碱性成纤维细胞生长因子转染兔关节软骨细胞的研究

背景：软骨细胞体外培养困难和表型难以维持是软骨组织工程研究的一大难题。目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子(basic Fibroblast Growth Factor，bFGF)基因转染兔关节软骨细胞后对培养的关节软骨细胞形态、分裂增殖及代谢等方面的影响。设计：完全随机对照实验研究。地点和方法：实验在解放军第一军医大学热带军队卫生学系完成，对象为兔软骨细胞(3周龄新西兰新生兔购于第一军医大学实验动物中心)。干预：将bFGF基因克隆于真核表达载体pHβ0AP-1中，构建重组真核表达载体pHβ-bFGF，转染兔关节软骨细胞。G418筛选阳性克隆，检测阳性细胞bFGF基因的表达水平。测定培养软骨细胞的DNA含量、糖醛酸含量、软骨细胞增殖情况及进行细胞周期分析。主要观察指标：DNA含量、糖醛酸含量、软骨细胞增殖情况及细胞周期分析。结果：bFGF基因转染软骨细胞表型未见显著变化；bFGF基因转染组、载体对照组、空白对照组DNA含量分别为(77．37&;#177;6．21)，(40．39&;#177;4．33)，(33．77&;#177;4．25)μg／瓶(P&;lt;0．01)，糖醛酸含量分别为(308．8&;#177;10．2)，(77．9&;#177;8．7)，(80．2&;#177;10．5)μg／瓶(P&;lt;0．01)，软骨细胞G1期分别为59．3&;#177;2．1，69．5&;#177;4．0，73．1&;#177;3．9(P&;lt;0．05)。结论：bFGF转染关节软骨细胞后，可显著促进细胞分裂增殖并缩短细胞周期，为软骨组织工程研究提供新的技术路线及理论基础。     

关节软骨缺损修复的基因治疗实验人胰岛素样生长因子Ⅰ基因转染软骨细胞及其在软骨细胞中的表达

目的探讨胰岛素样生长因子Ⅰ基因转染人软骨细胞的可能性及其在软骨细胞中的表达,并初步判断转基因细胞的生物学功能变化.方法实验于2002-07/2003-06在中山大学附属第二医院医学研究中心完成.①构建pcDNA3.1-胰岛素样生长因子I/GS质粒,将构建质粒在大肠杆菌DH10B中大量扩增后,抽提纯化质粒,并对质粒进行测序鉴定.②将鉴定的质粒用阳离子脂质体转染人关节软骨细胞,通过逆转录-聚合酶链反应、Westren-blot等方法检测胰岛素样生长因子Ⅰ基因在人关节软骨细胞中的表达.③分别将同代软骨细胞与转基因细胞的培养液、软骨细胞与转基因细胞裂解液和二甲基亚甲蓝共孵育后,检测各混合液的吸光度,以此判断同代软骨细胞、转基因细胞、软骨细胞培养液、转基因细胞培养液中的蛋白多糖含量.结果①质粒鉴定结果质粒抽提纯化后电泳可见3条DNA条带,符合质粒的电泳图谱;质粒的测序结果和胰岛素样生长因子Ⅰ基因序列完全吻合.②胰岛素样生长因子Ⅰ基因在软骨细胞中的表达质粒转染软骨细胞后,反转录-聚合酶链反应能见到298 bp的胰岛素样生长因子ⅠmRNA片断的表达;Western-blot可见7.6 ku的胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白表达条带.③转胰岛素样生长因子Ⅰ基因对软骨细胞分泌蛋白多糖的影响转基因软骨细胞裂解液和同代的软骨细胞裂解液的蛋白多糖含量分别是(5.23±0.62)mg/L和(2.47±0.31)mg/L,两组比较,差异有显著性意义(t=2.88,P＜0.05);转基因软骨细胞培养液和同代非转染软骨细胞培养液中的蛋白多糖含量分别为(9.92±1.04)mg/L和(4.56±0.51)mg/L,两组比较,差异有显著性意义(t=6.47,P＜0.05).结论胰岛素样生长因子Ⅰ基因转染人关节软骨细胞后能在软骨细胞中表达,并能促进软骨细胞分泌软骨基质蛋白多糖,具有促DNA合成和维持软骨细胞表型稳定的能力.转胰岛素样生长因子Ⅰ基因软骨细胞的研究为体外软骨组织工程和关节软骨病的基因治疗提供了直接的实验依据.     

