联合转染mdrl和mcll基因短发夹RNA干扰表达质粒逆转K562/A02细胞耐药的实验研究

目的构建针对 mdrl 和 mell 基因的短发夹 RNA(shRNA)干扰表达质粒,并探讨联合转染对 K562/A02细胞耐药的逆转作用。方法根据 mdrl 和 mell 基因表达序列设计有效的 RNA 干扰片段,分别将其构建入质粒表达空载体中,以获得两种基因特异性 shRNA 干扰表达质粒;然后在脂质体介导下分别和联合转染 K562/A02细胞,用 G418和(或)Hygro B 筛选出稳定表达的细胞克隆。用RT-PCR 分析 mdrl 和 mcll mRNA 的表达;MTT 法检测阿霉素对 K562/A02细胞的半数抑制浓度(IC_(50));流式细胞术测定细胞 P-糖蛋白表达水平以及细胞凋亡率。结果成功构建两个基因的 shRNA干扰表达质粒。mdrl、mell shRNA 干扰表达质粒单独和联合转染 K562/A02细胞可有效封闭相应基因表达,联合转染组 mdrl 基因和 mell 基因的 mRNA 相对表达水平分别是未转染细胞的52%,44%。mdrl、mell shRNA 干扰表达质粒单独和联合转染后 K562/A02细胞耐药逆转率分别为63.8%,71.1%,83.1%,转染两种质粒组对 K562/A02细胞耐药逆转率最高,P 糖蛋白相对表达量由未转染组的19.70±1.15降至6.40±0.92(P<0.01),阿霉素诱导的细胞凋亡率由(1.53±0.42)%提高至(7.77±0.42)%(P<0.01)。联合转染两种质粒组和单独转染组比较,细胞对阿霉素敏感性和阿霉素诱导的细胞凋亡率差异亦有统计学意义(P<0.05)。结论转染 mdrl 或 mell 基因的 shRNA 干扰表达质粒可有效抑制相应基因表达,皆不同程度逆转 K562/A02细胞对阿霉素的耐药性;联合转染两种质粒可显著增加逆转耐药的效果。mell 基因可能与 K562/A02耐药相关。     

联合转染mdr1和mcl1基因短发夹RNA干扰表达质粒逆转K562/A02细胞耐药的实验研究

目的构建针对mdr1和mcl1基因的短发夹RNA(shRNA)干扰表达质粒,并探讨联合转染对K562/A02细胞耐药的逆转作用.方法根据mdr1和mcl1基因表达序列设计有效的RNA干扰片段,分别将其构建入质粒表达空载体中,以获得两种基因特异性shRNA干扰表达质粒;然后在脂质体介导下分别和联合转染K562/A02细胞,用G418和(或)Hygro B筛选出稳定表达的细胞克隆.用RT-PCR分析mdr1和mcl1 mRNA的表达;MTT法检测阿霉素对K562/A02细胞的半数抑制浓度(IC50);流式细胞术测定细胞P-糖蛋白表达水平以及细胞凋亡率.结果成功构建两个基因的shRNA干扰表达质粒.mdr1、mcl1 shRNA干扰表达质粒单独和联合转染K562/A02细胞可有效封闭相应基因表达,联合转染组mdr1基因和mcl1基因的mRNA相对表达水平分别是未转染细胞的52%,44%.mdr1、mcl1 shRNA干扰表达质粒单独和联合转染后K562/A02细胞耐药逆转率分别为63.8%,71.1%,83.1%,转染两种质粒组对K562/A02细胞耐药逆转率最高,P糖蛋白相对表达量由未转染组的19.70±1.15降至6.40±0.92(P《0.01),阿霉素诱导的细胞凋亡率由(1.53±0.42)%提高至(7.77±0.42)%(P《0.01).联合转染两种质粒组和单独转染组比较,细胞对阿霉素敏感性和阿霉素诱导的细胞凋亡率差异亦有统计学意义(P《0.05).结论转染mdr1或mcl1基因的shRNA干扰表达质粒可有效抑制相应基因表达,皆不同程度逆转K562/A02细胞对阿霉素的耐药性;联合转染两种质粒可显著增加逆转耐药的效果.mcl1基因可能与K562/A02耐药相关.     

