辐射诱发基因组不稳定性肝细胞Ran基因过表达和RNAi模型的构建

目的构建基因组不稳定细胞Ran基因过表达和RNAi模型,为进一步研究该基因在辐射诱发基因组不稳定的功能提供研究工具。方法根据Ran基因信息,以慢病毒载体GV218设计合成2种重组质粒,分别包含Ran基因全长序列以及阴性对照序列;以慢病毒载体GV248设计合成2重组质粒,分别包含Ran基因的小干扰序列以及用于干扰对照的阴性序列。利用Western blot和qPCR进行过表达和RNAi重组质粒表达的检测;通过转染293T细胞进行慢病毒的包装;利用qPCR和荧光法分别进行滴度的检测;再用包装好的慢病毒感染辐射诱导基因组不稳定性HL-7702肝细胞,利用qPCR检测Ran基因表达量。结果测序结果表明重组质粒构建成功,并能够有效转染293T。过表达病毒滴度为2.0×108 TU/mL;RNAi病毒滴度为3.0×108 TU/mL。过表达慢病毒能有效地上调Ran基因的表达,过表达效率为85%。RNAi干扰慢病毒能够有效抑制Ran基因的表达,抑制效率为73%。结论成功构建基因组不稳定肝细胞Ran基因过表达和RNAi模型,为进一步研究Ran基因在辐射诱发基因组不稳定细胞中的功能提供了有效的研究工具。     

小鼠NMNAT1基因的过表达和RNAi重组慢病毒的构建包装和检测

目的:针对小鼠烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1( NMNAT1)基因构建质粒并进行慢病毒包装,同时检测其表达水平和干扰效率,为进一步探讨该基因的功能提供研究工具和实验基础.方法:根据NMNAT1基因信息,用慢病毒载体pLenti6构建三种重组质粒,分别包含NMNAT1 cDNA全长、一个针对NMNAT1的小干扰序列和一个用于干扰对照的阴性序列.把这些质粒包装进慢病毒载体,并检测病毒滴度,再用慢病毒感染Hela细胞检测NMNAT1表达量和RNA干扰效率.结果:测序结果证明目的序列正确地插入到载体内.通过qPCR方法鉴定慢病毒包装成功,病毒滴度均为2×108 TU/ml以上.表达NMNAT1的重组慢病毒感染Hela细胞,该细胞能够高水平表达NMNAT1蛋白,而携带RNAi序列的慢病毒能够显著抑制其表达,干扰效率在70％以上.结论:针对NMNAT1的过表达和RNAi重组慢病毒制备成功,为进一步研究NMNAT1基因的功能和用慢病毒进行基因治疗提供了良好的研究工具.     

GPC3基因重组慢病毒载体的构建及其在肝癌细胞中的表达

目的 构建含有GPC3的shRNA序列慢病毒表达载体并转染肝癌细胞,观察其转染效率及在肝癌细胞中的表达.方法 应用重组DNA技术,将设计好的GPC3基因特异性siRNA序列构建至慢病毒表达载体pGLV3-GFP上,并应用脂质体法转染293T细胞,进行病毒包装及滴度测定.采用RT-PCR及Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测转染HepG2细胞后GPC3基因的表达情况.结果 慢病毒载体构建成功,并测定滴度为1×108TU/mL,转染后,GPC3基因表达明显降低.结论 成功构建GPC3基因的shRNA慢病毒载体,所介导的RNAi能有效抑制靶细胞中GPC3基因的表达.     

c-met慢病毒载体的构建及稳定转染骨髓间充质干细胞

构建肝细胞生长因子受体(c-met)慢病毒载体,并稳定转染骨髓间充质干细胞(BMSCs).将c-met连接到慢病毒载体GV358上,重组获得慢病毒载体GV358-c-met.再将该重组体与病毒辅助质粒共转染293T细胞,包装生产慢病毒并测定其滴度为2×108 TU/ml.将此慢病毒转染BMSCs,经嘌呤霉素筛药后,荧光显微镜下检测荧光阳性率达100%,且Western blot证实该细胞株表达c-met蛋白.成功构建了c-met慢病毒载体,并建立了稳定表达c-met的BMSCs.     

人GLUT3基因RNA干扰病毒载体的构建与鉴定

目的：筛选出人GLUT3基因有效的RNA干扰(RNA interference,RNAi)序列,并构建出慢病毒RNAi载体。方法：根据GLUT3基因mRNA序列设计合成siRNA片段4个,分别定向克隆至pLV-shRNA载体上,并将构建的质粒转染HeLa细胞,运用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测GLUT3mRNA的表达量验证其干扰效果。筛选出其中有效的质粒与病毒包装质粒共转染293T细胞进行包装,收获并浓缩重组慢病毒颗粒,测定病毒颗粒滴度后,将病毒感染U251胶质瘤细胞以测定感染慢病毒干扰载体后胶质瘤细胞内GLUT3的表达情况。结果：重组RNAi质粒pLV-shRNA-GLUT3-1,pLV-shRNA-GLUT3-2,pLV-shRNA-GLUT3-3,pLV-shRNA- GLUT3-4经测序证实质粒载体构建成功;4个干扰质粒在HeLa细胞中均可以明显抑制GLUT3-mRNA的表达。pLV-shRNA-GLUT3可以在293T细胞中成功包装。收集293T细胞分泌的病毒上清浓缩后测定病毒颗粒LV-GLUT3滴度为1.5×109 TU/mL。与感染阴性对照慢病毒颗粒(0.3641±0.044)相比,胶质瘤U251细胞感染慢病毒颗粒LV- GLUT3后,GLUT3蛋白相对表达明显降低(0.108±0.016,t=16.267,P<0.001)。结论：成功构建了人GLUT3基因有效的慢病毒RNAi载体,为进一步研究GLUT3的生物学功能奠定了基础。     