转基因同种异体组织工程软骨修复兔膝关节全层缺损

目的:观察转人胰岛素样生长因子I基因同种异体组织工程软骨对兔膝关节软骨全层缺损的修复作用。方法:实验于2004-08/2005-08在军事兽医研究所病毒室及长春生物制品研究所实验室完成。①取出生28d新西兰白兔的关节软骨,采用机械分离及Ⅱ型胶原酶消化法获得分离的兔软骨细胞,用单层培养扩增。②用脂质体法使胰岛素样生长因子I基因转染兔关节软骨细胞。③以经过转染的兔关节软骨细胞作为种子细胞,牛Ⅰ型胶原作为支架,体外构建转基因同种异体组织工程软骨。④5个月龄的新西兰白兔80只制备关节软骨缺损模型,分别移植入不同组别的移植物:空白对照组、单纯支架组、单纯软骨细胞附和支架组、经过转染的软骨细胞附和支架组、自体软骨移植组,分别于术后4,8,16,24周处死各组动物4只取材,观察兔膝关节软骨全层缺损的修复情况。结果:①G418培养液筛选结果:通过G418对于兔关节软骨细胞的最小致死剂量的测定得出,G418对软骨细胞的最小致死剂量为0.4g/L。转染后软骨细胞经0.4g/LG418筛选,2周后得到抗G418的阳性细胞克隆,而未转染细胞在含G418的培养液中逐渐全部死亡,初步证明人胰岛素样生长因子I基因的转染成功。②原位杂交检测结果:转染软骨细胞胞浆中有氯化镍紫蓝色颗粒阳性杂交信号说明有人胰岛素样生长因子ImRNA的表达;未转染细胞则未见阳性信号。③免疫组织化学检测结果:在转染的软骨细胞胞浆中有棕黄色颗粒样阳性信号,说明有Ⅱ型胶原蛋白表达,证明稳定表达人胰岛素样生长因子I的转染软骨细胞保持Ⅱ型胶原的表达。④软骨缺损修复后的组织学评价结果:在试验所观察的24周内,软骨基本稳定,而且转胰岛素样生长因子I基因组织工程软骨显示出强烈的软骨基质分泌能力。转胰岛素样生长因子I基因的同种异体组织工程软骨对软骨缺损的修复效果明显优于空白对照组和单纯软骨细胞附和支架组犤空白对照组、单纯支架组、单纯软骨细胞附和支架组、经过转染的软骨细胞附和支架组、自体软骨移植组修复软骨的组织学评分:术后4周为(12.00±0.79),(11.00±0.81),(8.10±0.90),(5.80±1.03),(5.20±0.46)分;术后8周为(10.20±0.96),(10.10±1.19),(7.10±1.34),(4.90±1.15),(4.00±0.58)分;术后16周为(8.00±1.24),(8.50±1.79),(5.20±1.88),(4.00±1.82),(2.00±1.96)分;术后24周为(7.00±0.90),(6.50±2.13),(4.30±2.00),(3.00±2.13),(1.20±0.78)分,P<0.05犦。结论:人胰岛素样生长因子I基因转染兔关节软骨细胞后可以在细胞中表达,而且转胰岛素样生长因子I基因的同种异体组织工程软骨对兔关节软骨全层缺损的修复效果明显。为进一步转基因组织工程软骨实验提供了依据。     

碱性成纤维细胞生长因子对培养的半月板纤维软骨细胞的促进增殖作用

目的 研究碱性成纤维细胞生长因子( basic fibroblast growth factor , bFGF)对培养兔纤维软骨细胞增殖的影响,探讨其作用机制. 方法培养 1月龄新西兰兔半月板纤维软骨细胞,以 1, 10, 100 μ g/L的 bFGF作用细胞 , 以四氮甲基唑蓝( MTT)比色法检测细胞的增殖情况,并在 10 μ g/L bFGF作用下,采用流式细胞技术进行细胞周期亚时相分析. 结果在 1～ 100 μ g/L范围内 bFGF对培养纤维软骨细胞的增殖均有促进作用, 10 μ g/L bFGF即可有显著效果.实验组细胞周期较对照组明显缩短, DNA合成前期 (G1期 ), DNA合成期 (S期 )和分裂前期及分裂期 (G2M)的时间分别为 14.58, 12.30, 11.43 h,对照组分别为 22.77, 17.90, 20.62 h. 结论 bFGF对培养的半月板纤维软骨细胞增殖有促进作用,能缩短纤维软骨细胞 DNA合成 G1期及 G2M期,从而缩短细胞周期、促进细胞分裂增殖.     

