人脑胶质瘤干细胞分化为血管内皮细胞的实验研究

目的 探讨体内外原代培养的人脑胶质瘤干细胞(GSCs)与胶质瘤新生血管内皮细胞的关系.方法 新鲜高级别(WHOⅢ级、Ⅳ级)的人脑胶质瘤标本经原代培养获取GSCs,免疫组化法检测其肿瘤干细胞及干细胞标记物Nestin的表达;鉴定后的GSCs经低氧诱导,免疫荧光法检测其诱导分化后内皮细胞标记物CD31、CD144和胶质瘤细胞标记物GFAP的表达,RT-PCR和Western-blot法检测其CD31的表达;建立胶质瘤干细胞皮下荷瘤裸鼠模型,免疫组化技术检测模型中人来源的CD31的表达.结果 (1)悬浮生长的胶质瘤干细胞球样细胞经免疫组化鉴定Nestin表达阳性;(2)低氧诱导后的GSCs能够表达CD31、CD144,有些细胞能够同时表达CD144和GFAP;(3)RT-PCR检测发现GSCs在诱导前后都有CD31 mRNA的表达,而Western-blot检测到只有诱导后的GSCs有CD31蛋白的表达;(4)胶质瘤干细胞荷瘤裸鼠模型的肿瘤组织中部分微血管抗人CD31抗体染色阳性.结论 胶质瘤干细胞不仅在体外低氧条件下可分化为内皮细胞,在体内微环境条件下同样可分化为血管内皮细胞,并参与胶质瘤新生组织的血液供应.     

胶质瘤干细胞外泌体通过PI3K/Akt信号通路促进胶质瘤U87细胞侵袭、迁移

目的 探讨胶质瘤干细胞（GSCs）外泌体（exo）对胶质瘤U87细胞侵袭、迁移的影响。方法 取对数生长期U87细胞,应用干细胞培养液分离、培养胶质瘤U87细胞中GSCs并提取、鉴定GSCs-exo。取对数生长期U87细胞随机分为4组:对照组和高、中、低GSCs-exo浓度组（分别加入20、40、80 μg/ml的GSCs-exo）。Transwell实验检测U87细胞侵袭能力,划痕实验检测U87细胞迁移能力,免疫印记法检测U87细胞磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）、L1CAM的表达水平。结果 成功分离GSCs并获得GSCs-exo。GSCs-exo组U87侵袭细胞数、细胞迁移率明显高于对照组（P<0.05）,L1CAM、PI3K及p-AKt/Akt表达水平明显高于对照组（P<0.05）,而且均呈浓度依赖性（P<0.05）。结论 GSCs-exo可促进胶质瘤侵袭与转移,其机制可能与上调L1CAM、PI3K表达,促进Akt磷酸化有关。     

内皮抑素和血管生成抑素融合基因修饰的单纯疱疹病毒对胶质瘤干细胞的体外实验研究

目的 探讨内皮抑素和血管生成抑素( Endo - Angio)融合基因修饰的单纯疱疹病毒(VAE)对胶质瘤干细胞(GSCs)的体外溶瘤作用。方法 新鲜高级别（WHOⅢ级、Ⅵ级）人脑胶质瘤标本经原代培养获得GSCs,采用流式细胞术检测其中CD133阳性细胞数,单克隆形成实验检测GSCs的自我更新能力,免疫荧光技术检测未分化GSCs的Nestin及分化后GFAP、NF和MAG的表达;MTS法检测VAE对GSCs增殖活性的影响,RT - PCR和Western blot检测Endo - Angio融合蛋白的表达并检测其对人脑微血管内皮细胞(HBMEC)增殖的影响;最后观察病毒处理后仍存活细胞的自我更新和诱导贴壁情况。结果 (1)从20例高级别胶质瘤标本中培养出4例GSCs,能够表达CD133及Nestin,具有自我更新能力和多向分化能力。(2)VAE能够感染GSCs,4例GSCs增殖活性明显下降(P＜0.05)。(3)VAE感染GSCs 48 h后,基因水平及蛋白水平都有Endo- Angio融合蛋白表达,该融合蛋白使HBMEC增殖活性明显下降(P＜0.05)。(4)VAE感染后仍存活的细胞不再具有形成GSCs球的能力,加入血清诱导后也不再贴壁生长。结论 在体外,VAE能够显著抑制GSCs活性,能够表达具有生物活性的Endo-Angio融合蛋白,为脑胶质瘤溶瘤病毒治疗开辟了新的途径。     

