血小板无力症的流式细胞术分析方法

板膜糖蛋白(glycoprotein, GP)Ⅱb/Ⅲa属整合素家族, 是纤维蛋白原受体, 介导血小板的聚集.GPⅡb/Ⅲa复合物质的数量不够和质量缺陷都可导致血小板聚集功能障碍, 并导致产生患血小板无力症(Glanzmann′s thrombasthenia, GT)[1].检测血小板膜上GPⅡb/Ⅲa复合物的缺陷, 可从分子水平诊断GT.本文介绍一种用荧光单抗标记血小板, 通过流式细胞术分析诊断GT的方法.     

人源性抗血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa Fab抗体的研制及其对血小板聚集功能的影响

目的:构建人源性抗血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPIⅡb/Ⅲa)Fab噬菌体抗体库,筛选抗GPⅡb/Ⅲa特异性的噬菌体抗体,并对其功能进行研究.方法:取血小板膜糖蛋白抗体(抗GPⅡIb/Ⅲa)阳性的特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者脾细胞,采用噬菌体抗体库技术构建人源性抗GPⅡb/Ⅲa Fab噬菌体抗体库,以表达GPⅡb/Ⅲa的CHO123细胞筛选抗体库,并以ELISA法检测噬菌体抗体;用Western blot对抗体进行鉴定,并测定其与血小板抗原的结合;观察筛选到Fab抗体对血小板聚集的影响.结果:筛选出2株能够与血小板膜GPⅡb/Ⅲa特异性结合的Fab抗体,其序列与人免疫球蛋白轻、重链可变区序列具有高度同源性,表达纯化的Fab抗体能抑制血小板聚集.结论:成功地从人源性抗血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa Fab抗体库筛选出特异性识别GPⅡb/Ⅲa,具有抑制血小板聚集作用的人源性抗体.     

血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa复合体分子生物学研究进展

GPⅡb/Ⅲa作为血小板膜上粘合蛋白(Integrin),主要参与血小板的聚集作用。随着分子生物学的进展和相关实验技术的应用,逐渐的对 GPⅡb/Ⅲa的分子结构和基因结构有了进一步的了解,对GPⅡb/Ⅲa的结构与功能的关系也有了更为深入的认识。本文就血小板膜GPⅡb/Ⅲa的分子结构、基因结构特征和基因突变对血小板聚集功能的影响进行综述。     

特发性血小板减少性紫癜患者GPⅡb/Ⅲa、CD62P表达探讨

目的检测原发性血小板减少性紫癜(ITP)患者血小板表面GPⅡb/Ⅲa、CD62P的表达情况,以探讨其在ITP患者中的临床应用价值.方法采用美国BD公司的FACSCalibur流式细胞仪,对32例ITP患者、17例非免疫性血小板减少、21例其它自身免疫性疾病及20例健康正常人的血小板表面GPⅡb/Ⅲa、CD62P的表达情况进行了分析测定.结果ITP患者GPⅡb/Ⅲa血小板阳性表达率明显高于其它三组(P＜0.01),但CD62P血小板阳性表达率四组无明显差别(P＞0.05),15例无临床症状ITP患者GPⅡb/Ⅲa表达明显高于17例有临床症状ITP患者的表达(P＜0.01).结论GPⅡb/Ⅲa作为监测血小板活化指标,对ITP的鉴别诊断及监测病情发展、判断预后具有重要意义;ITP患者的GPⅡb/Ⅲa表达明显增高,但CD62P表达并不增高,CD62P并非监测ITP患者循环中活化血小板的理想标志物.     