诱导型一氧化氮合酶在关节软骨缺血再灌注损伤及骨细胞凋亡中的作用

目的观察兔膝关节软骨缺血再灌注损伤过程中诱导型一氧化氮合酶的表达规律及软骨细胞的凋亡情况,探讨诱导型一氧化氮合酶在关节软骨缺血再灌注损伤中的作用.方法实验于2004-03/09在泰山医学院形态学研究室完成.①选择健康新西兰白兔45只,随机分为假手术组5只,暴露股动静脉但不阻断血运,术后4 h取材;缺血组5只,缺血4 h不恢复血运即取材;缺血再灌注组35只,阻断股动静脉4 h后恢复血运,于缺血再灌注2,4,8,24 h,3,7,14 d取材,每时点各5只.②采用免疫荧光法测定软骨内诱导型一氧化氮合酶的表达阳性细胞,染色成功后用激光共聚焦显微镜观察并扫描记录.阳性细胞标记为红色荧光.③采用原位末端标记法测定凋亡软骨细胞数目,染色成功后在显微镜下观察并记数.细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞,即凋亡细胞.结果纳入动物45只,均进入结果分析.①缺血再灌注组诱导型一氧化氮合酶阳性细胞数高于缺血组和假手术组[假手术组、缺血组、缺血再灌注2,4,8,24 h,3,7,14 d分别为0,(1.20±0.40),(22.20±1.30),(33.00±1.58),(40.00±1.58),(33.80±1.30),(18.20±1.48),(11.20±1.67),(3.00±1.00)个/mm2,P＜0.01].②缺血再灌注组软骨细胞凋亡数高于缺血组和假手术组[假手术组、缺血组、缺血再灌注2,4,8,24 h,3,7,14 d分别为[(0.50±0.40),(1.20±0.45),(7.80±1.30),(12.60±1.14),(16.60±1.12),(17.80±1.30),(15.20±0.87),(13.60±0.89),(4.40±1.67)个/mm2,P＜0.01].③诱导型一氧化氮合酶的表达与软骨细胞凋亡数高度相关(r=0.716,P=0.046).结论诱导型一氧化氮合酶参与了软骨缺血再灌注损伤,并可能是触发软骨细胞凋亡的重要因素.     

成纤维细胞生长因子对弹性软骨细胞增殖和基质形成的影响

目的:观察成纤维细胞生长因子对软骨细胞增殖和细胞外基质合成的影响。方法:实验于2003-03/2004-12在第四军医大学口腔颌面外科实验室和南方医科大学南方医院组织工程中心完成。酶消化法从兔耳获取软骨细胞与12g/L藻酸钠混合,细胞浓度1010L-1,经注射器滴入125mmol/L的氯化钙溶液,形成软骨细胞/藻酸钙凝胶微球,用含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM培养液体外培养,培养液中分别加入0,10,50和100μg/L浓度的碱性成纤维细胞生长因子,14d终止培养,进行生物化学分析。观察各组DNA总量、糖胺多糖总量、单位DNA的糖胺多糖含量。结果:①DNA总量:0,10,50和100μg/L成纤维细胞生长因子浓度组分别为(3.44±0.23),(4.70±0.22),(6.60±0.35)和(6.82±0.33)μg。②糖胺多糖总量:0,10,50和100μg/L成纤维细胞生长因子浓度组分别为(15.35±0.80),(20.63±0.72),(29.72±2.08)和(31.11±2.39)μg。③单位DNA的糖胺多糖含量:0,10,50和100μg/L成纤维细胞生长因子浓度组分别为(4.47±0.09),(4.39±0.13),(4.50±0.13),(4.55±0.18)g/g。结论:成纤维细胞生长因子明显促进了软骨细胞的增殖,糖胺多糖合成总量也得到明显提高,但单位DNA的糖胺多糖合成量无明显变化,表明成纤维细胞生长因子影响软骨细胞的生物学特性。     

关节软骨缺损修复的基因治疗实验——人胰岛素样生长因子I基因转染软骨细胞及其在软骨细胞中的表达

目的:探讨胰岛素样生长因子I基因转染人软骨细胞的可能性及其在软骨细胞中的表达,并初步判断转基因细胞的生物学功能变化。方法:实验于2002-07/2003-06在中山大学附属第二医院医学研究中心完成。①构建pcDNA3.1-胰岛素样生长因子I/GS质粒,将构建质粒在大肠杆菌DH10B中大量扩增后,抽提纯化质粒,并对质粒进行测序鉴定。②将鉴定的质粒用阳离子脂质体转染人关节软骨细胞,通过逆转录-聚合酶链反应、Westren-blot等方法检测胰岛素样生长因子I基因在人关节软骨细胞中的表达。③分别将同代软骨细胞与转基因细胞的培养液、软骨细胞与转基因细胞裂解液和二甲基亚甲蓝共孵育后,检测各混合液的吸光度,以此判断同代软骨细胞、转基因细胞、软骨细胞培养液、转基因细胞培养液中的蛋白多糖含量。结果:①质粒鉴定结果:质粒抽提纯化后电泳可见3条DNA条带,符合质粒的电泳图谱;质粒的测序结果和胰岛素样生长因子I基因序列完全吻合。②胰岛素样生长因子I基因在软骨细胞中的表达:质粒转染软骨细胞后,反转录-聚合酶链反应能见到298bp的胰岛素样生长因子ImRNA片断的表达;Western-blot可见7.6ku的胰岛素样生长因子I蛋白表达条带。③转胰岛素样生长因子I基因对软骨细胞分泌蛋白多糖的影响:转基因软骨细胞裂解液和同代的软骨细胞裂解液的蛋白多糖含量分别是(5.23±0.62)mg/L和(2.47±0.31)mg/L,两组比较,差异有显著性意义(t=2.88,P<0.05);转基因软骨细胞培养液和同代非转染软骨细胞培养液中的蛋白多糖含量分别为(9.92±1.04)mg/L和(4.56±0.51)mg/L,两组比较,差异有显著性意义(t=6.47,P<0.05)。结论:胰岛素样生长因子I基因转染人关节软骨细胞后能在软骨细胞中表达,并能促进软骨细胞分泌软骨基质蛋白多糖,具有促DNA合成和维持软骨细胞表型稳定的能力。转胰岛素样生长因子I基因软骨细胞的研究为体外软骨组织工程和关节软骨病的基因治疗提供了直接的实验依据。     

