人EGFL7基因RNA干扰慢病毒载体的构建及其在人喉癌细胞中的表达

 目的：构建人表皮生长因子样结构域7（epidermal growth factor-like domain 7, EGFL7）基因RNA干扰（RNA interference, RNAi）慢病毒表达载体,并建立稳定干扰EGFL7基因表达的喉癌细胞亚系,为研究EGFL7蛋白在喉癌发生发展中的功能奠定基础。方法：针对人EGFL7基因序列,设计特异性RNAi靶序列,与pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR线性载体定向连接,得到的阳性重组子再与pLenti6.3-MCS/V5-DEST慢病毒载体进行重组,获得真核表达慢病毒干扰载体。在POLOdelivererTM 3000介导下将慢病毒包装质粒和EGFL7基因重组慢病毒载体导入293T细胞包装病毒,测定病毒滴度,感染人喉癌细胞HEp-2,杀稻瘟菌素筛选获得稳定干扰EGFL7基因的细胞亚系。结果：成功构建EGFL7 pLenti6.3-EGFL7-miR真核表达慢病毒干扰载体并获得相应慢病毒,经测定病毒滴度为5×1011 TU/L,实时荧光定量PCR证实pLenti6.3-EGFL7-miR慢病毒载体对喉癌细胞HEp-2 EGFL7基因的沉默效率为97%。结论：成功构建人EGFL7基因特异性的慢病毒干扰载体,并获得EGFL7基因稳定干扰的喉癌细胞亚系。     

人CDK2基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的： 构建人细胞周期素依赖蛋白激酶2(CDK2)基因RNA干扰慢病毒载体。〖HJ1.8mm〗方法: 利用Invitrogen公司在线软件设计人CDK2（NM001798）shRNA序列，退火形成ds oligo后克隆到pENTRTM/U6载体的黏性末端，测序，再与慢病毒载体重组，测序鉴定，在脂质体的介导下将慢病毒的包装混合物和CDK2基因重组慢病毒载体转染293FT细胞，包装成病毒后，收集细胞培养上清液，测定病毒滴度。结果: 测序证实pENTRTM/U6- CDK2-shRNA为阳性克隆，与慢病毒载体重组后测序结果显示也为阳性克隆，CDK2基因重组慢病毒载体传染293FT细胞后48 h, 细胞培养上清液，病毒的滴度为6×108TU/L。结论: 成功构建人CDK2基因RNAi慢病毒载体，为研究CDK2在自身免疫病中的应用提供了稳定的转染细胞载体。     

呼吸道合胞病毒G蛋白基因重组质粒诱导小鼠免疫保护性及机制研究

目的 构建编码呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白基因的重组质粒,观察其对RSV感染小鼠的保护性及特异性免疫效应,为研制安全有效的RSV新疫苗提供线索和实验依据.方法 利用基因重组方法构建含RSV G蛋白编码基因的重组质粒,测序和酶切鉴定,Western blot检测目的 基因经体外表达后的免疫原性.重组质粒免疫小鼠后以RSV感染,病毒滴定法检测肺组织标本中RSV滴度,HE染色法检查肺组织病理改变,ELISA检测血清抗体水平,双抗体夹心ELISA测定肺泡灌洗液(BALF)内Th1/Th2细胞因子表达量,流式细胞术检测BALF中T淋巴细胞亚群数量及活化状态.结果 成功构建了编码RSV G蛋白基因的重组质粒pcDNA3.1~G.Western blot证实目的 蛋白在体外具有免疫原性.被免疫小鼠感染RSV后肺组织病毒滴度降低,肺组织中未见明显的炎性细胞浸润.小鼠血清中产生较高滴度的抗RSV-G IgG.小鼠BALF细胞中CD4~+CD25~+T淋巴细胞比例显著增加,并且IFN-γ(Th1)、IL-4(Th2)两类细胞因子表达显示平衡.结论 编码RSV G蛋白基因的重组质粒pcDNA3.1~G能诱导产生CD4~+ CD25~+T细胞亚群,对小鼠具有明显的保护作用.     

