快速心房起搏对家兔心房肌L型钙离子通道的影响及氯沙坦干预的研究

目的 探讨以人工心脏起搏的方法制备家兔急性心房纤颤(atrial fibrillation,AF)模型时心房发生电重构的机制和干预方法.方法 家兔45只随机分为生理盐水(NS)组、生理盐水起搏(NSP)组、氯沙坦起搏(LP)组.观测每组基础状态、快速心房起搏时心房有效不应期(AERP)及心房肌L-型钙通道的电流密度(ICa-L),并进行统计学处理.结果 [1]快速起搏时NSP组较NS组各个基础周长下的AERP均显著下降(P＜0.01);NSP组快速起搏6小时和8小时与NS组AERP的差距随着基础周长的下降而减少.[2]而快速起搏8小时后LP组AERP的下降较NSP组显著减轻(P＜0.01);LP组快速起搏后与NS组AERP的差距随着基础周长的下降未见减少趋势.[3]NSP组较NS组心房肌ICa-L降低;LP组较NS组和NSP组心房肌ICa-L差异无统计学意义(P＞0.05);而LP组较NSP组心房肌ICa-L的标准差显著降低(P＜0.05).结论 快速心房起搏可引起AERP缩短及AERP频率适应性不良为特征的心房肌电重构.氯沙坦可以抑制这种电重构及心房肌ICa-L离散度增加,从而降低AF的发生.     

体外诱导心肌样细胞中HCN4过表达对起搏电流特性的影响

目的体外构建具有表达功能性的起搏心肌样细胞,并检测起搏心肌样细胞中起搏电流的特性。方法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌样细胞。构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体(rAd/GFP/HCN4)和绿色荧光蛋白的腺病毒载体(rAd/GFP),转染至心肌样细胞分为rAd/GFP/HCN4组和rAd/GFP组,不做任何处理作为对照组。Western blot检测各组HCN4蛋白表达,全细胞膜片钳技术记录各组中起搏电流情况。结果荧光显微镜观察到长梭形心肌样细胞,PCR鉴定重组腺病毒载体rAd/GFP/HCN4和rAd/GFP构建成功;rAd/GFP/HCN4组HCN4蛋白相对表达量(1.31±0.02)高于rAd/GFP组(0.55±0.02)和对照组(0.52±0.03)(P0.05),rAd/GFP组与对照组比较差异无统计学意义(P0.05);膜片钳实验在转基因细胞中检测到起搏电流,而rAd/GFP组和对照组中未检测到起搏电流。结论 rAd/GFP/HCN4转染到心肌样细胞中,心肌样细胞中HCN4蛋白表达增加且可检测到起搏电流,从而使心肌样细胞具有自主搏动,为体外构建生物起搏器提供研究基础。     

胺碘酮对心房颤动犬心房结构及基质金属蛋白酶-9表达的影响

目的 观察Ⅲ类抗心律失常药物乙胺碘呋酮(胺碘酮)对长期心房快速起搏诱发心房颤动(房颤)犬心房结构及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达的影响,探寻胺碘酮对房颤犬心房结构重构的作用机制.方法 20只犬随机分为假手术组(n=6)、对照组(n=7)和胺碘酮组(n=7).对照组和胺碘酮组犬心房快速起搏6周(400次/min),建立房颤犬模型.胺碘酮组犬起搏后口服胺碘酮30 mg/(kg·d),直至起搏结束.超声评价各组犬起搏前后左心房、左心耳结构和功能;测定房颤诱发情况;Masson染色检测心房肌胶原容积分数(CVF);免疫组化法观察心房肌MMP-9蛋白表达情况.结果 胺碘酮能够有效防止心房快速起搏诱发房颤犬左心房、左心耳功能降低,使犬房颤诱发率和平均持续时间显著减少,降低房颤犬心房肌CVF值,有效抑制房颤犬心房肌MMP-9表达增加.结论 胺碘酮能够阻止长期心房快速起搏房颤犬心房结构的改变及心房纤维化,防止房颤犬心房结构重构,减少房颤发生.     