碱性成纤维细胞生长因子对培养的半月板纤维软骨细胞的促进增殖作用

目的：研究碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)对培养兔纤维软骨细胞增殖的影响，探讨其作用机制。方法：培养1月龄新西兰兔半月板纤维软骨细胞，以1，10，100μg／L的bFGF作用细胞，以四氮甲基唑蓝(MTT)比色法检测细胞的增殖情况，并在10μg／L bFGF作用下，采用流式细胞技术进行细胞周期亚时相分析。结果：在1～100μg／L范围内bFGF对培养纤维软骨细胞的增殖均有促进作用，10μg／L bFGF即可有显著效果。实验组细胞周期较对照组明显缩短，DNA合成前期(G1期)，DNA合成期(S期)和分裂前期及分裂期(G2M)的时间分别为14．58，12．30，11．43h，对照组分别为22．77.17．90，20．62h。结论：bFGF对培养的半月板纤维软骨细胞增殖有促进作用，能缩短纤维软骨细胞DNA合成G1期及G2M期，从而缩短细胞周期、促进细胞分裂增殖。     

人骨形态发生蛋白7基因转染对骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化性能的影响

背景骨组织工程中一个重要的研究内容就是如何保持并提高成骨细胞的体内外成骨能力,采用基因转移技术有可能为此问题的解决提供一种新的有效方法.目的探讨逆转录病毒介导的人骨形态发生蛋白7基因转染对兔骨髓间充质干细胞增殖和向成骨细胞分化的影响.设计以细胞为研究对象,分组对照,重复观察测量.对象实验2001-07/2003-07在南方医科大学附属南方医院创伤骨科实验室完成.新西兰大白兔4只由第一军医大学动物实验中心提供,雌雄不拘,体质量1.0～1.5 kg.方法构建人骨形态发生蛋白7逆转录病毒载体,使用含目的基因的病毒液感染骨髓间充质干细胞,免疫组织化学方法检测人骨形态发生蛋白7蛋白的表达.四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖能力,使用流式细胞仪检测细胞周期,NPP法检测碱性磷酸酶合成情况.主要观察指标主要结局①细胞增殖检测结果.②碱性磷酸酶检测结果.次要结局①转染骨髓间充质干细胞中人骨形态发生蛋白7蛋白的表达.②细胞周期检测结果.结果经骨形态发生蛋白7基因转染的兔骨髓间充质干细胞免疫组织化学检测显示有人骨形态发生蛋白7的阳性表达.经人骨形态发生蛋白7基因转染的兔骨髓间充质干细胞增殖能力无明显改变(P＞0.05).经转染的骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶合成(294.592±86.567)nkat/L与转染空载体(155.231±86.567)nkat/L、未转染的骨髓间充质干细胞(160.866±91.585)nkat/L相比较差异有显著性意义(F=5.660,P＜0.05).结论经骨形态发生蛋白7基因转染的骨髓间充质干细胞能够合成表达外源骨形态发生蛋白7,人骨形态发生蛋白7基因转染能够促进体外培养的骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化,可用于以骨髓间充质干细胞为种子细胞的组织工程化骨组织的构建和进一步应用.     