血栓性脑血管疾病患者治疗前后血小板活化膜表面糖蛋白检测及临床意义

目的 :探讨血栓性脑血管疾病患者治疗前后血小板活化标记物CD62 P,GPⅡb/Ⅲa的表达及其临床应用价值。方法 :采用流式细胞仪 (FCM )检测治疗前后血小板活化标记物CD62 P、GPⅡb/Ⅲa的表达。结果 :血栓性脑血管疾病患者治疗前血小板活化标志物CD62 P、GPⅡb/Ⅲa分别为CD62 P5 2 .19± 12 .3 7% ,GPⅡb/Ⅲa 77.98± 14 .2 2 % ,较正常对照组有显著性升高 (P <0 .0 1) ;治疗后CD62 P3 1.16± 17.43 % ,GPⅡb/Ⅲa 40 .71± 11.64 %较治疗前有显著性下降 (P<0 .0 1) ,但仍高于正常对照组 (P <0 .0 1)。结论 :血小板活化标志物CD62 P、GPⅡb/Ⅲa对血栓性脑血管疾病的诊断具有重要价值 ,为临床症状缓解后患者长期药物预防提供理论依据     

噬菌体抗体库中筛选血小板膜糖蛋白Ⅱ b/Ⅲa特异的人源性Fab抗体

本研究利用特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)患者产生抗血小板自身抗体的特点,从ITP患者脾脏细胞中提取RNA,扩增抗体轻链和重链Fd基因,插入噬粒载体pComb3H,构建人源性抗GP Ⅱ b/ⅢaFab噬菌体抗体库.以表达GP Ⅱ b/Ⅲa的CHO123细胞筛选抗体库,制备人源性GPⅡb/Ⅲa Fab噬菌体抗体.     

复发性流产患者HLA及血小板特异性糖蛋白抗体GPⅡb/Ⅲa表达的初步研究

目的:探讨原因不明复发性流产(RSA)患者HLA抗体和血小板特异性糖蛋白(GPⅡb/Ⅲa)抗体的表达情况。方法:对299名复发性流产的患者血浆中HLA抗体和GPⅡb/Ⅲa抗体进行检测,血小板抗体检测试剂盒(固相凝集法)筛查IgG抗体,Antigen Tray-LATM板检测HLA抗体,GTI公司PAK-PLUS检测试剂盒检测血小板特异性抗体,利用流式细胞仪技术进行GPⅡb/Ⅲa抗体的确证。结果:检测的299例RSA患者中,IgG抗体阳性26例,阳性率8.69%。26例IgG抗体阳性患者中,25例HLA抗体呈阳性。HLA-Ⅰ类抗体阳性占5.02%,HLA-Ⅱ类抗体阳性占1.33%,HLA-Ⅰ+Ⅱ类抗体阳性占2.01%;在26例RSA患者中,GPⅡb/Ⅲa抗体阳性4例(占15.38%),其中GPⅡb/Ⅲa阳性和HLA抗体均阳性3例(占11.54%),GPⅡb/Ⅲa抗体单独阳性1例(占3.85%)。结论:初步探讨了RSA患者HLA抗体和GPⅡb/Ⅲa抗体的分布情况,本研究为复发性流产患者血小板抗体的检测提供了初步的实验基础。     

PTCA对血小板Ⅱb/Ⅲa受体及一氧化氮水平的影响及临床意义

目的了解PTCA(经皮冠状动脉腔内成形术)对GPⅡb/Ⅲa(血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体)、NO(一氧化氮)水平的影响 ,为临床上减少PTCA术后副作用提供帮助。方法静脉采血 ,采用放免和分光光度比色法检测PTCA术前后GPⅡb/Ⅲa及血浆NO水平。结果PTCA手术后GPⅡb/Ⅲa水平明显增高 ,术后12h达到高峰 ,48h接近术前水平。血浆NO变化与GPⅡb/Ⅲa的变化趋势相反。结论PTCA可能通过增加GPⅡb/Ⅲa表达 ,降低NO合成释放等环节 ,可诱发新血栓形成 ,导致急性冠状动脉闭塞。因此 ,为减少PTCA后急性再梗塞的发生 ,临床上除应用常规的抗凝治疗外 ,加用GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂效果会更好     