利用Langendorff灌流装置建立一种离体快速心房起搏模型

目的:为排除干预因素对其它脏器的影响,制作一种离体的快速心房起搏模型。方法:新西兰大耳白兔12只,随机分为对照组和起搏组(n=6)。开胸取出心脏后,置于Langendorff灌流装置上用台氏液持续灌流,起搏组在灌流的基础上同时给予500次/分的快速心房刺激。分别以400ms、300ms、200ms为起搏周期(S1)测定各组在灌流0h、1h后的心房有效不应期(AERP)。结果:与灌流前(0h)对比,灌流及起搏1h后,起搏组的AERP400、AERP300、AERP200均明显缩短,而单纯灌流组则差别不大;单纯灌流组的AERP400>AERP300>AERP200,而起搏/灌流组的AERP400、AERP300、AERP200三者间无显著差异。结论:起搏离体Langendorff灌流的心脏能够建立有效的快速心房起搏模型。     

心脏神经结丛消融联合低强度耳屏迷走神经刺激对犬房颤电生理特性的影响

目的研究心脏神经节丛消融联合低强度耳屏迷走神经刺激对阵发性犬心房颤动(简称房颤)电生理特性的影响,探讨低强度耳屏迷走神经刺激对房颤消融术后的治疗价值。方法 21条健康成年比格犬随机分为3组:RAP组(500次/min快速心房起搏,n=7)、ABL组(心脏神经节消融+500次/min快速心房起搏,n=7)、LL-ST组(心脏神经节消融+低强度右侧耳屏刺激+500次/min快速心房起搏,n=7)。其中,RAP组为单纯快速心房起搏,ABL组为右上神经节丛(ARGP)和左上神经节丛(LSGP)消融后快速心房起搏,LL-ST组为ARGP+LSGP消融后低强度刺激右侧耳屏迷走神经+快速心房起搏。于起搏前及起搏后2、4、6、8、10、12、14、16 h测定犬心房和肺静脉不同部位的房颤诱发率、房颤持续时间、有效不应期(ERP)及有效不应期离散度(dERP)。结果 (1)与RAP组相比,LL-ST组房颤诱发率显著降低,房颤持续时间显著减少,ERP显著延长,dERP显著降低,差异有统计学意义(P均<0.05)。(2)与ABL组相比,LL-ST组房颤诱发率显著降低,房颤持续时间显著减少,ERP显著延长,dERP显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论低强度右侧耳屏迷走神经刺激联合心脏神经节丛消融可以有效控制房颤消融术后的复发。     

瑞舒伐他汀对心肌梗死兔心房神经重构的影响

目的探讨瑞舒伐他汀对心肌梗死(MI)后心房神经重构的影响。方法开胸后结扎前降支制作兔MI模型,24 h后将存活兔分为心肌梗死组(MI,n=7)、药物干预组(Rt,n=8),并设假手术组(S,n=9)。瑞舒伐他汀药物干预8周后处死动物,观察心房自主神经分布改变,检测心房酪氨酸羟化酶(TH)mRNA表达水平。结果与假手术组比较,心肌梗死组TH与胆碱乙酰转移酶(CHAT)表达阳性神经纤维密度增加,TH mRNA相对表达量明显升高,且差异均有统计学意义(P<0.05);与心肌梗死组比较,药物干预组TH与CHAT阳性神经纤维密度减少,TH mRNA相对表达量减少,差异亦均有统计学意义(P<0.05)。结论瑞舒伐他汀对MI后心房神经重构具有抑制效应。     

慢性房颤犬心房肌肾素血管紧张素系统激活的影响及卡托普利的干预作用

目的探讨慢性房颤实验犬心房肌肾素血管紧张素系统(RAS)的影响及卡托普利的干预作用。方法健康杂种犬26只,随机分为三组：对照组(n=6),起搏组(n=11),治疗组(n=9)。起搏组和治疗组安置埋藏式高频率心脏起搏器(400次/min),快速起搏犬右心耳8周,治疗组于起搏前3 d至起搏后第8周每日口服卡托普利50 mg,每天两次。起搏8周后,两组分别处死动物,于左右心房、心耳及房间隔取材,测定心房组织血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)含量及心房肌细胞内Ca~(2 )浓度。对照组未安置起搏器,与起搏、治疗组同步行相应检查。结果起搏8周后,起搏组、治疗组和对照组测得心房组织AngⅡ含量分别为(29．83±5．73)pg/ml,(13．23±3．15)pg/ml,(11．38±2．14)pg/ml。与对照组比较,起搏组AngⅡ含量明显增高(P＜0．01),而治疗组与对照组比较,差异无显著性(P＞0．05)。三组测得心房肌细胞内Ca~(2 )浓度分别为(35．32±4．88)μg/mg,(25．44±4．19)μg/mg,(24．06±3．51)μg/mg。与对照组比较,起搏组明显升高(P＜0．01),而治疗组没有(P＞0．05)。结论长期快速起搏实验犬心房组织AngⅡ含量增高、心房肌细胞内钙超载。卡托普利可阻滞慢性房颤实验犬心房组织RAS激活,阻止细胞内钙超载,从而消除房颤形成的基质。     