补肾益气活血方对实验性膝骨关节炎兔关节软骨组织形态学的影响

背景目前治疗膝骨关节炎的药物主要是非类固醇类药,应用后可产生胃肠道副作用.研究表明,补肾益气活血方能明显改善膝骨关节炎患者关节疼痛和功能,并且副作用较小.目的通过建立兔膝关节骨关节炎模型,探讨补肾益气活血方对兔病变膝关节软骨病理过程的影响.设计以实验动物为研究对象,随机对照观察研究.单位一所大学动物实验中心.材料健康雄性新西兰兔36只,体质量2.0～3.0kg.方法实验于2002-01/2003-01在广州中医药大学动物实验中心完成.新西兰兔36只,建立Hulth膝骨关节炎模型,术后随机分成3组模型组、醋氨酚组和补肾益气活血方组.各组采取相应的处理方法,术后4,8和12周取材,进行组织病理学评估.主要观察指标主要结局各组关节软骨病理改变积分.次要结局①各组关节软骨肉眼观察.②各组关节软骨光镜观察.结果模型组、醋氨酚组、补肾益气活血方组关节软骨病理变化总积4周分别为(18.50±1.00),(14.25±1.26),(11.75±2.22)分;12周分别为(30.75±1.26),(22.00±3.16),(17.75±2.21)分.各组关节软骨病理变化总积分、软骨细胞病理改变积分和软骨表层病理改变积分依次为模型组＞醋氨酚组＞补肾益气活血方组.组间比较差异均有显著或非常显著性意义.结论补肾益气活血方能延缓膝骨关节炎的病理过程,达到防治膝骨关节炎的作用.     

基因枪转人碱性成纤维细胞生长因子基因促进深Ⅱ度烧伤创面的愈合

背景:大量的体内和体外实验已证实,碱性成纤维细胞生长因子对不同组织和细胞具有广泛作用,可加快创面愈合进程.目的:观察基因枪转人碱性成纤维细胞生长因子基因促进深Ⅱ度烧伤创面愈合的效果和可行性.设计、时间及地点:完全随机设计,观察实验,于2007-12/2008-10在解放军第二军医大学长海医院全军烧伤中心实验室完成.材料:SD清洁级大鼠,体质量200-250 g,雌雄不拘.方法:将天然人碱性成纤维细胞生长因子基因重组优化,以pCI-neo为载体构建重组人碱性成纤维细胞生长因子基因高效真核表达载体pCI-neo-bFGF,并转染人胚肾细胞293T细胞,转染后以dot blot和western blot检测碱性成纤维细胞生长因子的表达.利用基因枪技术对SD大鼠深Ⅱ度烧伤创面模型进行转基因,以转染pCI-neo-bFGF为实验组,以转染空载体pCI-neo为对照组.主要观察指标:记录创面愈合时间,在转基因后24 h,48 h,96 h,7d,10d和14d测定创面组织羟脯氨酸和胶原酶Ⅰ水平,评价创面愈合情况.结果:重组构建的pCI-neo-bFGF经转染人胚肾细胞293T细胞,dot blot和western blot 检测结果显示,构建的pCI-neo-bFGF表达载体可表达人碱性成纤维细胞生长因子,荧光显微镜下合成基因的表达水平明显高于天然基因表达;基因枪转基因实验结果显示,实验组创面愈合时间为(13.00±1.31)d,对照组为(14.75±1.28)d,两组相比较差异有显著性意义(P＜0.05):两组羟脯氨酸及胶原酶Ⅰ水平均于基因枪转染后48h即伤后第5天达到高峰,随后逐渐下降至一定水平后维持,实验组各时间点羟脯氨酸水平均高于对照组(P＜0.05,P＜0.01);实验组转基因后48 h和96 h胶原酶Ⅰ水平明显高于对照组(P＜0.01).结论:基因枪转人碱性成纤维细胞生长因子基因可以缩短创面愈合时间.增加创面愈合期间组织羟脯氪酸和胶原酶Ⅰ水平,加快深Ⅱ度烧伤创面愈合进程.     

地塞米松磷酸钠对体外培养关节软骨细胞增殖的影响

背景:研究表明,地塞米松可以使关节软骨表层基质中的Ⅱ型胶原减少,Ⅰ型胶原增多,但糖皮质激素对关节软骨细胞增殖作用的机制尚不十分清楚.目的:验证地塞米松磷酸钠对体外培养兔关节软骨细胞增殖的影响.设计:对比观察.材料: 1月龄新西兰白兔用于软骨细胞的分离与培养.方法:兔关节软骨细胞常规培养后随机分为对照组和实验组,对照组用不含地塞米松磷酸钠的DMEM培养液培养,实验组则分别加入含不同质量浓度地塞米松磷酸钠(0.02,0.1,0.5 g/L)的DMEM培养液.主要观察指标:①原代及传代兔关节软骨细胞的形态学观察.②应用流式细胞术及免疫细胞化学法检测软骨细胞增殖及其合成Ⅱ型胶原能力.③透射电子显微镜观察软骨细胞超微结构的变化.结果:实验组软骨细胞贴壁、增殖较对照组缓慢.各实验组Ⅱ型胶原平均灰度值均显著高于对照组(P<0.05).实验组软骨细胞进入S期、G_2+M期的细胞比率较对照组软骨细胞减少、进入G_0/G_1期的细胞比率增加.电镜下见软骨细胞线粒体、粗面内质网数量减少.结论:地塞米松磷酸钠抑制软骨细胞的增殖,可能与抑制关节软骨细胞Ⅱ型胶原和蛋白的合成能力有关.     

