小鼠Foxp3融合蛋白的原核表达及纯化

目的克隆小鼠Foxp3(MFoxp3)基因,构建含该基因的原核表达载体,并表达、纯化出小鼠的Foxp3融合蛋白。方法RT-PCR方法从小鼠淋巴细胞扩增出小鼠Foxp3基因,连入T Easy Vector进行测序,然后将序列正确的小鼠Foxp3基因用酶切的方法从T Easy vector切下,并将其连接到用相同酶切,含有硫氧还蛋白(含6个组氨酸“标签”)的pET 32a( )原核表达载体中构建pET 32a( )-MFoxp3表达载体。用IPTG诱导转化pET 32a( )-MFoxp3表达载体的大肠杆菌BL21(DE3),并以镍螯合层析法纯化MFoxp3融合蛋白。结果经RT-PCR成功地克隆了1,290 bp的小鼠Foxp3基因,测序正确后转化大肠杆菌原核表达载体pET 32a( ),重组质粒在BL21(DE3)中成功表达出分子质量约为63 kD的融合蛋白,运用Ni-NTA方法纯化出目的蛋白,纯化后的蛋白纯度达80%,并用Western Blotting检测蛋白的灵敏度和特异性。结论构建了小鼠Foxp3的融合蛋白原核表达载体并成功表达与纯化出小鼠Foxp3的融合蛋白。     

戊型肝炎病毒ORF3蛋白的表达及其多克隆抗体制备

[目的]原核表达戊型肝炎病毒ORF3蛋白,探讨其抗原性,并制备特异性多克隆抗体。[方法]PCR扩增ORF3全长基因,将其克隆到原核表达载体pET32b中,诱导表达目的蛋白,并用戊型肝炎病毒阳性血清鉴定其抗原性。蛋白纯化后免疫小鼠制备多克隆抗体,ELISA检测抗体效价,western blot检测抗体特异性。[结果]成功构建原核表达载体pET32b—ORF3,在大肠杆菌中高效表达分子量约为32kDa的融合蛋白,ELISA分析表明其具有良好的抗原性。纯化的表达蛋白制备的多克隆抗体具有较强的特异性,效价达到1：32000。[结论]重组表达蛋白ORF3具有良好的抗原性,可用于戊型肝炎诊断试剂盒研制,制备的多克隆抗体特异性强效价高,为进一步研究戊型肝炎病毒奠定了实验基础。     

侵袭性大肠埃希氏菌IpaC的表达与纯化

目的：表达和纯化侵袭性大肠埃希氏茵毒力蛋白IpaC，为进一步研究侵袭性大肠埃希氏茵的发病机制奠定基础。方法：将含有ipaC基因的pET32a-ipaC表达质粒载体转化大肠杆菌BL21(λDE3)，在异丙基硫代—β—D半乳糖苷(IPIG)诱导下表达，对诱导后的表达产物进行SDS—PAGE鉴定，并采用QIAexpressionits^TM蛋白纯化系统纯化目的蛋白。结果：诱导后的表达产物经SDS—PAGE发现有一相对分子量约为63kD的条带，其含量约占总蛋白量的13％，对目的蛋白进行纯化后发现，以400mmol/L咪唑洗脱液洗脱时效果最为理想，纯度可达90％以上。结论：pET32a—ipaC重组表达质粒转化大肠杆菌B121(λDE3)，可稳定、高效地表达目的蛋白；QIAexpressionist^TM蛋白纯化系统是一种简便、高效的纯化系统，可获得高纯度的目的蛋白。     

EGFL7原核表达载体的构建及鉴定

【目的】构建类表皮生长因子域7（EGFL7）原核表达载体,并诱导其表达、纯化及鉴定目的蛋白。【方法】以人肝癌细胞系 HepG2总RNA为模板,PCR扩增 EGFL7基因,克隆至原核表达载体pET‐21a（＋）中,转化大肠杆菌 BL21（DE3）,IPTG 诱导表达。 His‐tag 磁珠纯化重组蛋白 EGFL7,SDS‐PAGE 鉴定。【结果】克隆目的基因序列正确,未发生碱基突变;重组表达质粒pET21a（＋）‐TRX‐EGFL7经双酶切鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子量为80 kD ,与预期相符。【结论】成功在大肠杆菌BL21（DE3）中表达并纯化了EGFL7重组蛋白,为后续研究奠定了基础。     