KLF4过表达对白血病K562细胞增殖、凋亡的影响

目的:建立稳定过表达人锌指转录因子Krüppel样因子4(Krüppe-like factor 4,KLF4)基因的K562细胞株,研究KLF4过表达对白血病K562细胞增殖、凋亡的影响。方法:将过表达KLF4的重组质粒p EGFP-KLF4电穿孔转染白血病K562细胞,G418压力筛选出稳定转染细胞克隆并扩大培养(K562/p EGFP-KLF4组),设p EGFP-C1空质粒转染K562细胞(K562/p EGFP-C1组)及空白K562细胞对照组。应用荧光显微镜观察EGFP-KLF4融合蛋白的表达,Western blot法检测各组细胞中KLF4蛋白表达水平,MTT比色法检测各组细胞的增殖能力,流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况。结果:p EGFP-KLF4重组质粒转染K562细胞后,经G418压力筛选,获得了表达绿色荧光蛋白的稳定细胞株;与对照组相比,K562/p EGFP-KLF4组细胞KLF4的蛋白表达水平明显升高,其过表达率为74.07%(P0.05);过表达KLF4的K562细胞增殖活力被显著抑制(P0.05);过表达KLF4的K562细胞凋亡显著增加(P0.05)。结论:KLF4过表达可抑制K562细胞的增殖,促进其凋亡。     

自分泌VEGF对人慢性髓性白血病细胞系K562的作用

血管内皮细胞生长因子（VEGF）是血管内皮细胞特异性的丝裂原,与实体肿瘤的血管生成、生长、转移及不良预后密切相关。最近的报送表明,慢性髓性白血病（CML）病人骨髓过度表达VEGF。然而,VEGF在CML细胞异常增殖中的作用还不清楚。为了探讨自分泌VEGF对CML细胞系K562增殖与凋亡的影响,本研究首次采用正义和反义VEGF121cDNA转染K562细胞,通过RT-PCR及ELISA方法鉴定各转染克隆VEGF mRNA及蛋白的表达。结果显示,转染反义VEGF121 cDNA可以降低K562细胞VEGF的表达,而转染正义VEGF121 cDNA可使VEGF的表达提高3倍以上。MTT,集落形成试验及细胞凋亡检测试验观察：反义VEGF121 cDNA转染可以抑制K562细胞的增殖及其集落形成,而促进其凋亡;正义VEGF121 cDNA转染与其结果相反。本研究结果说明自分泌VEGF在CML细胞系K562的增殖与凋亡起重要作用。     

PLK1基因缄默在K562细胞凋亡中的作用

目的观察缄默PLK1基因的短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)对K562细胞内PLK1表达和细胞凋亡的影响,探讨PLK1在白血病发病中的作用,寻找更为有效的白血病治疗途径。方法设计合成针对PLK1基因1416~1436位点的shRNA片段,并将其克隆于绿色荧光蛋白的表达载体pEGFP-H1中,命名为pEGFP-H1/PLK1。通过电穿孔转染法将其导入K562细胞中,分为对照组、pEGFP-H1空载体转染组和pEGFP-H1/PLK1shRNA重组质粒转染组,转染后24,48h,分别通过RT-PCR和Western blot检测各组细胞PLK1基因和蛋白水平的变化,以MTT方法测各组细胞的增殖活性,比色法检测各组细胞的半胱天冬酶3(caspase-3)蛋白酶活性,并通过流式细胞仪检测各组细胞的凋亡和G2/M期转变情况。结果PLK1mRNA相对水平(与内参的灰度比值)对照组为1.25±0.07,空载体转染24,48h组分别为1.21±0.08和1.23±0.09,shRNA重组质粒转染24,48h组分别为0.52±0.04和0.25±0.02,shRNA重组质粒转染组较其他两组明显降低(P<0.01)。各组细胞PLK1的蛋白水平变化趋势与PLK1mRNA表达相似。相应地,对照组、空载体转染48h组、shRNA重组质粒转染24,48h组的凋亡率分别为(8.3±0.6)%、(8.7±0.7)%、(49.7±3.8)%和(82.3±6.9)%,后两者与前两组之间差异有统计学意义(P<0.05)。此外,与对照组和空载体转染组相比,shRNA重组质粒转染组的细胞增殖能力明显下降(P<0.05),且位于G2/M期的细胞较对照组和空载体转染组显著增加。以上结果均于转染后48h时较明显(P<0.05)。结论构建的shRNA能明显抑制转染细胞PLK1的表达和增殖,并可促进转染细胞的凋亡,并使停留于G2/M期的细胞显著增加。     