慢性心力衰竭大鼠心功能与心肌肌浆网Ca^2＋-ATP酶基因转导的关系

目的：研究腺相关病毒为载体的心肌肌浆网Ca^2+-ATP酶(sarcoplasmic retlculum Cd^2+ ATPase，SERCA2a)基因转导能否改善慢性心力衰竭大鼠的心脏功能。方法：本实验选用SD大鼠100只，将100只大鼠按随机数字法分为2组：对照组20只和心力衰竭组80只。心力衰竭组大鼠行腹主动脉缩窄术，术后存活心力衰竭大鼠59只，按随机数字法分为：心力衰竭10d组9只，心力衰竭+绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)10d组10只，心力衰竭+肌浆网钙ATP酶(sarcoplasmic reticulum calcum-ATPase，SERCA2a)10d组10只；心力衰竭30d组10只，心力衰竭+EGFP30d组10只，心力衰竭+SERCA2a 30d组10只。这些心力衰竭大鼠均接受经腹心包腔内注射术。采用经腹心包腔内注射术分别将生理盐水、携带EGFP基因的重组腺相关病毒和携带SERCA2a基因重组腺相关病毒导人心力衰竭组、心力衰竭+EGFP组和心力衰竭+SERCA2a组大鼠心包腔内。基因导入后10d和30d比较各组的血流动力学指标。结果：心力衰竭+SERCA2a 10d组(n=10)大鼠基因转导后血流动力学指标明显优于心力衰竭10d组(n=9)(P&;lt;0．05)；但左室舒张末压和左室内压最大上升速率未达到对照10d组大鼠心功能水平(P&;lt;0．05)。SERCA2a基因转导30d心脏功能进一步改善(P&;lt;0．05)，血流动力学各项指标和对照组比较，差异无显著性意义(P&;gt;0．05)。在荧光显微镜下，心力衰竭+EGF、P组大鼠心肌冷冻切片见弥漫绿色荧光。结论：以腺相关病毒为载体，SERCA2a基因转导能够改善慢性心力衰竭大鼠的心脏收缩和舒张功能；经腹心包腔内注射法是一种简单、安全、绎济、有效的基因转导方法。     

慢性心力衰竭大鼠心功能与心肌肌浆网Ca2+-ATP酶基因转导的关系

目的研究腺相关病毒为载体的心肌肌浆网Ca2+-ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase,SERCA2a)基因转导能否改善慢性心力衰竭大鼠的心脏功能.方法本实验选用SD大鼠100只,将100只大鼠按随机数字法分为2组对照组20只和心力衰竭组80只.心力衰竭组大鼠行腹主动脉缩窄术,术后存活心力衰竭大鼠59只,按随机数字法分为心力衰竭10 d组9只,心力衰竭+绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)10 d组10只,心力衰竭+肌浆网钙ATP酶(sarcoplasmic reticulum calcum-ATPase,SERCA2a)10 d组10只;心力衰竭30d组10只,心力衰竭+EGFP 30 d组10只,心力衰竭+SERCA2a 30 d组10只.这些心力衰竭大鼠均接受经腹心包腔内注射术.采用经腹心包腔内注射术分别将生理盐水、携带EGFP基因的重组腺相关病毒和携带SERCA2a基因重组腺相关病毒导入心力衰竭组、心力衰竭+EGFP组和心力衰竭+SERCA2a组大鼠心包腔内.基因导入后10 d和30 d比较各组的血流动力学指标.结果心力衰竭+SERCA2a 10 d组(n=10)大鼠基因转导后血流动力学指标明显优于心力衰竭10 d组(n=9)(P<0.05);但左室舒张末压和左室内压最大上升速率未达到对照10 d组大鼠心功能水平(P<0.05).SERCA2a基因转导30 d心脏功能进一步改善(P<0.05),血流动力学各项指标和对照组比较,差异无显著性意义(P>0.05).在荧光显微镜下,心力衰竭+EGFP组大鼠心肌冷冻切片见弥漫绿色荧光.结论以腺相关病毒为载体,SERCA2a基因转导能够改善慢性心力衰竭大鼠的心脏收缩和舒张功能;经腹心包腔内注射法是一种简单、安全、经济、有效的基因转导方法.     