全反式维甲酸对胶质瘤干细胞VEGF和bFGF表达的影响

目的 研究全反式维甲酸(ATRA)对胶质瘤干细胞(GSCs)血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的影响. 方法 从人胶质母细胞瘤细胞系U87中分离培养GSCs,免疫荧光染色检测CD133、巢蛋白(nestin)的表达进行鉴定.将取GSCs分成3组分别培养:(1)ATRA组:培养基中含10 nmol/L ATRA;(2)空载体组:培养基中含与ATRA组等量的二甲基亚砜(DMSO);(3)对照组:单纯培养基,培养10 d后免疫荧光染色检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulinⅢ)、半乳糖脑苷脂(GalC)的表达;CCK8法检测各组细胞的增殖;ELISA和RT-PCR分别检测各组GSCs VEGF、bFGF的分泌水平和mRNA的表达. 结果 二代细胞球表达神经干细胞(NSCs)的标记抗体CD133和nestin.免疫荧光染色检测显示分化后GSCs能够分化为多种同源子代细胞(分别表达星形胶质细胞、神经元、少突胶质细胞标志物GFAP、β-tubulinⅢ、Galc);培养10d后ATRA组细胞GFAP的阳性表达率高于对照组及空载体组,差异有统计学意义(P＜0.05).第3.～7天ATRA组细胞增殖速度较对照组和空载体组明显变缓,差异有统计学意义(P＜0.05);分化24 h后ATRA组GSCs VEGF、bFGF的分泌水平和mRNA的表达均少于对照组和空载体组,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 ATRA能诱导GSCs分化并抑制其增殖,其可能通过抑制VEGF和bFGF的表达发挥抗胶质母细胞瘤的作用.     

抑制Hedgehog信号通路对人脑胶质瘤肿瘤干细胞体外增殖的影响

目的 探讨抑制Hedgehog信号通路对人脑胶质瘤肿瘤干细胞（GSCs）体外增殖的影响。方法 收集我院手术切除的胶质母细胞瘤标本,进行分离、培养和鉴定GSCs,应用环靶明抑制Hedgehog信号通路,采用免疫组化染色检测GSCs Hedgehog信号通路相关蛋白的表达,使用CCK-8试剂盒测定GSCs的增殖活性。结果 胶质母细胞瘤标本分离出来的细胞球表达CD133及Nestin;而且表达Hedgehog信号通路关键蛋白Sonic Hedgehog和Smo。环靶明对GSCs增殖的抑制率随浓度的升高显著增高（P<0.05）,而且随作用时间延长显著增高（P<0.01）。结论 Hedeghog信号通路的特异性抑制剂环靶明能够显著抑制体外培养GSCs的增殖。     

25例恶性胶质瘤中肿瘤干细胞的分离与检测

目的 从不同病理级别胶质瘤组织标本中分离、培养并鉴定胶质瘤干细胞.方法 取25例(23例原发胶质瘤,2例复发胶质瘤)新鲜人脑胶质细胞瘤标本,分离脑肿瘤细胞,接种于含生长因子的无血清达尔伯克(氏)必需基本培养基/F-12(DMEM/F-12)培养基中培养至细胞形成干细胞球,免疫荧光法检测脑肿瘤干细胞CD133、Nestin的表达情况,干细胞球诱导分化后检测细胞表面分化标记物β微管蛋白Ⅲ(β-TubulinⅢ)、神经胶质酸性蛋白(GFAP)表达情况.结果 被检测的23例原发胶质瘤标本中,随着胶质瘤级别的增高,形成神经球的时间缩短,数量增多.2例复发胶质瘤组织分离得到的细胞形成的神经球较原发胶质瘤快而多.免疫荧光方法检测神经球CD133、巢蛋白(Nestin)表达阳性.神经球细胞经诱导分化后β-TubulinⅢ、GFAP表达阳性.结论 胶质瘤组织中存在肿瘤干细胞,不同级别胶质瘤中BTSC数量及增殖能力不同.     