VEGFR-2/KDR三区的载体构建、表达及胃癌患者抗-KDR抗体的检测

目的扩增人血管内皮细胞生长因子受体-2／激酶插入受体（VEGFR-2／KDR）三区基因，构建表达载体，在大肠埃希菌中表达，获得纯化蛋白。检测胃癌术前患者外周血中抗-KDR抗体水平，为进一步研究KDR与抗-KDR抗体在胃癌中的作用奠定基础。方法从人血管内皮细胞株ECV304提取总RNA，逆转录后，聚合酶链反应（PCR）扩增KDR胞外段三区基因，连接到pMD18-T载体测序；酶切后将目的基因插入原核表达载体pET28α（＋）构建重组质粒，将重组质粒转化到大肠埃希菌DH5et内并提取质粒，经双酶切鉴定后，再转化入表达菌株BL21（DE3），异丙基-B-D硫化半乳糖苷（IPTG）诱导表达，用Ni^2＋-NTA树脂纯化、复性；用获得的蛋白包被酶联免疫吸附试验（ELISA）板，用ELISA检测32例胃癌患者和35名健康对照者外周血抗．KDR抗体水平。结果构建了表达载体pET28α（＋）-KDR3，并获得高效表达，表达的蛋白质相对分子质量为16000，重组蛋白以包涵体形式存在。胃癌患者外周血中抗-KDR抗体水平显著高于健康对照组（P〈0．01）。结论VEGFR-2／KDR三区基因成功克隆到表达质粒内并表达。为进一步研究KDR与抗-KDR抗体在胃癌中的作用奠定了基础，及可能为胃癌的血清学诊断提供新的方法。     

人胰腺α-淀粉酶的cDNA克隆和原核表达的初步研究

目的 获得人胰腺α-淀粉酶(AMY2A)基因并进行原核表达。方法 采用基因工程技术,根据人AMY2A基因序列设计并合成特异性引物;从人胰腺组织中提取总RNA,反转录成CDNA第一链;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增人胰腺AMY2A基因,经BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切、连接并插入原核表达载体pGEX-5T,构建pGEX-5T-AMY2A重组表达载体,在大肠杆菌BL21中异丙基硫代半乳糖苷酶(IPTG)诱导表达AMY2A蛋白。包涵体经尿素变性、复性及谷胱苷肽琼脂糖柱亲和层析纯化、AMY2A酶活性测定和免疫印迹分析。结果 重组质粒测序和酶切结果显示AMY2A基因已正确插入pGEX-5T,重组蛋白、复性及纯化产物SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在84 000处有一条明显的蛋白表达条带,AMY2A检测具有酶活性,免疫印迹分析表明重组蛋白具有人胰腺淀粉酶抗原性。结论 作者已克隆并在大肠杆菌中初步表达并获得纯化的谷胱苷肽转移酶(GST)-AMY2A融合蛋白。     

人肝素酶蛋白的表达及其单克隆抗体的制备

目的构建人肝素酶蛋白的原核表达载体,表达并纯化重组人肝素酶蛋白和制备其单克隆抗体。方法将人肝素酶cDNA克隆至原核表达载体pET30a(+),经大肠杆菌表达、纯化后,获得的肝素酶纯化蛋白免疫小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0细胞融合,制备能产生肝素酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株,进一步采用Western blotting、ELISA等技术对制备的单克隆抗体进行初步鉴定。结果原核表达重组质粒在大肠杆菌中能高效表达人肝素酶蛋白,并进一步从10株杂交瘤细胞中选取了3株能稳定分泌人肝素酶单抗的杂交瘤细胞株。结论成功制备了3株人肝素酶特异性单克隆抗体。     

重组人绒毛膜促性腺激素-β亚基的纯化及生物活性测定

目的 构建人绒毛膜促性腺激素（HCGB）原核表达载体PG5-HCGβ，使HCGβ在大肠杆菌中获得高效表达。建立一条简单、快速、高效的纯化复性路线，获得具有生物活性的高纯度rHCGβ。方法以本室克隆的PCRII／HCGB为模板，构建PG5-HCGβ，转化大肠杆菌BL21表达HCGβ。表达蛋白顺次用凝胶过滤和离子交换层析两步分离纯化。结果酶切及序列结果显示，PG5-HCGβ构建正确，HCGβ表达约占菌体总蛋白的20％。经过凝胶过滤和离子交换层析两步分离纯化，获得rHCGβ纯度达95％以上。复性的rHCGβ具有促进小鼠子宫生长的生物学活性。结论构建的PG5-HCGβ表达载体在大肠杆菌中获得高效表达，纯化复性的rHCGβ蛋白具有较高的生物学活性，为今后的rHCGβ生产打下了良好的基础。     