靶向MAG基因shRNA慢病毒载体的构建及其对MAG基因表达的沉默

 目的：设计以MAG基因为靶点的短发夹状RNA（shRNA）,构建重组慢病毒载体并鉴定此RNA干扰体系对MAG基因表达的影响。方法：将3条靶向大鼠MAG基因的shRNA片段插入至慢病毒载体pWPI,与pCDNA3-MAG-FLAG质粒用Lipofectamine　2000共转染293T细胞,Western blotting法鉴定出最有效的shRNA。此重组质粒与pAX2和pMD2G经293T细胞包装后,产生的重组慢病毒感染少突胶质细胞,48 h后Western blotting法检测MAG蛋白的表达情况。结果：经双酶切后测序鉴定,构建了MAG shRNA慢病毒载体pWPI-MAG,鉴定出shRNA-2为最为有效的shRNA。重组慢病毒能明显抑制少突胶质细胞中MAG的表达。结论：慢病毒介导的shRNA干扰技术可特异性阻断MAG的表达,为进一步探讨MAG特异性shRNA治疗神经系统髓鞘损伤奠定了基础。     

mTOR shRNA慢病毒载体的构建及包装

目的:构建mTORshRNA慢病毒表达载体,为探讨RNA干扰技术抑制T细胞mTOR基因的相关研究奠定基础.方法:设计合成针对小鼠mTOR基因的shRNA片段,与酶切后的pLKD.UBC.GFP.U6载体片段进行连接并转化DH5α,提取阳性克隆质粒,测序,转染293T细胞.通过GFP表达水平测定病毒滴度.结果:DNA测序结果及PCR鉴定证实成功构建小鼠mTOR-shRNA重组慢病毒载体,对其进行包装后测定慢病毒滴度为1.38E+ 08 TU/ml.结论:成功构建并包装小鼠mTOR-shRNA重组慢病毒表达载体.     

人巨细胞病毒基因活性与受染细胞病变的相关性研究

目的： 探讨人巨细胞病毒（HCMV）感染后病毒基因表达活性与细胞病变的关系。方法: 不同滴度HCMV感染传代培养的人胚肺成纤维细胞，以3个浓度接种HCMV AD169毒株稀释液：10^-5(A组)、10^-3(B组)、10^-1(C组)，建立HCMV梯度感染细胞模型，分别应用FQ-PCR法测定感染细胞内HCMV基因拷贝数、RT-PCR法测定MCP mRNA转录水平，同时光镜观察致细胞病变作用（CPE）、电镜检查细胞超微结构改变。结果: HCMV感染后，HCMV DNA在病毒滴度最低的A组细胞内负荷量最低（P<0.05，P<0.01），复制速度也最慢；仅在病毒滴度较高的B、C组内检出MCP mRNA，水平持续升高。A组未发现细胞病变，B、C组细胞检测到随感染时间延长而加重的CPE及超微结构改变。结论: HCMV感染细胞内病毒基因高负荷及MCP mRNA转录与细胞病变进展密切相关。     

质粒介导的RNAi技术对截短HCMV IE2基因表达的抑制作用

目的 应用质粒介导的RNA干扰技术研究siRNA抑制截短HCMV IE2基因的表达的作用。方法 以pLL3．7质粒为模板，采用半套式PCR的方法扩增出含U6启动子的siRNA表达片段，连接pMD-T simple vector构建效应质粒表达重组体pMD-T-shRNARI和pMD-T-shRNAR2。同时采用RT-PCR方法从HCMV AD169株基因组中调取目的截短基因IE2，定向克隆到带有绿色荧光蛋白（GFP）作为报告基因的真核表达载体pEGFP-C1上，构建HCMVAD169株截短IE2基因重组表达质粒pEGFP-C1-IE2；用脂质体共转染效应质粒和靶基因表达重组体至Hep-2细胞中，荧光显微镜下观察效应质粒的RNA干涉作用，并观察RNA干扰的时效和量效改变。结果 三组质粒重组体构建成功，克隆到的2个shRNA表达载体对截短IE2基因的表达都有干涉作用。在与靶基因质粒量比为1：1和1：2时，其中pMD-T-shRNAR1 48～72h间干涉效应为100％，可完全封闭IE2的表达；pMD-T-shRNAR2使IE2处于极低水平表达，48～72h间干涉效应达到98．4％～99％。结论 通过质粒介导的RNAi技术能够有效地抑制HCMVIE2基因的表达，为治疗HCMV感染的药物开发提供了思路。     