高甲状腺素对心房和肺静脉缝隙连接、电生理特性的影响

目的研究高甲状腺素对心房和肺静脉缝隙连接、电生理特性的影响。方法24只实验兔随机分为正常对照组和甲亢组。测定心房有效不应期(AERP),然后取心房、肺静脉组织,用Western blot和半定量逆转录聚合酶链反应法分别测定连接蛋白43(cx43)及连接蛋白40(Cx40)的蛋白表达和mRNA水平。结果甲亢组的AERP均明显短于对照组(P＜0．01),且AERP的频率适应性较对照组明显下降(P＜0．01)。甲亢组心房及肺静脉的Cx43蛋白和mRNA表达量较对照组明显增加,而Cx40的蛋白表达量低于对照组(P＜0．05)。心房及肺静脉的Cx40 mRNA表达量在两组之间差异无统计学意义。结论高甲状腺素可引起心房电生理重构和心房及肺静脉的缝隙连接重构。     

腺病毒介导的线粒体融合素基因-2诱导大鼠颈动脉球囊损伤后血管平滑肌细胞凋亡

目的研究腺病毒介导的线粒体融合素基因2(mitofusin2gene,Mfn2)对大鼠颈动脉球囊损伤后血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecells,VSMCs)凋亡的影响。方法建立大鼠颈动脉球囊损伤模型,用携带大鼠Mfn2基因(rMfn2)的重组腺病毒Adv rMfn2GFP和含有绿色荧光蛋白基因的对照腺病毒Adv GFP分别感染球囊损伤动脉段,以磷酸缓冲液(PBS)作为未感染对照组,假手术组作为正常对照组,采用免疫组织化学方法检测外源基因表达水平;末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)检测凋亡细胞;Image Pro图像分析系统进行血管定量组织形态学分析。结果病毒感染后5d,免疫组织化学证实Adv rMfn2GFP组Mfn2蛋白表达水平明显;TUNEL染色显示,Adv rMfn2GFP组的VSMCs凋亡率明显高于PBS组和Adv GFP组,假手术组未见TUNEL阳性VSMCs(n=10,P<0.01);感染后21d,Adv rMfn2GFP组的血管内膜面积及内膜中膜面积比明显低于对照组(n=10,P<0.01)。结论高表达Mfn2基因可诱导大鼠颈动脉球囊损伤后血管平滑肌细胞凋亡。     

炙甘草汤减缓兔右心房颤所致心肌纤维化作用

目的研究炙甘草汤逆转快速起搏兔右心房（RAP）诱导心房颤动（AF）致右心耳心肌心肌纤维化的作用。方法新西兰大白兔动物模型随机分为假手术组（A组）：植入电极不行快速起搏;起搏组（B组）：行短期快速起搏兔右心房12h致AF模型;炙甘草汤水煎液阴性方组（C组）：给予炙甘草汤阴性方水煎液灌胃2次/d,连续30d后行短期快速起搏兔右心房12h致AF模型;炙甘草汤组（D组）：给予炙甘草汤水煎液灌胃2次/d,连续30d后行短期快速起搏兔右心房12h致AF模型;每组实验动物各8只。建立房颤兔模型,行兔右心耳Masson染色和免疫组化方法检测基质金属蛋白酶-9（MMP-9）蛋白表达。检测右心耳组织场电位时程（fAPD）,并观察炙甘草汤对右心耳fAPD的作用。结果成功建立快速起搏右心房诱导房颤兔模型,Masson染色显示B组和C组心肌纤维化明显增加,D组心肌纤维化减弱。MMP-9结果显示,B组和C组MMP-9呈强阳性,D组呈弱阳性。B组和C组fAPD明显缩短,差异有统计学意义（P〈0.05）。给予炙甘草汤水煎液之后,可作用于房颤兔右心耳组织fAPD导致fAPD延长（P〉0.05）。结论炙甘草汤可逆转房颤兔心肌纤维化,同时缩短fAPD的时程。     

