA表达水平的SYBRGreenI荧光定量RT-PCR方法，分别于术后第1、2、3、4周取断端组织，通过实时荧光定量RT-PCR检测标本标本中BMP-2mRNA水平。结果在对照组：创伤后的兔骨组织BMP-2mRNA表达水平在1周开始增高。在第2周达到高峰后下降，第4周即可恢复正常。而实验组，受枪伤的兔骨组织BMP-2mRNA表达水平在第3周表达最高，与对照组相比，升高较慢，表达量也偏低（P〈0．05）。结论BMP-2mRNASYBRGreenI荧光定量RT-PCR可以很好地反应枪击伤对兔骨组织BMP-2mRNA表达水平的影响。枪击伤后的兔骨组织BMP-2mRNA表达水平与对照组相比升高较慢，表达量也偏低。