Efficient lipid-mediated gene transfer to articular chondrocytes

We examined nonviral, lipid-mediated gene transfer methods as potential tools for efficient transfection of articular chondrocytes. Transfection conditions were determined for primary cultures of normal human articular, osteoarthritic human articular and normal bovine articular chondrocytes using a lacZ reporter gene construct with the commercially available cationic liposomes Cellfectin, DMRIE-C, LipofectAmine, Lipofectin, LipoTaxi, TransFast and the lipid-based reagent FuGENE 6. Optimized conditions were then evaluated in an ex vivo model of chondrocyte transplantation. FuGENE 6 transfection produced the maximum levels of transgene expression. Transfection efficiency was cell type specific and affected by DNA concentration, lipid/DNA ratio and the presence of hyaluronidase, a matrix-degrading enzyme. Analysis of X-gal staining demonstrated an efficiency of 41.0% in normal bovine articular chondrocytes, 20.7% in normal human articular chondrocytes and 7.8% in osteoarthritic human chondrocytes. Transfected chondrocytes were found to successfully populate the articular cartilage surface in explant cultures. Transplanted genetically modified chondrocytes adhered to the articular cartilage and continued to produce beta-galactosidase for 2 weeks. This evaluation and optimization of lipid-based gene transfer into articular chondrocytes may serve as a useful tool in studies of genes involved in articular cartilage damage and repair and as a potential delivery method for therapeutic genes. Gene Therapy (2000) 7, 286-291.     

碱性成纤维细胞生长因子对生长板软骨细胞增殖与分化的影响

背景：体外培养软骨细胞经历多次传代后，其增殖能力将逐渐退化。实验表明，碱性成纤维细胞生长因子可促进软骨细胞增殖，并可能影响软骨细胞的表型与分化。目的：观察碱性成纤维细胞生长因子对生长板软骨细胞增殖和分化的影响，并筛选其用于体外软骨细胞培养的最佳剂量。设计、时间及地点：以细胞为观察对象的观察对比实验，于2004—10／2005—02在暨南大学医学院生化教研室组织工程实验室完成。材料：选用12只新西兰白兔用于分离软骨细胞，碱性成纤维细胞生长因子由英国PeproTech公司生产。方法：分离并在低血清条件下培养兔生长板软骨细胞。根据实验需要加入0，1，2．5，5，10，25，50及100μg／L8个剂量的碱性成纤维细胞生长因子，进行各项指标观察。主要观察指标：应用改良四甲基偶氮唑蓝比色法检测细胞增殖倍数；应用羟脯氨酸法测定软骨细胞胶原产量：应用酶动力学方法测定碱性磷酸酶活性。结果：①碱性成纤维细胞生长因子剂量在5～100μg／L范围内可以促进软骨细胞增殖，并以25μg／L时刺激效果最为显著。②当碱性成纤维细胞生长因子剂量高于25μg／L时，软骨细胞的胶原合成被抑制。③当碱性成纤维细胞生长因子剂量高于1ug／L时，软骨细胞的碱性磷酸酶活性被抑制。结论：碱性成纤维细胞生长因子可以刺激生长板软骨细胞增殖，并在剂量高于25μg／L时抑制生长板软骨细胞的分化。     

PGA‐associated heterotopic chondrocyte cocultures: implications of nasoseptal and auricular chondrocytes in articular cartilage repair

The availability of autologous articular chondrocytes remains a limiting issue in matrix assisted autologous chondrocyte transplantation. Non‐articular heterotopic chondrocytes could be an alternative autologous cell source. The aims of this study were to establish heterotopic chondrocyte cocultures to analyze cell‐cell compatibilities and to characterize the chondrogenic potential of nasoseptal chondrocytes compared to articular chondrocytes. Primary porcine and human nasoseptal and articular chondrocytes were investigated for extracellular cartilage matrix (ECM) expression in a monolayer culture. 3D polyglycolic acid‐ (PGA) associated porcine heterotopic mono‐ and cocultures were assessed for cell vitality, types II, I, and total collagen‐, and proteoglycan content. The type II collagen, lubricin, and Sox9 gene expressions were significantly higher in articular compared with nasoseptal monolayer chondrocytes, while type IX collagen expression was lower in articular chondrocytes. Only β1‐integrin gene expression was significantly inferior in humans but not in porcine nasoseptal compared with articular chondrocytes, indicating species‐dependent differences. Heterotopic chondrocytes in PGA cultures revealed high vitality with proteoglycan‐rich hyaline‐like ECM production. Similar amounts of type II collagen deposition and type II/I collagen ratios were found in heterotopic chondrocytes cultured on PGA compared to articular chondrocytes. Quantitative analyses revealed a time‐dependent increase in total collagen and proteoglycan content, whereby the differences between heterotopic and articular chondrocyte cultures were not significant. Nasoseptal and auricular chondrocytes monocultured in PGA or cocultured with articular chondrocytes revealed a comparable high chondrogenic potential in a tissue engineering setting, which created the opportunity to test them in vivo for articular cartilage repair. Copyright © 2011 John Wiley & Sons, Ltd.     