普罗布考对糖尿病兔心房重构及心房颤动发生的干预作用

目的观察普罗布考对糖尿病导致的心房电重构和结构重构、氧化应激及心房颤动(简称房颤)发生的影响。方法实验动物随机分为三组,即对照组、糖尿病组及普罗布考组,每组10只,普罗布考组在成功建立糖尿病模型后予普罗布考1000mg/d,饲养8周,建立Langendorff灌流的离体兔心脏模型,测量心房间传导时间(IACT)、心房各点有效不应期(AERP)、AERP的离散度(AERPD)、应用Burst刺激观察房颤诱发情况;检测血清中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)及髓过氧化物酶(MPO)水平,ELISA法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;心房组织HE及天狼猩红染色测量左心房心肌细胞横截面积及胶原容积分数。结果与对照组比较,糖尿病组兔IACT延长,AERPD增加,MDA及TNF-α水平明显增高,心房肌细胞横截面积及胶原容积分数增大,房颤诱发率升高(均P<0.05);与糖尿病组比较,普罗布考组IACT及AERPD明显减小,MDA及TNF-α水平降低,心房肌细胞横截面积及胶原容积分数减小(均P<0.05)。结论普罗布考可能通过抗炎、抗氧化作用减轻糖尿病引起的心房电重构和结构性重构,减少糖尿病导致的房颤发生。     

心房快速起搏对犬血管细胞黏附分子-1表达的影响

目的 研究心房快速起搏犬模型血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)的表达.方法 选用成年健康杂种犬13条,随机分为两组:快速起搏组7条,假手术组6条.两组均开胸于右心耳缝植AOO型起搏器,快速起搏组以400 bpm起搏6周,假手术组不起搏.应用酶联免疫法测定血清VCAM-1水平,采用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)测定左房组织的VCAM-1 mRNA表达水平,同时进行左房的病理分析.结果 快速起搏组犬起搏6周后的血清VCAM-1水平明显高于假手术组(t=11.63,P<0.01),左房的VCAM-1 mRNA表达水平明显高于假手术组,增高32.1%(t=2.49,P=0.03);病理结果示快速起搏组犬左房心肌细胞变性.结论 心房快速起搏可引起犬血清VCAM-1及左房VCAM-1 mRNA表达水平增高.VCAM-1可能参与心房损伤时的心肌重构过程.     