STAT6介导白细胞介素—13诱导巨核细胞系HEL细胞血小板膜糖蛋白Ⅱb和血管性血友病因子的表达

目的:探索信号转导子和转录激活因子6(STAT6)介导白细胞介素-13(IL-13)对巨核细胞系-人红白血病HEL细胞(HEL)血小板膜糖蛋白Ⅱ b(GPⅡ b)和血管性血友病因子(vWF)表达的作用,部分阐明IL-13的信号转导通路.方法:RT-PCR检测GPⅡ b和vWF mRNA的表达,免疫印迹法检测磷酸化的STAT6、 GPⅡ b和vWF蛋白的表达,图像分析检测电泳条带吸光度.结果:IL-13(100μg/L)作用HEL细胞,使HEL细胞STAT6磷酸化,磷酸化抑制剂A77-1726(50μmol/L)阻断了IL-13诱导的HEL细胞STAT6磷酸化.IL-13(100μg/L)上调了HEL细胞GPⅡ b和vWF mRNA和蛋白的表达,A77-1726(50μmol/L)抑制了STAT6介导的IL-13诱导HEL细胞GPⅡ b和vWF mRNA和蛋白的表达.结论:IL-13上调了HEL细胞GPⅡ b和vWF的表达,STAT6介导了IL-13上调HEL细胞GPⅡ b和vWF的表达.     

急性冠脉综合征患者血小板活化及聚集的相关研究

目的 观察急性冠脉综合征(acute coronary syndromes,ACS)患者血小板聚集性及血小板活化指标P选择素、膜GPⅡb/Ⅲa的变化.探讨活化血小板在ACS急性冠脉综合征发病中的作用.方法 选取健康体检者52名为正常对照组,ACS患者89例,按其病情分为不稳定心绞痛(unstable angina,UA)组43例,急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)组46例.检测两组对象的血小板聚集率及血小板表面表达的P选择素、膜GPⅡb/Ⅲa表达率等活化指标.结果 与正常对照组比较,UA组患者血小板聚集率、血小板P选择素、膜GPⅡb/Ⅲa表达率均明显升高,差异有统计学意义(P均＜0.001);ACS患者中,AMI组与UA组比较,血小板聚集率、血小板P选择素、膜GPⅡb/Ⅲa表达率均明显升高,差异有统计学意义(P均＜0.001).结论 随着ACS患者病情加重,血小板活化水平明显升高,聚集功能明显增强,血小板功能异常改变与急性冠脉综合征病情轻重有密切关系.     

免疫性血小板减少症相关免疫负调控因子研究进展

正ITP患者血小板减少的机制包括血小板消耗过多及产生不足,两者皆主要由IgG抗血小板抗体介导~([1]),自身免疫的主要靶点是血小板糖蛋白,如GPⅡb/Ⅲa和GPⅠb/Ⅸ。已经证实,ITP与血小板自身抗原的失耐受有关,而失耐受的原因仍不清楚。大量的研究表明ITP患者体内也存在着细胞免疫紊     

中华眼镜蛇毒F组分抗血小板聚集的作用机制

目的 探讨中华眼镜蛇毒F组分抑制血小板聚集的作用机制.方法 用比浊法测定中华眼镜蛇毒F组分对二磷酸腺苷、花生四烯酸和血小板活化因子诱导血小板聚集作用的影响,流式细胞术观察中华眼镜蛇毒F组分对荧光标记的单克隆抗体CD41(FITC-CD41)和CD61(FITC-CD61)与血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)结合的影响.结果 中华眼镜蛇毒F组分明显抑制二磷酸腺苷、花生四烯酸和血小板活化因子诱导的血小板聚集,其作用呈现一定程度的剂量依赖关系.中华眼镜蛇毒F组分可以明显降低单克隆抗体CD41(抗GPⅡb)与血小板的结合率,而对单克隆抗体CD61(抗GPⅢa)与血小板的结合率没有影响.结论 中华眼镜蛇毒F组分可以抑制多种激动剂诱导的血小板聚集,其机制和中华眼镜蛇毒F组分与血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa复合物的结合有关.     