艰难梭菌二元毒素A的原核表达及免疫原性分析

目的构建艰难梭菌二元毒素(Cdt)A的原核表达载体,表达并纯化His-CdtA重组蛋白,分析其免疫原性。方法以RT 027型艰难梭菌为模板,采用聚合酶链反应(PCR)扩增cdtA的全长序列,导入大肠埃希菌BL21感受态细胞,诱导His-CdtA重组蛋白表达,并用纯化后的蛋白免疫小鼠,分析小鼠产生的抗体效价。结果成功构建pET-28b-cdtA原核表达载体,诱导并纯化出高浓度的His-CdtA重组蛋白,免疫小鼠后产生高效价的抗CdtA抗体。结论纯化的His-CdtA重组蛋白免疫小鼠产生了高效价的抗CdtA抗体,为后续制备抗CdtA单克隆抗体及建立CdtA的实验室检测方法学奠定了基础。     

人偏肺病毒F1、F2亚单位原核表达系统的构建及多克隆抗体制备

目的 构建人偏肺病毒融合蛋白亚单位F1、F2原核表达系统,初步获得抗F1、F2重组蛋白的多克隆抗体,为相关疫苗的研究奠定基础。 方法 聚合酶链反应(PCR)法扩增F1、F2基因片段,经T-A克隆确保其准确性,双酶切后插入原核表达载体pET32a(+)中,转化大肠埃希菌BL21(DE3),按优化后条件大量诱导表达,纯化后经Western Blot检测特异性。取纯化蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,ELISA法检测效价,间接免疫荧光法(IFA)检测多克隆抗体是否能与人偏肺病毒发生特异性反应。 结果 F1、F2基因均正确插入pET32a(+)中,并具有正确的读码框架。0.5 mmol/L IPTG 37 ℃诱导培养5 h可获得大量带His标签的重组蛋白,纯化后浓度分别达到200 g/ml和300 g/ml。Western Blot结果显示,重组蛋白可被抗His标签抗体特异识别;免疫小鼠获得多克隆抗体效价分别为抗pET32a-F1最高1 : 640,抗pET32a-F2最高1 : 40 960。IFA显示抗pET32a-F1、抗pET32a-F2多克隆抗体均可与人偏肺病毒作用产生特异性荧光。 结论 成功构建了F1、F2的原核表达质粒, 并在大肠埃希菌中获得高效表达,该蛋白具有良好的抗原性;免疫小鼠获得特异性多克隆抗体,有利于人偏肺病毒的深入研究。     

融合蛋白hJagged1^ext-Fc毕赤酵母表达载体的构建及表达

本研究旨在构建人IgG1 Fc蛋白及融合蛋白hJagged1^ext-Fc，并在毕赤酵母GS115中表达。用RT—PCR法从人骨髓细胞中扩增hJagged1基因的胞外段。在测序正确后，将hJagged1基因的胞外段插入构建好的PIC—Fc载体，得到PIC—hJagged1^ext-Fc。用MD平板筛选重组子，G418法筛选高拷贝转化子，经甲醇诱导表达后，采用SDS—PAGE分析表达蛋白。结果表明：hJagged1基因的胞外段被有效地扩增。序列分析显示所构建的含phJagged1^ext-Fc融合基因的质粒与设计相同，人IgG1Fc蛋白及融合蛋白hJagged11^extFc得到正确表达。结论：成功地构建了hJagged1^ext-Fc融合基因的毕赤酵母表达载体，并在毕赤酵母中正确表达，为进一步研究Jagged1在造血干／祖细胞的体外扩增奠定了基础。     

CDCP1胞外段基因的克隆及在大肠杆菌中表达

目的：构建携带 CDCP1胞外段基因的原核表达载体。方法以 A549的 mRNA 为模板,应用所设计的引物通过 RT-PCR 法扩增 CDCP1胞外段基因;将 PCR 产物与 pGEX-KG 载体连接,获得重组质粒 pGEX-KG/CDCP1;经双酶切、PCR 及 DNA 序列测定进行鉴定;IPTG 诱导表达。结果①RT-PCR 扩增得到约270 bp 大小的 CDCP1胞外段基因目的片段;②目的片段正确插入到 pGEX-KG 中;③经 IPTG 诱导表达,可见在相对分子质量约35kD 处出现明显的诱导蛋白条带,与预期一致。结论成功构建了携带 CDCP1胞外段基因的原核表达载体,在大肠杆菌中获得大量表达。     