重组腺相关病毒为载体的心肌肌浆网钙离子ATP酶2a基因转导治疗慢性充血性心力衰竭：短期及中期作用

背景:慢性充血性心力衰竭(CHF)时,心肌肌浆网钙离子ATP酶2a(sarcoplasmic reticulum Ca2 ATPase,SERCA2a)的蛋白表达和活性均明显降低,这导致钙离子的调控异常和心脏收缩和舒张功能不全。目的:观察腺相关病毒为载体的SERCA2a基因转导对CHF大鼠的短期和中长期治疗作用,探讨其治疗心力衰竭的多种可能的机制。设计:随机对照设计。单位:解放军总医院老年心内科和病理生理研究室。方法:将雄性SD大鼠随机分为,假手术组,CHF组,CHF GFP组和CHF SERCA2a组4组,每组又分为基因转导10,30d2个时间点,后3组采用腹主动脉缩窄术建立CHF大鼠模型,手术后18～20周,造模成功的大鼠进行经腹心包腔内注射,CHF组注射500μL无菌生理盐水,CHF GFP组和CHF SERCA2a组分别注射等量携带GFP基因和SERCA2a基因的重组腺相关病毒。主要观察指标:①于基因转导后10,30d,检测大鼠的血流动力学参数,应用WesternBlot方法检测SERCA2a蛋白表达;改良的Jones法测定SERCA2a活性。②应用蛋白质组学研究技术分析比较基因转导30d组中CHF和CHF SERCA2a亚组大鼠的心肌蛋白质组表达的差异。③应用电泳分离和定量的方法检测基因转导30d组的各亚组大鼠心肌肌球蛋白重链亚型的表达情况。结果:①SERCA2a蛋白表达和活性:CHF组和CHF GFP组低于假手术组。基因转导10d后,CHF SERCA2a组与CHF组比较,SERCA2a蛋白表达增加80.7%,活性增加89.9%,但低于假手术组水平;基因转导30d后,CHF SERCA2a组SERCA2a蛋白表达和活性已经达到假手术组大鼠水平。②心脏功能:基因转导10d后,CHF SERCA2a组血流动力学指标中左室舒张末压力明显下降,其他指标明显升高,但未完全达到对照大鼠的心功能水平;基因转导30d后心脏收缩和舒张功能进一步改善,各项指标与假手术组比较差异不显著。③心肌蛋白质组的研究发现,基因转导30d后,CHF SERCA2a组多种能量代谢的酶表达明显增加。④凝胶电泳发现:CHF时α-MHC的表达明显降低而β-MHC则显著增加,α-MHC/β-MHC明显低于假手术组大鼠;基因转导30d后,α-MHC、β-MHC的表达以及α-MHC/β-MHC恢复至假手术组大鼠水平。结论:以重组腺相关病毒2作为载体,SERCA2a基因转导可以增强衰竭心脏的SERCA2a功能,纠正Ca2 稳态异常,增加心脏能量代谢,纠正MHC亚型的异常表达,增强心脏收缩和舒张功能;因而SERCA2a基因转导对CHF具有良好的短期和中长期治疗作用。     

心力衰竭犬心房结构重构的实验研究

目的观察右室快速起搏建立心力衰竭犬模型的效果,探讨心房结构重构在心力衰竭与心房颤动形成过程中的作用机制。方法13只犬随机分为起搏组(n=7)和假手术组(n=6),于左、右心房各缝植4对电极,起搏电极缝植在右室心尖,连接实验用VOO型起搏器,快速心室起搏(220次/分)6周,建立心力衰竭犬模型,分别于起搏前、起搏6周后,应用经食管超声心动图测量左房收缩末容积;采用双平面Simpson法测量左室舒张期末和收缩期末容积,得出左室射血分数和心输出量,并应用光镜和电镜观察心房肌的超微结构。结果①假手术组术前和术后心脏各参数无明显变化。②起搏6周后,起搏组与假手术组比较,左房收缩末容积显著增大[(23.2±4.1)vs(13.5±1.9)cm3,P<0.01],左室舒张末期容积显著增大[(56.2±11.3)vs(33.7±9.6)cm3,P<0.01],左室收缩末期容积显著增大[(38.4±8.4)vs(14.5±8.6)cm3,P<0.01],射血分数显著降低[(31.4±10.2)vs(56.8±4.5)%,P<0.01],心输出量著降低[(1.2±0.5)vs(2.8±1.6)L/min,P<0.01]。③病理学结果显示起搏犬心房肌细胞变性、肌纤维溶解、线粒体肿胀以及间质胶原增生、水肿。结论心房结构重构是心力衰竭犬发生心房颤动的重要原因。     