GPⅢa^T1565C点突变对FAK磷酸化的影响

目的建立稳定表达野生型CPⅡ b／Ⅲa和突变型GPⅡb／Ⅲa^T1565C的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系,探讨GPⅡb／Ⅲa^T1565C点突变对黏着斑激酶（FAK）磷酸化的影响。方法采用脂质体介导基因转移法将真核表达载体pcDNA3．1（＋）Ⅱb分别与pcDNA3．i（＋）Ⅲa或pcDNA3．1（＋）Ⅲa^T1565C共转染到CHO细胞中,经C,418筛选出稳定表达野生型GPⅡb／Ⅲa和突变型GPⅡb／Ⅲa^T1565C的CHO细胞系。流式细胞术（Flowcytom—etry,FCM）检测野生型和突变型GPⅡb／ⅢaCHO细胞表面CD41和CD61的表达。免疫沉淀、免疫印迹（Westernblot）和FCM细胞内染色等方法检测野生型和突变型GPⅡb／ⅢaCHO细胞经纤维蛋白原（Fbg）激活后发生的FAK酪氨酸磷酸化和丝氨酸磷酸化。结果野生型和突变型GPⅡb／ⅢaCHO细胞表面CD41和CD61均高效表达,分别为97．19％和99．71％。免疫沉淀、Western blot检测结果显示,野生型和突变型GPⅡb／ⅢaCHO细胞经Fbg激活90min后,分别有16．24％和20．44％的FAK发生酪氨酸磷酸化;FCM细胞内染色检测结果显示,经Fbg激活90min后,野生型和突变型GPⅡb／ⅢaCHO细胞均不发生FAK丝氨酸磷酸化;激活48h后,野生型和突变型GPⅡb／ⅢaCHO细胞分别有34．89％和73．84％发生FAK丝氨酸磷酸化。结论成功构建稳定表达野生型GPⅡb／Ⅲa和突变型GPⅡb／ⅢaaT1565C托的CIIO细胞系。GPIU／ⅢaaT1565C点突变能够增强FAK酪氨酸磷酸化和丝氨酸磷酸化,因此可能增强GPⅡb／Ⅲa介导的细胞外向内信号转导功能。     

用单克隆抗体对ITP自身抗血小板抗体及其相关抗原的初步研究

本文应用三种抗血小板膜糖蛋白单克隆抗体,按ELISA 间接法、ELISA双抗体夹心法、ELISA竞争法,对ITP患者自身抗血小板抗体及其相关抗原进行了初步研究。实验结果表明,抗血小板抗体的相关抗原呈多态性,包括:GPⅠb、GPⅡb及/或 GPⅢa,以 GPⅡb及/或 GPⅢa占多数,还可能包括血小板膜蛋白以外的其它抗原成分。这提示,ITP可能是一组复杂的、不均一的自身免疫性疾病。     

血小板活性与老年慢性肺心病高凝状态的关系

目的:探讨老年慢性肺心病急性加重期患者血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa、CD62p的变化与纤维蛋白原(FG)、D-二聚体(DD)的关系.方法:用三色全血流式细胞术测定42例老年慢性肺心病急性加重期患者及42例缓解期患者外周血中血小板GPⅡb/Ⅲa、CD62p的表达水平,并检测患者FG、DD水平,与30例老年健康对照者及30例非老年健康对照者比较.结果:老年慢性肺心病急性加重期组GPⅡb/Ⅲa、CD62p、FG、DD均明显高于缓解期组、老年健康对照组及非老年健康对照组(均P<0.001).老年慢性肺心病急性加重期组GPⅡb/Ⅲa、CD62p与FG、DD均呈正相关.结论:老年慢性肺心病急性加重期患者血小板明显活化,其活化程度与高凝状态关系密切.     

血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲ a基因突变与脑血栓的关系

血小板糖蛋白（GP）是一种存在于血小板质膜表面的糖蛋白，在血小板活化和血栓形成过程中起关键作用。血小板膜上存在多种糖蛋白，其中GPⅡh／Ⅲa属于整合素家族黏附受体，是血小板膜含量最多的糖蛋白。GPⅡb／Ⅲa是纤维蛋白原的受体，参与血小板的聚集。GPⅡh／Ⅲa受体的基因突变影响血小板表面受体表达的数量与质量，从而影响血小板聚集。因此，GPⅡh／Ⅲa基因的突变与脑血栓疾病的发生、发展密切相关。研究其基因突变及其与脑血栓的关系将为脑血栓的早期诊断和防治提供分子遗传学基础。     