肿瘤微环境对胶质瘤干细胞影响机制的研究进展

胶质瘤干细胞（GSCs）是具有干性特征和功能的胶质瘤细胞，近些年来受到广泛关注。与普通胶质瘤细胞相比，GSCs具有很强的成瘤、侵袭、化疗放疗抵抗能力，可能是导致转移和肿瘤复发的主要因素。随着研究不断深入，人们逐渐发现肿瘤微环境（TME）在GSCs的形成中发挥重要作用，并且TME能够促进GSCs表型的维持。该文将围绕TME对GSCs的影响和机制的前沿进展进行讨论；并详细介绍TME中缺氧、酸性、损伤相关分子模式（DAMP）如高迁移率族蛋白B1（HMGB1）以及外泌体对GSCs的具体作用及机制。     

胶质瘤细胞来源外泌体的提取与鉴定

目的提取和鉴定人脑胶质瘤细胞来源外泌体,为后续开展人脑胶质瘤外泌体研究提供必要的材料和稳定的方法。方法使用超速离心法分离人脑胶质瘤细胞培养上清液中的外泌体;通过透射电镜观察其大小及形态特征,马尔文粒度分析仪分析其直径大小,免疫印迹实验检测其表面特异性标志物CD9及CD63的表达。结果从人脑胶质瘤U251细胞培养上清液中分离出囊泡状物质,透射电镜下可见茶托样、均质、具有膜样结构的微小囊泡,直径约30~150 nm;马尔文粒度分析显示囊泡大小为50~150 nm;免疫印迹实验检测到其表达外泌体特异性标记蛋白CD9及CD63。结论利用超速离心法成功分离并鉴定了人脑胶质瘤细胞来源的外泌体,提取的外泌体可用于后续实验;并研究出稳定的外泌体分离与鉴定的方法。     

人脑胶质瘤细胞裸鼠原位移植动物模型的建立

目的探讨人脑胶质瘤细胞裸鼠原位移植动物模型建立的技术方法。方法借助动物立体定向仪的引导,采用微注射方法将体外培养人脑胶质瘤细胞U87MG(悬浮于无血清RPMI 1640培养液中,细胞数为108/ml)接种于裸鼠(BALB/c)额叶白质区。接种后观察不同种实验鼠的生存状态,分别于接种后1 h至63 d的不同时间进行裸鼠脑肿瘤组织病理学检查和免疫组织化学分析。结果裸鼠脑内注射体外培养的人脑胶质瘤细胞U87MG的合适速率为0.05μl/min =1μl/20 min,细胞悬液体积1μl,细胞数105,注射时间20 min。按此方案注射U87MG细胞无沿针道返流,恰好在尾状核区形成近圆球形肿瘤体,成瘤率高(100%),肿瘤颅内生长稳定,组织病理学检查符合人脑胶质瘤形态特征,未见脑外转移。结论本研究的人脑胶质瘤细胞裸鼠原位移植动物模型建立方法精确可靠,重复性好。肿瘤符合人脑胶质瘤的生物学特性,该动物模型可作为研究人脑胶质瘤发生、生物学特性以及各种治疗评价的可靠动物模型。     