钙离子ATP酶2a基因修饰骨髓间充质干细胞移植改善慢性心力衰竭大鼠的心功能

背景:目前仍缺乏有效手段修复心力衰竭后受损心肌,逆转心肌病理性重塑.作为一种新的治疗策略,用正常肌细胞和治疗性基因干预受损心肌正逐渐显示出其在改善心功能方面的优势.目的:观察腺病毒转染不同代骨髓间充质干细胞的有效性和稳定性.并以携带肌浆网钙离子ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca(2 ) ATP-ase,SERCA2a) 基因的腺病毒转染骨髓间充质干细胞,治疗心力衰竭大鼠,比较SERCA2a基因治疗,骨髓间充质干细胞移植以及骨髓干细胞基础的SERCA2a基因治疗慢性心力衰竭大鼠的效果.设计:随机对照实验.单位:解放军总医院老年心血管病科和北京医科大学生物化学系.材料:选取购于北京医科大学动物实验中心的4周龄雄性SD大鼠作为骨髓供体.选取体质量200～250 g雌性成年SD大鼠作为细胞移植和基因治疗受体.以雄性大鼠Y染色体sry基因鉴定供体移植细胞是否在雌性大鼠受体心肌内存活.实验所用Ad-SERCa2a,Ad-EGFP的构建由我科鲁小春博士完成;第3和8代骨髓间充质干细胞自行分离培养.方法:实验于2004-07/2005-12在北京医科大学生物化学系周春燕实验室完成.对30只雌性SD大鼠进行左冠状动脉结扎,制作急性心肌梗死后慢性心力衰竭大鼠模型.将造模成功的29只大鼠随机分为4组:基因治疗组7只,干细胞移植治疗组7只,基因修饰的干细胞移植组8只,腺病毒空载体对照组7只,分别予以单纯SERCA2a基因、MSC移植、SERCA2a基因修饰的骨髓间充质干细胞移植及腺病毒空载体干预.分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,用携带SERCA2a及绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad-SERCA2a-GFP)转染第3和8代骨髓间充质干细胞.主要观察指标:采用流式细胞仪检测不同代骨髓间充质干细胞的Ad-SERCA2a-GFP转染率.分别在治疗前及治疗后14,21 d采用超声心动图检测大鼠心功能.采用免疫组化法检测大鼠心脏Ⅷ因子表达;采用RT-PCR 和Western杂交检测SERCA2a的基因和蛋白水平表达,并按照说明书检测宿主SERCA2a功能活性.结果:①转染率:腺病毒转染不同代骨髓间充质干细胞的转染率超过80%,第3代骨髓间充质干细胞与第8代的转染率比较,差异无显著性意义(P > 0.05).②大鼠心功能:治疗后14 d,与腺病毒空载体对照组相比,其余3组左室射血分数均明显升高(P < 0.01).治疗后 21 d,与腺病毒空载体对照组相比,干细胞移植治疗组和基因修饰的干细胞移植组大鼠室壁增厚;干细胞移植治疗组和基因修饰的干细胞移植组左室射血分数和左室短轴缩短率改善率持续升高(P < 0.01),基因治疗组两指标改善率较治疗14 d时下降.与腺病毒空载体对照组相比,基因修饰的干细胞移植组左室前壁和室间隔收缩期纵向峰值速度显著升高(P < 0.01),左室前壁和室间隔舒张期纵向峰值速度亦呈现相同改善(P < 0.01).③心肌SERCA2a的基因、蛋白水平表达和功能活性,以及Ⅷ因子表达:携带SERCA2a基因的骨髓干细胞在宿主心肌能有效地合成和表达有功能的SERCA2a蛋白.与腺病毒空载体对照组相比,基因修饰的干细胞移植组SERCA2a基因、蛋白表达和酶活性均显著增强.干细胞移植组心力衰竭大鼠心脏瘢痕区可观察到Ⅷ因子表达.结论:①第3和8代骨髓间充质干细胞均具有高腺病毒转染率,骨髓间充质干细胞是基因治疗的良好细胞载体,其介导的SERCA2a基因治疗对衰竭心肌具有持续稳定的心功能改善作用.②骨髓间充质干细胞移植改善心功能的作用可能与促进血管新生有关.     