表达呼吸道合胞病毒F蛋白编码基因的重组腺病毒载体的构建

目的 构建表达呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)F蛋白编码基因片段的重组腺病毒.方法 以RSV RNA为模板,利用RT-PCR扩增出F基因片段,应用AdEasy腺病毒载体系统,构建含有目的 基因的蕈组穿梭质粒pShuttle-CMV/F,再转化含有骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183-AD-1获得重组腺病毒质粒pAdEasy/F.将该质粒转染293细胞包装产生出重组腺病毒rAd/F.重组腺病毒分别经电子显微镜技术、RT-PCR、Western blot和间接免疫荧光方法进行鉴定.并对该重组腺病毒的滴度和遗传稳定性进行了初步研究.结果 获得了含有RSV F基因片段的重组腺病毒rAd/F,电子显微镜下可见典型腺病毒颗粒形态,RT-PCR、Western blot和间接免疫荧光方法分析显示rAd/F中的F基因片段可以在293细胞中有效转录和表达.结论 成功构建出含有RSV F基因片段的苇组腺病毒rAd/F,为进一步研究重组腺病毒载体疫苗奠定了基础.     

PPARγ激动剂抗呼吸道合胞病毒感染作用的体外研究

目的 探讨过氧化物酶体增殖物活化受体γ（PPARγ）激动剂的体外抗呼吸道合胞病毒（RSv）感染作用.方法 以细胞存活率和病毒抑制率为指标,应用细胞病变效应（CPE）法,观察不同浓度PPARγ激动剂对人肺腺癌（A549）细胞的CPE及RSV感染后CPE的抑制作用.采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测PPARγ激动剂对A549细胞的毒性作用和RSV感染后细胞存活率和病毒抑制率的影响.结果 5～25μ mol/L15-脱氧前列腺素J2（ 15 d-PGJ2）和10～50μmol/L罗格列酮干预的A549细胞未显示明显CPE,MTT比色法也显示以上浓度范围15 d-PCJ2和罗格列酮的A值明显高于RSV感染组（P＜0.01）,但两种药物相比差异无统计学意义.15d-PGJ2和罗格列酮最适浓度分别为5μmol/L和10 μmol/L.结论 PPARγ激动剂既可减轻RSV感染后A549细胞的CPE,又可提高细胞存活率,具有体外抗RSV感染作用.     

bcl-xL短发夹状RNA重组真核表达质粒对几种细胞增殖的影响

目的：以自行构建的真核表达质粒pmU6为基 础，针对bcl-xL基因构建在细胞内表达短发夹状RNA（shRNA）的质粒载体，并观察它们 对CN E-2Z、MCF-7和ECV-304细胞株增殖的影响。方法：将两条合成的bcl-xL 寡核苷酸链插入pmU6载体中产生pmU6-RNAi重组质粒，把重组质粒转染到细胞中，MTT比色法 检测细胞的生长抑制率。结果：bcl-xL shRNA 对CNE-2Z细胞株的生 长增 殖有明显的抑制作用，而对MCF-7和ECV-304细胞株的生长增殖无明显抑制作用。结 论：提示pmU6-RNAi重组体能在细胞内表达短发夹状RNA，产生了RNA干扰效应并抑 制靶细胞的生长增殖。     

ANX A2在抗磷脂抗体诱导THP-1细胞组织因子表达中的作用

目的： 构建针对人膜联蛋白A2（ANX A2）的RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体,转染THP-1细胞,探讨ANX A2在抗磷脂抗体（APL）诱导单核细胞组织因子（TF）表达中的作用。方法：设计4条ANX A2特异性RNAi的寡核苷酸序列,与慢病毒载体pGCSIL-GFP连接,PCR及测序鉴定正确后,Western蛋白印迹法筛选出有效干扰序列。包装293T细胞获得重组慢病毒LV-RNAi-ANX A2,感染单核细胞株THP-1,观察细胞ANX A2 mRNA和蛋白表达下降程度。再用APL/β2GPI复合物刺激干扰后的THP-1细胞,观察TF mRNA表达及TF活性变化。结果：成功构建RNAi慢病毒载体并筛选出有效干扰片段;包装293T细胞后病毒滴度为3×1012TU/L;感染THP-1后细胞ANX A2 mRNA和蛋白均被沉默。APL/β2GPI复合物刺激干扰后的THP-1细胞,其TF表达下降至基础水平。结论：构建的慢病毒表达载体能显著抑制THP-1细胞ANX A2的表达,进而影响APL诱导的TF表达,证明ANX A2在APL诱导的单核细胞表达TF过程中具有重要作用。     