ABCE1特异性siRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定ABCE1基因短发夹状干扰RNA（shRNA）慢病毒载体,以便进一步研究ABCE1的功能。方法针对已经筛选确定的ABCE1基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经BamHⅠ和HindⅢ酶切后的pRNAT-U6.1/GFP载体连接、转化,产生pLV-sh-ABCE1慢病毒表达载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用pLV-sh-ABCE1、pHelper 1.0和pHelper 2.0 3种质粒共转染包装细胞人胚肾293T细胞,包装产生重组慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果PCR和测序证实,成功构建ABCE1shRNA的慢病毒载体pLV-sh-ABCE1。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为2×108TU/ML。结论成功构建ABCE1基因shRNA慢病毒载体,为应用RNAi研究ABCE1功能奠定基础。     

大鼠PEDF基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建针对大鼠PEDF 基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体并进行鉴定,探讨PEDF基因对缺血心肌血管新生的影响.方法 构建PEDF基因过表达质粒,测序鉴定.针对PEDF基因不同干扰靶点构建4种RNAi 病毒载体质粒pGCsi-U6/Neo/GFP/shRNA,测序鉴定.过表达质粒和RNAi质粒共转染293T细胞后应用Western blot方法进行外源筛靶确定PEDF基因RNAi 有效靶序列.有效RNAi 病毒质粒和其他3种辅助包装原件载体质粒通过Lipofectamine 2000共转染293T细胞,培养48 h后, 收集细胞培养上清液,将其浓缩后用孔稀释法测定病毒滴度.结果 过表达质粒及4种RNAi质粒构建成功.Western blot外源筛靶显示2个靶点能有效敲减目的基因的表达.PEDF shRNA慢病毒表达载体Serpinf1-RNAi-LV经293T细胞包装成功,收集293T细胞分泌的病毒上清测定浓缩病毒悬液的滴度为2×1012Tu/L.结论 成功构建了PEDF基因的RNAi慢病毒载体,为研究PEDF基因对缺血心肌血管新生的影响打下基础.     

KCTD10基因干扰RNA慢病毒载体的构建

目的:构建KCTD10干扰RNA慢病毒载体.方法:合成KCTD10干扰序列,构建GV248-KCTD10-RNAi慢病毒干扰载体,利用PCR与测序验证阳性克隆.将KCTD10 siRNA干扰病毒载体与质粒pHelper1.0和质粒pHelper2.0三个载体共同转染293T细胞,使细胞合成并分泌释放病毒颗粒.收集病毒颗粒并检测病毒滴度.结果:GV248-KCTD10-RNAi慢病毒载体成功被连接转化,测序结果与设计序列一致;共转后收获KCTD10 siRNA慢病毒颗粒,检测其滴度为5×108TU/mL.结论:成功包装了KCTD10 siRNA慢病毒颗粒,为后续进一步研究KCTD10基因在糖尿病视网膜病变中的作用奠定了基础.     

人促甲状腺激素受体HEK 293T细胞稳定表达株的构建

目的 构建人促甲状腺激素受体（hTSHR）稳定表达株,用于研究抗甲状腺新药。方法 AgeⅠ/NheⅠ双酶切载体GV266和hTSHR基因,T4连接酶连接构建GV266-hTSHR表达质粒。转染GV266-hTSHR到293T细胞后,Western blot证明hTSHR表达。用Opti-MEM、Lipofectamine 2000、辅助质粒在293T细胞构建GV266包装质粒。qPCR测定包装病毒滴度。用GV266包装质粒、GV266-hTSHR表达质粒共转染293T细胞获得GV266-hTSHR-293T稳定表达株。绿色荧光蛋白(GFP)荧光鉴定稳定表达株。结果 GV266-hTSHR构建物阳性大肠杆菌克隆的DNA测序结果与hTSHR序列比对100%吻合。Western blot显示,过表达hTSHR的 HEK 293T细胞出现相对分子质量为62×103的目的条带。qPCR测定包装质粒滴度达到了2×108 TU/mL。GV266-hTSHR-293T细胞稳定表达株表达GFP荧光。结论 构建了GV266-hTSHR表达质粒,获得了GV266-hTSHR-HEK 293T稳定表达株,为研究抗甲状腺多肽提供了必要的实验材料。     

转录因子E2F-1基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建细胞周期相关转录因子E2F-1RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体。方法：选取E2F-1基因的19nt特异性序列,设计针对E2F-1的shRNA序列,应用基因重组技术克隆到pLentiLox3.7（pLL3.7）慢病毒表达载体中,XbaI和NotI进行双酶切和DNA测序鉴定重组克隆,在脂质体的介导下将慢病毒的混合包装载体质粒和包含E2F-1基因RNAi的重组慢病毒载体共转染293FT细胞,包装成病毒48h后,收集病毒颗粒,孔稀释法测定病毒滴度。结果：双酶切证实shRNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确;293FT细胞包装E2F-1基因RNAi的重组慢病毒载体成功;收集的细胞培养上清液中,病毒的滴度为5×10^7TU/mL。结论：成功构建人E2F-1基因RNAi慢病毒载体,为研究E2F-1对于胃癌生长的影响提供了稳定的转染细胞载体。