钙离子ATP酶2a基因修饰骨髓间充质干细胞移植改善慢性心力衰竭大鼠的心功能

背景：目前仍缺乏有效手段修复心力衰竭后受损心肌，逆转心肌病理性重塑。作为一种新的治疗策略，用正常肌细胞和治疗性基因干预受损心肌正逐渐显示出其在改善心功能方面的优势。 目的：观察腺病毒转染不同代骨髓间充质干细胞的有效性和稳定性。并以携带肌浆网钙离子ATP酶（sarcoplasmic reticulumCa（2＋）ATPase，SERCA2a）基因的腺病毒转染骨髓间充质干细胞，治疗心力衰竭大鼠，比较SERCA2a基因治疗，骨髓间充质干细胞移植以及骨髓干细胞基础的SERCA2a基因治疗慢性心力衰竭大鼠的效果。 设计：随机对照实验。 单位：解放军总医院老年心血管病科和北京医科大学生物化学系。材料：选取购于北京医科大学动物实验中心的4周龄雄性sD大鼠作为骨髓供体。选取体质量200～250g雌性成年SD大鼠作为细胞移植和基因治疗受体。以雄性大鼠Y染色体sry基因鉴定供体移植细胞是否在雌性大鼠受体心肌内存活。实验所用Ad—SERCa2a，Ad—EGFP的构建由我科鲁小春博士完成；第3和8代骨髓间充质干细胞自行分离培养。 方法：实验于2004—07／2005-12在北京医科大学生物化学系周春燕实验室完成。对30只雌性SD大鼠进行左冠状动脉结扎，制作急性心肌梗死后慢性心力衰竭大鼠模型。将造模成功的29只大鼠随机分为4组：基因治疗组7只，干细胞移植治疗组7只，基因修饰的干细胞移植组8只，腺病毒空载体对照组7只，分别予以单纯SERCA2a基因、MSC移植、SERCA2a基因修饰的骨髓间充质干细胞移植及腺病毒空载体干预。分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，用携带SERCA2a及绿色荧光蛋白的腺病毒（Ad-SERCA2a—GFP）转染第3和8代骨髓间充质干细胞。 主要观察指标：采用流式细胞仪检测不同代骨髓间充质干细胞的Ad-SERCA2a—GFP转染率。分别在治疗前及治疗后14，21d采用超声心动图     

miR-208b对小鼠HL-1房颤细胞钙超载的影响及其机制分析

目的探讨miR-208b对小鼠HL-1房颤细胞钙超载的影响,并分析其作用机制。方法将小鼠HL-1心房肌细胞随机分为3组:对照组、起搏组和miR-208b组。后两组建立快速起搏HL-1房颤细胞模型,然后将miR-208b模拟物转染至miR-208b组细胞,将模拟物阴性对照转染至起搏组细胞,对照组不处理。全细胞膜片钳技术检测动作电位时程(APD)及L型钙电流(I_(Ca,L))的电流密度,实时荧光定量PCR及Western Blot检测钙通道蛋白mRNA及蛋白的表达。结果与对照组相比,起搏组和miR-208b组细胞中miR-208b表达显著增加(P 0. 05),且miR-208b组高于起搏组(P 0. 05)。与对照组相比,起搏组和miR-208b组APD50、APD90、I_(Ca,L)的电流密度、CACNA1C mRNA、CACNB2 mRNA、CaV1. 2蛋白、SERCA2 mRNA及SERCA2蛋白的表达均显著降低(P 0. 05),且miR-208b组低于起搏组(P 0. 05)。结论 miR-208b在小鼠HL-1房颤细胞中高表达,其可通过抑制L型钙通道蛋白的表达和功能以及抑制肌浆网Ca~(2+)摄入,导致胞内Ca~(2+)超载,诱发AF。     

超声靶向微泡破坏联合聚乙烯亚胺增强小鼠肌肉基因转染的实验研究

目的 探讨超声(US)靶向微泡(MB)破坏(UTMD)联合聚乙烯亚胺(PEI)对小鼠肌肉基因转染的增强效果.方法 30只Balb/c小鼠随机分为6组,每组5只.绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA (20μg)按下列分组与SonoVue微泡和(或)PEI混合,注入小鼠后肢胫前肌内,然后予以治疗性超声辐照(声强2 W/cm2,占空比50％,超声辐照声强与占空比在实验前予以优化).A组:PBS组(空白对照组);B组:质粒+ US;C组:质粒+MB+ US;D组:质粒+PEI组;E组:质粒+PEI+ US组;F组:质粒+PEI+ MB+US组.10d后处死小鼠,立即取小鼠双后肢胫前肌冰冻切片,荧光显微镜计数GFP阳性肌纤维数.组织同时送检石腊切片,HE染色光镜观察有无炎性损伤及坏死.结果 A组肌肉组织内未见明显绿色荧光;B组可见绿色荧光表达肌纤维,计数为(14±3)个;C组GFP阳性纤维个数(58±6)个,D组(96±7)个,E组(119±11)个,F组(158±18)个.F组的GFP阳性纤维数最多,与其他各组比较差异均有统计学意义 (P＜0.05).各组石腊切片未显示明显的炎症反应和坏死.结论 UTMD联合PEI可显著提高小鼠肌肉组织的基因转染效率.