转腺病毒-人骨形态发生蛋白7软骨细胞分泌的透明质酸和Ⅱ型胶原

背景:软骨细胞自身分裂能力不强和去分化现象限制了其在组织工程中的应用。目的:观察腺病毒-骨形态发生蛋白7转染兔软骨细胞后骨形态发生蛋白7的表达及其对软骨细胞分泌Ⅱ型胶原和透明质酸功能的影响。方法:包装骨形态发生蛋白7腺病毒载体,将其转染至兔第2代软骨细胞。检测骨形态发生蛋白7mRNA及蛋白的表达;检测软骨细胞中Ⅱ型胶原和透明质酸的变化。结果与结论:转染腺病毒-骨形态发生蛋白7后48,72h,RT-PCR和Western blot方法显示软骨细胞表达的骨形态发生蛋白7mRNA和蛋白均明显增加,RT-PCR和ELISA显示软骨细胞分泌的Ⅱ型胶原和透明质酸也显著增加。说明应用腺病毒可成功将骨形态发生蛋白7转染至兔软骨细胞,并能促进软骨细胞分泌Ⅱ型胶原和透明质酸。     

体外传代培养兔关节软骨细胞的去分化现象

背景：兔是软骨组织工程研究中应用非常广泛的实验动物模型,关节软骨细胞的去分化现象已经被广泛认可.目的：观察体外传代培养过程中兔关节软骨细胞的去分化现象.方法：将从新西兰大白兔膝关节分离获取的原代软骨细胞进行传代培养至第7代,对细胞生长、形态、基质分泌以及基因表达等方面分别采用细胞计数,显微镜观察,F机动蛋白染色、番红O染色,糖胺聚糖定量测定以及半定量聚合链式反应进行鉴定和比较.结果与结论：光学显微镜下,兔关节软骨细胞在体外传代培养过程中细胞形态由小且圆形或多角形,逐步转变大且为成纤维细胞样的梭形形态,对F机动蛋白的染色进一步佐证了这样的形态变化.细胞计数结果表明,细胞增殖能力随代次增加显著下降,特别是第3代以后的软骨细胞基本无明显增殖;经过番红 O 染色以及定量测定糖胺聚糖的含量,发现软骨特性胞外基质分泌量从第2代细胞开始就呈现显著的降低.半定量聚合链式反应检测结果表明,随着传代次数的增加,特别是第3代以后,软骨相关特征分子（包括Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖、软骨寡聚基质蛋白和SOX9等）基因表达水平下调;而与去分化相关的特征分子Ⅰ型胶原和多能蛋白聚糖基因表达水平上调,同时,细胞表面分子CD90基因表达上调,而CD14基因表达未见明显变化.结果证实,兔软骨细胞在体外传代过程中可出现快速地去分化现象,呈现出特征基因表达水平的变化,第3代以内的软骨细胞适合应用于软骨组织再生修复.     

关节软骨损伤后体外培养软骨细胞的功能变化

背景:关节软骨损伤可以影响软骨细胞功能,诱发创伤性骨关节炎.目的:观察关节软骨损伤后体外培养的软骨细胞功能的变化.方法:通过酶消化法分离培养高能量、低能量撞击后和正常兔膝关节透明软骨细胞,观察创伤能量对软骨细胞生存能力的影响;检测软骨细胞合成蛋白多糖和Ⅱ型胶原能力,检测细胞中白细胞介素1β和核转录因子κB mRNA表达水平,检测细胞合成白细胞介素1β和基质金属蛋白酶1的表达.结果与结论:高能量和低能量关节软骨损伤后,软骨细胞的存活率下降,原代细胞的贴壁细胞数量减少,贴壁时间延长,生长曲线下移,细胞甲苯胺蓝染色异染反应减弱,Ⅱ型胶原免疫组化染色强度减弱,软骨细胞中白细胞介素1β和核转录因子κB mRNA表达水平上升,细胞培养液中白细胞介素1β和基质金属蛋白酶1的质量浓度升高,其中高能量组效果更为显著(P < 0.05).说明关节软骨损伤后软骨细胞的功能受到影响,受损程度与创伤强度及炎性细胞因子的表达相关.     