人von Willebrand因子A1区基因的克隆和表达

为了深入研究血栓形成的机制以及开发新的抗血栓药物 ,将人vonWillebrand(vWF)因子A1区cDNA在大肠杆菌中表达 ,以获得高效表达的具有生物学活性的重组A1区蛋白 ,应用PCR方法从含有人全长vWFcDNA质粒中扩增A1区基因片段 ,并将其克隆至pUCm T载体中 ,经DNA序列分析后 ,将其重组于有 6×HisTag的融合蛋白表达载体pQE 31中 ,并在大肠杆菌M1 5中诱导表达。采用Ni NTA柱进行纯化 ,用Western印迹鉴定。结果表明 ,PCR扩增得到 854bp的A1区基因片段 ,序列测定结果与文献报道一致。IPTG诱导 5小时后表达的vWF因子A1蛋白占菌体总蛋白的 30 %左右 ,经Ni NTA纯化后其纯度在 95 %以上。Western印迹检测显示A1蛋白具有很好的抗原性和特异性。结论 :成功地在大肠杆菌中高效表达了人vWFA1区蛋白 ,为进一步研究vWF在血栓形成与止血中的作用奠定了基础     

鼠抗人肥大细胞类糜蛋白酶N端片段抗体的制备与鉴定

目的:在大肠杆菌中表达人肥大细胞类糜蛋白酶(hMCC)N端片段(hMCC-N),并制备其鼠源性多克隆抗体。方法:通过PCR法扩增hMCC-N端基因片段,将其克隆至pMAL-c2x原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导重组蛋白的表达,通过Amylose树脂亲和层析纯化目的蛋白,以纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备鼠抗hMCC-N端片段多克隆抗体,并以间接ELISA测定抗体效价,以Westernblot鉴定抗体的特异性。结果:PCR扩增得到360bp的hMCC-N端基因片段,克隆入表达载体pMAL-c2x,构建了与标签蛋白麦芽糖结合蛋白基因融合表达载体pMAL-c2x/hMCC-N,融合蛋白在大肠杆菌中得到了稳定表达,并经亲和层析,纯化出可溶性的重组蛋白,用其免疫小鼠,获取了鼠抗hMCC-N端片段的多克隆抗体,ELISA结果显示效价达1∶12800,Westernblot分析表明该抗体能特异结合hMCC。结论:成功地制备了效价高、特异性较强鼠抗hMCC-N端片段抗体,为进一步建立hMCC的ELISA检测方法打下了良好的基础。     

基因重组降钙素原蛋白在大肠杆菌中的克隆表达及纯化

目的构建降钙素原（PCT）基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达，以获取高产量、低成本、高纯度的PCT蛋白。方法按人的全长PCT cDNA序列，设计引物用标准的聚合酶链反应（PCR）法全基因合成步骤合成扣除信号肽外PCT的片段，应用基因重组技术将该片段克隆到质粒pET21a（＋）中，进行限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定。将重组质粒转化大肠杆菌E．coli（DH5α），经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后，用镍-氮三乙酸（Ni-NTA）亲和层析纯化获取蛋白，用十二烷基硫酸-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western blot）的方法鉴定。结果扩增出的人PCT片段于原核表达载体中克隆，经酶切和核酸测序鉴定，得到正确的重组质粒pET-PCT，并在大肠杆菌中得以表达。纯化后的蛋白经考马氏亮蓝染色呈单一条带；用抗PCT的抗体进行Western blot分析证明目的蛋白有反应性。结论本研究成功构建了表达基因重组人PCT的原核表达载体，基因重组人PCT蛋白在大肠杆菌中获得了表达和纯化，为进一步获取高纯度、高效价的单克隆抗体和开展临床检测提供了必要的条件。     

Differential usage of three exons generates at least five different mRNAs encoding human leukocyte common antigens

Leukocyte common antigens (LCAs, also known as T200 and CD 45) are integral membrane proteins expressed exclusively on hematopoietic cells. These molecules exhibit varying molecular masses and epitopes when expressed in different cell types. To determine the genetic bases for the generation of this diversity, three classes of human LCA cDNA clones that are different near their 5' ends have been isolated. These differences arose as a result of differential usage of three exons as determined from an analysis of a genomic DNA clone. Furthermore, Northern blot analysis with LCA exon-specific probes demonstrates the existence of at least two more LCA mRNA forms that are generated by differential splicing. A comparison of the human and mouse LCA protein sequences revealed a marked difference only in the extracellular domain.     