VEGF受体3在人脑胶质母细胞瘤中的表达及作用

目的研究血管内皮细胞生长因子受体3在人脑胶质母细胞瘤中的内皮细胞中的表达,其对肿瘤血管内皮细胞增殖,迁徙和血管成形功能的作用。方法使用实时聚合酶链式反应(RTPCR),酶联免疫吸附法(ELISA)研究血管内皮细胞生长因子C在脑胶质瘤组织和肿瘤细胞U87、U251中的表达,使用RT-PCR,免疫组化方法研究血管内皮细胞生长因子3在脑胶质母细胞组织和内皮细胞中的表达,使用特异性阻滞剂MAZ51阻滞其在人脑胶质母细胞瘤中的内皮细胞中的作用。结果血管内皮细胞生长因子C表达于人脑胶质瘤组织和肿瘤细胞中,血管内皮细胞生长因子3表达于人脑胶质母细胞瘤组织和内皮细胞中,使用阻滞剂MAZ51可降低肿瘤血管内皮细胞增殖,迁徙和血管成形能力。结论血管内皮细胞生长因子受体3参与人脑胶质母细胞瘤血管拟态形成,可能成为脑胶质瘤肿瘤抗血管治疗的新靶点。     

PEX基因对C6胶质瘤干细胞MMP-2和VEGF表达的影响

目的 探讨PEX基因对C6胶质瘤干细胞(GSCs)中基质金属蛋白酶2(MMP-2)和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.方法 采用血清培养基培养C6胶质瘤细胞系,再取其单细胞悬液悬浮培养于无血清培养基中传代培养.采用单细胞克隆和免疫荧光染色分离鉴定GSCs,运用本实验室成功构建的重组子pDsRed2-C1-PEX,以脂质体为介导转染体外培养的GSCs,逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)检验真核表达载体在GSCs中的表达及PEX基因对GSCs表达MMP-2mRNA、VEGFmNA的影响.结果 成功培养出GSCs并成功转染,PEX在GSCs中高表达并且体外对MMP-2、VEGF的表达有明显抑制作用,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 PEX基因可以在GSCs中表达,并且体外可以抑制MMP-2和VEGFmRNA在GSCs中的表达,为胶质瘤的治疗奠定理论基础.     

敲低WTAP表达抑制脑胶质瘤干细胞的增殖、迁移和侵袭

目的 探讨敲低Wilms肿瘤抑制因子（WTAP）表达对脑胶质瘤干细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响及机制。方法 从手术切除胶质瘤标本中提取胶质瘤干细胞（GSC），应用lipofectamine2000转染WTAP shRNA质粒敲低WTAP表达，以shRNA为阴性对照；PCR检测WTAP mRNA水平分析敲低效率；MTT法检测细胞增殖能力，Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭能力，免疫印迹法检测细胞AKT磷酸化水平。结果 从胶质瘤标本中成功提取GSC，其SOX2表达显著降低（P<0.001），而α-SMA和PDGFRb的表达上调（P<0.001）。与阴性对照组相比，WTAP敲低组GSC细胞WTAP mRNA水平明显降低（P<0.05），细胞增殖、迁移和侵袭能力均显著下降（P<0.05），细胞AKT的磷酸化水平显著降低（P<0.05）。结论 敲低WTAP表达可抑制GSC的增殖、迁移和侵袭能力，其机制可能与抑制AKT磷酸化有关。     

胶质瘤干细胞中Nanog基因启动子区甲基化检测及意义

目的检测胶质瘤干细胞中Nanog基因启动子区甲基化表达,并探讨其Nanog基因表达的关系。方法使用无血清悬浮培养法获得胶质瘤干细胞并鉴定;采用甲基化特异性多聚酶链反应(MSP)分别检测胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞系U87中Nanog基因启动子区甲基化状态,实时定量多酶链反应(RT-PCR)检测相应细胞中Nanog表达情况。结果由U87胶质瘤细胞系成功获得胶质瘤干细胞(GSCs);MSP检测胶质瘤干细胞和U87细胞系Nanog启动子区皆呈非甲基化状态,且胶质瘤干细胞中Nanog非甲基化程度高于U87细胞系(t=6.988,P=0.000)。实时定量PCR结果显示胶质瘤干细胞中Nanog mRNA相对表达量高于U87细胞系。结论胶质瘤干细胞中Nanog基因启动子区呈非甲基化状态,可能与Nanog基因表达有关,且可能促进Nanog的转录并维持着胶质瘤干细胞的恶性生物学活性。     