反转录病毒载体介导转化生长因子β_1基因体外转染兔膝关节软骨细胞的表达

背景:将功能基因片段整合到基因载体内,再将基因载体转染入靶细胞中或转染入关节腔内,通过转基因的靶细胞持续大量分泌功能基因产物,在一个较长的时期内保持局部治疗浓度,可修复关节软骨损伤.目的:以重组反转录病毒载体介导转化生长因子β_1体外转染兔膝关节软骨细胞,观察其表达情况及其对软骨细胞生物学性状的影响.方法:采用胰酶消化法分离培养兔软骨细胞.载体经PLNCX_2 Hind Ⅲ/Not Ⅰ双酶切、去磷酸化后,与载体pDsRed_2双酶切得到大的部分多克隆位点和RFP基因连接,构建PLNCX_2-RFP.转化生长因子β_1基因从PGEMT-TGF中扩增,经双酶切后与PLNCX_2-RFP连接,构建PLNCX_2-TGFβ_1-RFP.包装反转录病毒载体,并检测病毒上清滴度.将培养的兔膝关节软骨细胞分组转染:对照组(不做任何转染)、转染PLNCX_2组、转染PLNCX_2-TGFβ_1-RFP组,持续筛选2周,观察细胞变化.收集稳定转染的细胞上清液,以NO检测试剂盒检测基因转染对软骨细胞的影响,以ELISA法检测细胞培养上清液中人转化生长因子β_1表达.结果与结论:重组基因PLNCX_2-TGFβ_1-RFP经酶切鉴定测序TGFβ_1、RFP、序列均正确,表明构建成功预期的真核表达载体PLNCX_2-TGFβ_1-RFP.转染到包装细胞并筛选培养后,病毒滴度为1×10~6CFU.稳定转染软骨细胞后可观察到红色荧光,证明转染成功.持续筛选2周,散在贴壁细胞形成阳性克隆,逐渐弥漫融合,并有细胞簇出现,双核多见,细胞增生活跃.转染PLNCX_2-TGFβ_1-RFP组NO浓度高于对照组、转染PLNCX_2组(P<0.05),对照组、转染PLNCX_2组间差异无显著性意义.对照组与转染PLNCX_2组均无转化生长因子β_1表达,转染PLNCX_2-TGFβ_1-RFP组转化生长因子β_1质量浓度为(28.08±3.73)ng/L.提示反转录病毒载体PLNCX_2介导的人转化生长因子β_1能有效转染到兔膝关节软骨细胞并获得稳定表达,同时转染后的软骨细胞增生活跃.     

自组装短肽水凝胶体外三维培养兔关节软骨细胞

背景:自组装短肽是人工设计合成的一类新型纳米生物材料,与软骨细胞复合培养后如能促进细胞基质的分泌,细胞分裂增殖及细胞表型的维持,将有可能成为一种较理想的细胞支架应用在软骨组织工程中。目的:观察兔关节软骨细胞在纳米自组装短肽KLD-12水凝胶中三维培养的生物学特性。设计、时间及地点:观察性实验,于2007-11/2008-04在四川大学纳米生物医学技术与膜生物学研究所实验室完成。材料:纳米短肽KLD-12序列为:Ac-KLDLKLDLKLDL-CONH2,由上海波泰生物公司合成。方法:取新西兰兔关节软骨,通过酶消化法获取软骨细胞,体外培养2代后以5×109L-1的密度接种于4g/L的自组装短肽KLD-12溶液中,用磷酸盐缓冲液诱导成胶后进行三维培养。主要观察指标:①通过倒置相差显微镜观察软骨细胞在纳米短肽水凝胶中的形态。②用甲苯胺蓝染色,免疫组化检测细胞外基质分泌情况。③反转录-聚合酶链反应检测软骨细胞黏多糖、前Ⅱ型胶原、前Ⅰ型胶原基因的表达情况。结果:①兔关节软骨消化分离的软骨细胞成活率达95%以上。②软骨细胞在纳米短肽水凝胶中体外培养时,细胞生长旺盛、增殖活跃,细胞为圆形聚集成团状或岛状,细胞团周围有类似的软骨陷窝形成。③甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化均呈阳性,细胞基质中黏多糖、Ⅱ型胶原含量随培养时间延长逐渐增加。④反转录-聚合酶链反应结果显示软骨细胞在纳米短肽水凝胶经过3周体外培养一直保持了分泌黏多糖及表达Ⅱ型胶原的能力。结论:自组装短肽KLD-12三维水凝胶能较好维持软骨细胞正常形态、功能和增殖能力。