血小板无力症与GPⅡb-Ⅲa分子缺陷

血小板膜糖蛋白GPⅡb-Ⅲa复合物是在血小板粘附聚集过程中起重要作用的粘附分子受体,能结合纤维蛋白原、VWF等多种粘附蛋白.GPⅡb-Ⅲa质或量的缺陷导致血小板无力症,根据GPⅡb-Ⅲa缺陷程度分为Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ型,临床表现为出血时间延长,聚集反应明显减弱.GPⅡb-Ⅲa的研究已进入分子水平,对其发病机制也有较深的了解.     

血小板相关抗体与原发性血小板减少性紫癜关系的研究进展

原发性血小板减少性紫癜 (idiopathicthrombocy topenicpurpura ,ITP)是一种自身免疫性血小板减少症 ,血小板减少的机制是由于自身免疫功能异常导致血液中产生血小板相关抗体 ,使循环中血小板破坏增加。ITP是由血小板自身抗体所引起的综合征 ,为临床常见的出血性疾病 ,其主要病理是血小板抗体的产生并吸附于血小板表面后加速血小板从循环中的清除 ,这些抗体作用的血小板膜靶抗原可多种多样 ,其中血小板膜上糖蛋白 (glycoprotein ,GP)Ⅱb/Ⅲa是一重要靶抗原 ,少数针对GPⅠb/ⅠX复合物。由于抗体直接作用于GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/ⅠX等 ,使…     

PTCA围手术期硫氮酮对血小板活性和钙动力学的影响

目的研究硫氮(艹卓)酮对内皮损伤后血小板激活的影响及与胞浆Ca2+浓度的关系.方法35例拟行PTCA治疗的心绞痛患者随机分成对照(C)组和硫氮(艹卓)酮治疗(D)组,由冠状静脉窦和外周静脉采血,检测围术期血小板GPⅡb/Ⅲa表达和胞浆Ca2+浓度.并在体外研究不同浓度硫氮(艹卓)酮对稳定型心绞痛患者全血GPⅡb/Ⅲa表达的影响.结果C组首次球囊扩张后5 min、10 min和PTCA后10 min时GPⅡb/Ⅲa表达和[Ca2+]i明显升高,而D组未见升高.高于治疗浓度的硫氮(艹卓)酮(200μg/L以上)显著抑制GPⅡb/Ⅲa表达.结论硫氮(艹卓)酮和阿司匹林/抵克力得联合治疗可防止常规阿司匹林/抵克力得治疗时发生的血小板激活.硫氮(艹卓)酮抗血小板作用可能是抑制[Ca2+]i升高的结果,但只在高于治疗浓度时有效.     

PTCA围手术期硫氮(艹卓)酮对血小板活性和钙动力学的影响

目的 :研究硫氮  酮对内皮损伤后血小板激活的影响及与胞浆Ca2 浓度的关系。方法 :35例拟行PTCA治疗的心绞痛患者随机分成对照 (C)组和硫氮 艹卓 酮治疗 (D)组 ,由冠状静脉窦和外周静脉采血 ,检测围术期血小板GPⅡb/Ⅲa表达和胞浆Ca2 浓度。并在体外研究不同浓度硫氮 艹卓 酮对稳定型心绞痛患者全血GPⅡb/Ⅲa表达的影响。结果 :C组首次球囊扩张后 5min、10min和PTCA后 10min时GPⅡb/Ⅲa表达和 [Ca2 ]i明显升高 ,而D组未见升高。高于治疗浓度的硫氮 艹卓 酮 (2 0 0 μg/L以上 )显著抑制GPⅡb/Ⅲa表达。 结论 :硫氮 艹卓 酮和阿司匹林 /抵克力得联合治疗可防止常规阿司匹林 /抵克力得治疗时发生的血小板激活。硫氮 艹卓 酮抗血小板作用可能是抑制[Ca2 ]i升高的结果 ,但只在高于治疗浓度时有效