细胞周期蛋白E2反义脱氧寡核苷酸对K562细胞增殖及凋亡的调控作用

目的 研究细胞周期蛋白E2 (cyclin E2)反义脱氧寡核苷酸(ASON)对人红白血病细胞K562增殖的调控作用.方法 采用反义技术合成ASON并与K562细胞共培养.用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测转染ASON和脂质体lipofectamineTM 2000后的细胞活力,逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测转染细胞cyclin E2 mRNA表达水平及流式细胞术和形态学观察检测细胞凋亡.结果 Cyclin E2特异的ASON能显著地抑制cyclin E2mRNA水平的表达(F=26.442,P＜0.01);白血病细胞的生长明显受抑制(P＜0.01),细胞凋亡明显增加.结果 表明反义脱氧寡核苷酸能有效地抑制K562细胞的增殖,抑制K562细胞cyclin E2 mRNA表达上调,并显著地诱导细胞凋亡.结论 脂质体转染cyclin E2的反义寡核苷酸能够有效地抑制K562细胞cyclin E2 mRNA的表达,同时对白血病细胞K562的生长有明显的抑制作用,并可诱导K562细胞凋亡.提示cyclin E2在细胞周期调控中起作用,cyclinE2基因有望作为反义技术治疗急性白血病中的一个较有意义的新靶点.     

抗血管内皮生长因子发夹状核酶基因抑制白血病细胞裸鼠体内生长和肿瘤内血管生成

目的探讨抗血管内皮生长因子(VEGF)发夹状核酶基因对白血病细胞裸鼠体内生长和肿瘤内血管生成的影响。方法采用脂质体介导的方法将抗 VEGF 发夹状核酶基因真核表达载体pcDNA-RZ 转染白血病细胞系 K562,G418抗性筛选获得阳性克隆;抽提基因组 DNA,用 PCR 方法验证核酶基因已转入 K562细胞;荧光定量 PCR 和免疫印迹反应检测白血病细胞中 VEGF mRNA 和蛋白表达量的改变;将白血病细胞皮下接种 BALB/c 裸鼠,观察转染细胞在裸鼠体内成瘤及生长情况;组织形态学和免疫组织化学法检测裸鼠移植瘤微血管密度(MVD)。结果抗 VEGF 发夹状核酶基因真核表达载体 pcDNA-RZ 转入白血病细胞系 K562(K562/RZ),G418筛选两周获得阳性克隆,PCR 检测证实核酶基因整合入白血病细胞基因组 DNA;与 K562及 K562/PC 细胞(转染空质粒的 K562细胞)相比,K562/RZ 细胞 VEGF mRNA 和蛋白的表达量明显降低。接种 K562、K562/PC 和 K562/RZ 细胞组小鼠肿瘤终体积分别为(3.21±0.89)cm~3,(3.42±1.01)cm~3,(1.71±0.94)cm~3;肿瘤重量分别为(4.43±0.87)g,(3.96±0.94)g,(2.24±0.56)g;瘤体内 MVD 分别为4.70±1.25,4.67±1.31和1.80±1.55。以上各组之间的差异均有统计学意义(P<0.01)。结论转导抗 VEGF 发夹状核酶基因能减少白血病细胞中 VEGF 的合成,细胞裸鼠致瘤能力明显减弱,瘤体内血管形成能力降低。     

Bcl-2反义寡核苷酸增强K562细胞对依托泊苷化疗敏感性的研究

目的探讨Bcl-2反义寡核苷酸能否增强K562细胞对依托泊苷的化疗敏感性。方法采用人工方法合成Bcl-2寡核苷酸,通过脂质体将Bcl-2不同寡核苷酸导入K562细胞中(正义寡核苷酸组、无义寡核苷酸组、反义寡核苷酸组),另设未经转染空白对照组,检测Bcl-2蛋白的表达和细胞凋亡率。采用不同浓度的依托泊苷作用于4组细胞,用MTT法测定细胞存活分数。结果空白对照组和正义、无义寡核苷酸组的K562细胞Bcl-2蛋白与Bcl-2蛋白条带相符,反义寡核苷酸组在相应位置未见蛋白条带,且凋亡率显著高于其他3组(P<0.01)。细胞与依托泊苷作用后,反义寡核苷酸组细胞在各个浓度的存活分数均低于其他3组(P<0.05)。结论 Bcl-2反义寡核苷酸能有效封闭Bcl-2基因表达,增加K562细胞的凋亡,增强依托泊苷的敏感性。     