VLA-5 is expressed by mouse and human long-term repopulating hematopoietic cells and mediates adhesion to extracellular matrix protein fibronectin.

Fibronectin (FN), an extracellular matrix protein, is involved in the adhesion and migration of hematopoietic cells and has been shown to enhance retroviral gene transfer into primitive hematopoietic cells by co-localization of target cells and retrovirus when used as a substrate in vitro. We have previously found that mouse hematopoietic stem cells could be transduced on a FN fragment that included the recognition sequence Arg-Gly-Asp (RGD), suggesting that stem cells may express the integrin very late antigen (VLA)-5. To address this, we investigated the binding of mouse and human hematopoietic cells to recombinant peptides that contained one or a combination of the three principle cell-binding domains of FN. These domains included the VLA-5- binding sequence RGD, the VLA-4-binding site CS1, and the high affinity heparin-binding domain. Here we show that mouse long-term in vivo repopulating stem cells, as well as primitive human NOD/SCID mouse repopulating cells, can bind extracellular matrix protein FN by using integrin VLA-5 in vitro. This binding is specific and can be inhibited by antibodies to VLA-5. In addition, preincubation of BM cells with peptide CH-296, which contains all three primary FN-binding domains, decreased the engraftment of cells in the bone marrow in vivo, while intravenous injection of the same peptide induced an increase of progenitor cells in the spleen. In summary, our data demonstrate that VLA-5 is expressed on primitive mouse and human hematopoietic cells and suggest that there may be significant cooperation between integrin receptors and proteoglycan molecules in the engraftment of bone marrow cells and hematopoietic cell adhesion in vivo.     

BDNF的克隆及pTAT/HA-BDNF重组表达载体的构建

目的:构建重组表达载体pTAT/HA-BDNF,探讨TAT携带BDNF穿透血脑屏障治疗中枢神经系统疾病的可行性。方法:从胚胎脑组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增,获得编码人BDNF的全基因序列,经回收、纯化、酶切后连接到含有TAT蛋白转导结构域序列的原核表达载体pTAT/HA上,将重组质粒pTAT/HA-BDNF转化大肠杆菌E.coli DH5α,筛选阳性克隆并酶切鉴定。结果:酶切鉴定及测序显示完全正确,BDNF基因的克隆和表达载体的构建成功。结论:经RT-PCR扩增得到特异性BDNF基因片段并成功构建pTAT/HA-BDNF重组表达载体。     

PRMT1-mediated methylation of the EGF receptor regulates signaling and cetuximab response

Posttranslational modifications to the intracellular domain of the EGFR are known to regulate EGFR functions; however, modifications to the extracellular domain and their effects remain relatively unexplored. Here, we determined that methylation at R198 and R200 of the EGFR extracellular domain by protein arginine methyltransferase 1 (PRMT1) enhances binding to EGF and subsequent receptor dimerization and signaling activation. In a mouse orthotopic colorectal cancer xenograft model, expression of a methylation-defective EGFR reduced tumor growth. Moreover, increased EGFR methylation sustained signaling activation and cell proliferation in the presence of the therapeutic EGFR monoclonal antibody cetuximab. In colorectal cancer patients, EGFR methylation level also correlated with a higher recurrence rate after cetuximab treatment and reduced overall survival. Together, these data indicate that R198/R200 methylation of the EGFR plays an important role in regulating EGFR functionality and resistance to cetuximab treatment.     

HIV-1跨膜蛋白gp41重组抗原的表达及其免疫反应性

目的 为开发和建立敏感、特异的抗HIV-1抗体的检测方法研制重组gp41抗原.方法 根据HIV-1的基因序列,设计并合成了1对PCR扩增引物,应用PCR技术从HIV-1 外膜基因组中扩增出HIV-1的gp41截短体,将扩增的基因片段插入质粒pET-28a中构建成重组表达质粒pET-gp41.诱导表达并纯化gp41重组抗原,对gp41进行了初步应用分析.结果 gp41在大肠埃希菌BL21 (DE3)中获得高表达,表达量占菌体总蛋白量的26.08%.纯化后截短体gp41的纯度为97.94%.经间接ELISA和免疫印迹检测,纯化后的表达产物gp41具有很高的抗原特异性和免疫反应性.结论 研制的重组抗原gp41有较强的抗原性和潜在的应用价值.