替莫唑胺通过TGF-β2影响胶质瘤干细胞的侵袭性研究简

目的探讨替莫唑胺能否抑制胶质瘤干细胞（GSCs）和分化的胶质瘤细胞株的侵袭,并降低免疫抑制作用和对转化生长因子-β2（TGF—β2）表达的影响。方法首先从原代培养胶质瘤干细胞（PCGCs）,然后,我们通过免疫组化,细胞侵袭实验来研究替莫唑胺对侵袭力的影响,实时逆转录酶一聚合酶链反应（RT—PCR）和酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法来证明TGF-β2的表达影响。结果TMZ能够抑制胶质瘤干细胞和原代培养胶质瘤干细胞的侵袭力。此外,TMZ在mRNA和蛋白水平下调TGF-β2的表达。结论替莫唑胺能够通过影响TGF-β2的表达来抑制胶质瘤干细胞（GSCs）和分化的胶质瘤细胞株的侵袭,并降低他们的免疫抑制作用,替莫唑胺可作为胶质瘤治疗的免疫调节剂。     

Bcl-2在人脑胶质瘤干细胞样细胞中的表达及病理相关性

目的 检测B细胞淋巴瘤/白血病-2 (Bcl-2)基因在胶质瘤干细胞样细胞(GSLCs)中的表达水平,并分析Bcl-2与来源胶质瘤恶性程度的相关性.方法 从8例临床标本中培养出GSLCs并鉴定后,检测Bcl-2在GSLCs以及相应原代胶质瘤细胞中的mRNA和蛋白水平并比较分析;此外对GSLCs中Bcl-2水平及来源胶质瘤恶性程度之间的关系进行分析.结果 从8例胶质瘤标本中培养出GSLCs并通过鉴定.实时逆转录酶-聚合酶链式反应和酶联免疫吸附试验检测显示Bcl-2在GSLCs中的mRNA和蛋白水平均显著高于对应的原代胶质瘤细胞,配对t检验结果分别为P＜0.001和P＜0.005,有统计学意义.此外,Bcl-2的在Ⅳ级脑胶质瘤来源的GSCLs中的表达水平明显高于Ⅲ级脑胶质瘤来源的GSCLs.结论 首次检测并发现GSCLs中Bcl-2的表达水平高于相应的原代胶质瘤细胞,此结果与胶质瘤干细胞(GSCs)特点相符,这可能是GSCs产生治疗耐受性并逃避凋亡的原因之一.以Bcl-2为靶点的抗肿瘤治疗须能诱导GSCs凋亡,才有望治愈胶质瘤.     

神经胶质瘤诱导骨髓基质干细胞定向迁移的初步研究

目的 探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)对神经胶质瘤的定向迁移能力及其在脑内的分布规律. 方法 从雄性Wistar大鼠股骨和胫骨中分离出BMSCs并进行传代培养,采用免疫荧光检测BMSCs表面抗原并将其向脂肪细胞和成骨细胞方向诱导分化.证明BMSCs性质.立体定向接种C6胶质瘤细胞于Wistar大鼠脑内基底节区以建立鼠腩胶质瘤模型,7 d后将5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记的BMSCs接种入鼠脑对侧半球、对侧脑室和鼠尾静脉.BMSCS移植14d后心脏灌注取脑制成石蜡切片.以HE染色确定胶质瘤性质.SABC法免疫荧光染色显示BMSCs对神经胶质瘤组织的定向迁移能力及其在脑内的分布规律. 结果 对侧半球组和对侧脑室组均可见移植的BMSCs多沿针道直线分布并向对侧胶质瘤迁移.在胶质瘤与正常脑组织交界处可见激发出绿色荧光的阳性BMSCs:鼠尾静脉组亦可见少量BMSCs阳性细胞分布在胶质瘤组织周围. 结论 BMSCs通过脑实质、脑室及静脉注射途径均可定向迁移到胶质瘤组织,提示BMSCs可作为一种新的细胞载体用于胶质瘤的基因治疗.