核糖体蛋白L6对K562/AO2细胞耐药性及凋亡的影响

本研究观察核糖体蛋白L6(RPL6)基因表达的改变对白血病细胞耐药性的作用及其可能的机制.通过RT-PCR方法获得RPL6cDNA序列,用真核表达载体pcDNA3.1(+)分别构建正向插入和反向插入的RPL6 cDNA重组质粒.以脂质体将正义RPL6 cDNA真核表达质粒转染K562细胞,将反义RPL6 cDNA真核表达质粒转染K562/AO2细胞.以MTT、流式细胞术和荧光分光光度计观察RPL6对化疗药物耐药性、凋亡和caspase-3的作用.结果表明转染正义RPL6cDNA真核表达质粒后,K562细胞对阿霉素的耐药性增强到原来的325%,凋亡和caspase-3活性明显降低(P＜0.005);转染反义RPL6 cDNA真核表达质粒后,K562/AO2细胞对阿霉素的耐药性降低原来的38%;凋亡和caspase-3活性明显增加(P＜0.005).结论RPL6基因过表达通过改变药物诱导的凋亡在K562/A02细胞耐药性的形成中起重要作用.     

全反式维甲酸诱导白血病细胞分化对brd7基因表达的影响

为了探讨brd7基因与白血病细胞分化的关系及其在白血病细胞分化中的作用,本研究采用全反式维甲酸(ATRA)诱导HL-60和K562细胞系分化,通过Wright-Giema染色在显微镜下观察细胞形态学变化,应用流式细胞术分析细胞分化抗原CD11b的表达,以鉴定细胞分化程度,并在此基础上通过Western blot检测brd7基因在诱导分化前和细胞分化过程中蛋白表达水平的变化。结果发现,ATRA具有抑制HL-60细胞生长的作用,并可诱导HL-60细胞向粒系分化,在ATRA诱导细胞分化过程中HL-60细胞表面CD11b的表达水平逐渐上调,BRD7蛋白表达随着HL-60细胞的分化而增加;ATRA对K562细胞无诱导分化作用,brd7的表达也无明显变化。结论:随着HL-60细胞的分化,brd7基因表达上调,其机制有待进一步阐明。     

SCL基因反义寡核苷酸对K562和CEM细胞系的作用

干细胞白血病(SCL)基因是新发现的与白血病发生有关的癌基因。为进一步探讨SCL反义寡核苷酸对白血病细胞的作用，本研究应用SCL基因的反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸(AS—PS—ODN)分别与K562和CEM白血病细胞系作用，观察细胞生长、分化、凋亡和SCL　mRNA变化。结果显示：(1)AS—PS—ODN对K562和CEM细胞的生长有不同程度的抑制作用，并呈量效和时效关系；(2)AS—PS—ODN作用后K562细胞联苯胺染色阳性率明显增加；(3)AS—PS—ODN作用后K562细胞发生凋亡现象，但未观察到CEM细胞凋亡；(4)AS—PS—ODN作用后K562细胞和CEM细胞SCL　mRNA表达水平减低，同时CEM细胞SIL－SCL　mRNA表达水平也减低。结论：AS—PS—ODN能特异性抑制K562和CEM细胞的增殖，减低SCL　mRNA和SIL—SCL　mRNA表达水平，同时促进红系分化，诱导K562细胞过早凋亡。     