RNA干扰人端粒酶逆转录酶基因抑制Hep-2细胞生长增殖的实验研究

目的探讨RNA干扰人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因对Hep-2细胞生长增殖的抑制作用及诱导凋亡作用。方法根据hTERTcDNA序列构建表达hTERTmRNA特异的、含荧光素基因的shRNA真核表达质粒pshRNA1、pshRNA2。随机选取一段与人类基因无同源性的碱基序列构建表达shRNA的含荧光素基因的质粒pshRNA3。构建不表达shRNA的含荧光素基因的对照质粒pshRNA4。实验分为5组:A(pshRNA1)、B(pshRNA2)、C(pshRNA3)、D(pshRNA4)、E(空白培养液)。酶切后电泳分析鉴定质粒pshRNA1~3。采用共聚焦显微镜检测质粒转染后细胞荧光表达情况;以蛋白印迹法研究hTERT表达变化;以TRAP-PCR ELISA法研究端粒酶活性变化;以四甲基偶氮唑盐(MTT)法、倒置相差显微镜及原位细胞凋亡法观察各质粒抑制细胞增殖及诱导凋亡作用。结果(1)质粒pshRNA1~3SalⅠ酶切后电泳见400bp小带,与预期插入的目的基因大小一致。共聚焦显微镜下见大量的细胞表达绿色荧光。(2)pshRNA1、2转染细胞后hTERT表达显著降低;细胞端粒酶活性明显受到抑制,A组细胞活性为:0·159±0·039、B组细胞活性为0·163±0·028、E组细胞活性为1·512±0·076。A、B组与E组比较,差异均有统计学意义(P<0·01)。(3)与E组细胞吸光度(A)值比较,A、B组细胞各时间点均减小,P值均小于0·01。同等培养条件下,A、B组脱落瓶壁的死亡细胞显著增多,凋亡率明显升高。结论(1)靶向hTERTmRNA的shRNA真核表达质粒能有效转染Hep-2细胞;(2)RNA干扰hTERT能显著地抑制Hep-2细胞的生长增殖并诱导细胞凋亡。     

大鼠β防御素2基因RNAi慢病毒载体的构建及效应测定

目的 构建大鼠β防御素2(rBD2)基因RNAi慢病毒重组载体,转染培养细胞,检测其沉默效应,筛选出最佳的RNAi慢病毒载体.方法 序列软件设计3条针对rBD2基因CDS区的siRNA序列,合成单链后退火形成双链DNA,分别与酶切处理的慢病毒载体lentivirus连接构成3个RNAi慢病毒重组载体,再转化细菌,测序鉴定.脂质体法转染细胞,荧光实时定量PCR(RT-PCR)及Western免疫印迹测rBD-2 mRNA及蛋白表达,筛选沉默效果最佳的为LV-shrBD2载体.用慢病毒包装系统对LV-shrBD2进行慢病毒颗粒包装并梯度稀释法测定病毒滴度.结果 凝胶电泳显示3个RNAi慢病毒重组载体的PCR产物为316 bp,测序结果表明序列正确.转染细胞后RT-PCR及Western免疫印迹检测,siRNA序列1构建的重组载体mRNA抑制率达82%,干扰效率最高,为所需的rBD2基因RNAi慢病毒载体LV-shrBD2.包装慢病毒颗粒并调整病毒滴度至1×105ifu/μl.结论 成功构建并筛选出沉默效应最佳的rBD2基因RNAi慢病毒表达载体LV-sh1rBD2,为进一步开展rBD2研究提供了依据.     

siRNA干扰人BMP9重组腺病毒载体的构建及其促进乳腺癌SK-BR-3细胞增殖

 目的 筛选特异性干扰人BMP9基因的siRNA序列并制备重组腺病毒AdsiBMP9,探讨RNAi人BMP9基因后对乳腺癌SK-BR-3细胞增殖能力的影响。方法 设计制备3对干扰人BMP9的双链DNA序列,亚克隆至Pses-Hus质粒中获得Pses-Hus-siBMP9质粒,脂质体转染乳腺上皮细胞HBL-100筛选有效干扰质粒,构建重组腺病毒并感染SK-BR-3细胞,RT-PCR,Western blot 检测BMP9表达,MTT检测细胞增殖能力。 结果 成功构建并筛选出针对人BMP9基因的有效干扰质粒并包装成腺病毒,病毒滴度为1×1010IU/mL,感染SK-BR-3细胞显示BMP9在转录水平和翻译水平表达量显著低于对照组和空白组(P<0.05),第5天AdsiBMP9组细胞的增殖率显著高于AdsiNC组（P<0.05）。结论 成功构建特异性沉默人BMP9基因的siRNA腺病毒载体,可有效抑制SK-BR-3细胞中BMP9基因的表达从而促进该细胞增殖。     