三七皂苷对人骨髓造血细胞凋亡相关蛋白表达的影响

本文研究观察三七皂苷（PNS）对造血细胞促进凋亡相关蛋白（Daxx、Fas）和抑制凋亡的核转录因子（NFkB、c-Rel）表达的影响，探讨PNS促进造血细胞增殖，支持生长存活的作用机制。采用半固体集落培养法观察PNS对人骨髓红系、粒系祖造血细胞（CFU-GM、CFU-E）的增殖作用，台盼蓝拒染法观察细胞的存活率，涂片染色法观察细胞形态学的变化，用流式细胞术分析细胞凋亡状况。同时，用PNS处理粒系HL-60、红系KS62、巨核系CHRF-288和Meg-01 4种细胞株后，提取胞浆蛋白和核蛋白，Western免疫印迹观察Daxx、Fas、NFkB和c-Rel蛋白的表达水平。结果发现：①PNS能够刺激人骨髓红系、粒系祖细胞和HL-60等4种细胞株增殖。②HL-60等4种株细胞经PNS和饥饿处理后，活性良好，镜下未观察到凋亡的形态学特征；Annexin V分析也未见凋亡的阳性细胞。③Western blot结果显示，经PNS处理的4株细胞Daxx蛋白表达水平与对照相比，下降幅度分别为33．3％-61．5％；HL-60细胞本身表达Fas蛋白低下，PNS处理后也无明显下降，而K562、CHRF-288和Meg-01细胞Fas蛋白表达与对照相比，下降幅度分别为33．3％-71．4％。④NFkB、C-Rel蛋白除HL-60细胞对PNS诱导无明显变化外。其余细胞均出现不同程度地增加，分别提高了2．0-2.7倍和1．5-2．3倍。结论：PNS在某种程度上能够抑制Daxx、Fas蛋白表达，而相应减少造血细胞的凋亡，同时也能通过上调NFkB、C-Rel转录因子，促进细胞增殖，并阻止半胱天冬酶（caspase）连锁链的活化而抑制造血细胞凋亡，这为PNS应用于临床治疗凋亡过度的疾病如再生障碍性贫血提供了可能性。     

β-catenin特异的shRNA干扰对K562细胞作用的初步研究

本研究在探讨β-联蛋白（β-catenin）序列特异的小发夹RNA（shRNA）干扰其表达后对K562细胞生长的影响。采用脂质体介导方法，将含编码β-联蛋白特异的shRNA的质粒转入K562细胞，经G418筛选提高细胞阳性率，用实时定量PCR和Western blot分别检测干扰后β-联蛋白转录水平及蛋白水平的表达变化，通过绘制生长曲线、MTT测定及集落培养等方法观察干扰后细胞生长能力的差别。结果发现：与对照组相比，转染后72小时干扰质粒可有效降低K562细胞β-联蛋白mRNA水平的表达（p〈0．05），但短期培养对蛋白水平的表达未发现明显影响。经G418长期筛选后，对照组可见细胞阳性率逐渐提高，并可筛选到几近100％阳性的细胞克隆，而干扰组细胞则逐渐死亡。在G418存在下，干扰组与对照组K562细胞短期增殖曲线及MTT结果显示两组间无明显差异，但集落培养发现，干扰组细胞无论集落形成率（P〈0．001）还是形成的集落大小均明显低于对照组，说明干扰质粒可影响细胞的集落形成能力。结论：β-联蛋白特异的shRNA干扰可以有效降低K562细胞中β-catenin基因的表达，降低细胞集落形成能力；K562细胞的生长依赖于β-联蛋白的存在，针对β-联蛋白的RNAi治疗或其它靶向治疗可能对CML治疗有效。     

细胞周期素A的特异反义脱氧寡核苷酸对K562细胞增殖的调控作用

目的　探讨细胞周期素A(CyclinA)的特异反义脱氧寡核苷酸 (ASON)对K5 6 2细胞增殖的调控作用。方法　采用反义技术将CyclinA特异的ASON与K5 6 2细胞共培养后 ,用台盼蓝拒染法绘制生长曲线、并做CFU K5 6 2克隆培养 ,流式细胞术进行A蛋白检测。结果　CyclinA特异的ASON组与正义脱氧寡核苷酸 (SON)组及空白对照组相比 ,能特异地抑制CyclinA蛋白水平的表达 (P <0 .0 1) ;而且当ASON的浓度达到一定程度时 ,K5 6 2细胞的增殖及集落形成率均明显受抑制 (P <0 .0 1)。结论　ASON能特异封闭CyclinA蛋白水平 ,并能抑制K5 6 2细胞的增殖 ,但有明显的浓度依赖性。