大鼠CD86基因RNAi慢病毒载体的构建与功能鉴定

目的 构建大鼠CD86基因的RNAi慢病毒载体并在大鼠原代培养树突状细胞(DC)上鉴定其基因沉默效率.方法 将筛选获得的大鼠CD86基因特异性siRNA靶点,合成短发卡结构shRNA序列并退火成双链DNA,与pgC-GFP慢病毒载体重组形成shRNA表达载体,利用PCR和测序鉴定获得连接正确的克隆.经由293T细胞包装shRNA慢病毒颗粒,随后将其感染原代培养的大鼠Dc细胞,采用real-time PCR和Western blot的方法检测靶基因在mRNA和蛋白水平的沉默效率.结果 构建的慢病毒载体shRNA的PcR鉴定和测序正确,shRNA慢病毒颗粒感染大鼠DC细胞后CD86基因的mRNA表达量较阴性对照载体慢病毒感染组下降了90.6%;蛋白表达显著抑制.结论 成功构建了大鼠CD86基因的shRNA慢病毒表达载体,能够在大鼠DC细胞上有效沉默靶基因.     

反义硫代修饰寡核苷酸体外抗甲型流感病毒感染的效应研究

目的 在感染甲型流感病毒(influenza A virus,IFAV)的人气道上皮细胞(9HTEO)中观察与IFAV PB1、M2、NS、PB2、HA基因瓦补的反义硫代修饰寡核苷酸(ASODN)的抗病毒活性.方法 细胞外体系观察没计的ASODN效率,筛选对IFAV有效的3个ASODN进行9HTEO的抗病毒效应.倒置显微镜下观察IFAV的敛细胞病变作用和ASODN的细胞保护作用.MTT方法测细胞存活率,空斑试验、RT-PCR、Westem blot、免疫荧光检测ASODN特异性抗病毒效应,MTT法检测ASODN对细胞的保护作用.结果 IFAV感染复数(MOI)在0.1以上时,培养5 d后IFAV感染的9HTEO细胞全部死亡.设计的ASODN能够提高感染细胞的存活率,且呈量效依赖关系.空斑试验、RT-PCR、Western blot、免疫荧光试验证实在细胞水平、基因转录水平、蛋白水平针对IFAV PB1、M2、NS基因mRNA转录起始点保守序列没计的ASODN具有特异性抗IFAV作用.结论 ASODN具有较明显的抗病毒活性,为进一步研究和开发新型抗IFAV药物提供了实验依据.为高致病性禽流感(H5N1)的基因治疗提供了新的思路和理论依据.     

重组慢病毒表达载体介导HIV-1 Vpr蛋白调控KSHV潜伏感染的初探

目的 利用慢病毒载体系统包装含人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)病毒蛋白R(Vpr)的重组慢病毒,使之感染原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞BCBL-1,并检测Vpr蛋白对细胞中卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)潜伏感染与裂解性复制的影响.方法 从实验室先前构建的重组真核表达质粒pCI-neo-Vpr中扩增出Vpr基因,插入到pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen载体中构建成重组慢病毒质粒pHAGE-Vpr,利用脂质体将其与包装质粒psPAX2及包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞,荧光显微镜观察293T细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达,293T细胞培养上清经0.45 μm滤器过滤后即获得重组病毒悬液.慢病毒系列稀释后感染293T细胞,荧光计数法测定病毒滴度,逆转录PCR(RT-PCR)检测Vpr基因在293T细胞中的转录.以感染复数(MOI)为1的病毒量感染靶细胞BCBL-1,荧光显微镜观察靶细胞中GFP的表达,并利用RT-PCR和和免疫印迹(Western blot)技术分别检测Vpr基因在靶细胞中的转录和表达情况,同时检测KSHV裂解期基因复制与转录激活子(Rta)mRNA转录及蛋白表达.结果 经酶切鉴定、核酸序列测定和293T细胞中GFP表达证实成功包装了携带HIV-1Vpr基因的重组慢病毒,滴度为4×107TU/ml.重组慢病毒感染BCBL-1细胞后,细胞中有GFP表达,RT-PCR和Western blot均能够在相应位置检测到目的 基因Vpr的条带,并且Vpr降低了KSHV RtamRNA转录及蛋白表达水平.结论 重组慢病毒介导的HIV-1 Vpr蛋白过表达能够抑制KSHV裂解性复制、增强病毒的潜伏感染.