光化学法病毒灭活的模型病毒培养与滴定方法的建立

目的建立Sindbis和伪狂犬病毒的培养与滴定方法.方法以Vero细胞为病毒传代及滴度滴定指示细胞,Karher氏法计算滴定结果.结果 Sindbis病毒感染的Vero细胞以圆缩、脱落为主;伪狂犬病毒感染的Vero细胞以变圆、形成折光性强的合胞体为主,病变细胞晚期脱落.Sindbis病毒第一次滴定TCID50＞11,第二次滴度TCID50为9.5;伪狂犬病毒第一次滴定TCID50＞11,第二次滴定TCID50为7.2.结论 Vero细胞对两种模型病毒均较敏感,适合用于此两种病毒的培养与滴定.该方法的建立为光化学法灭活血小板中病毒的研究奠定基础.     

狂犬病毒CTN-1株在Vero细胞中持续感染的特性研究

目的 观察以Veto细胞大规模生产狂犬病毒时的细胞生长和病毒感染特性。方法 以分种和混种方法，经过不同培养时间，测定Vem细胞的生长状况和胞内外病毒含量。结果 细胞形态随接种病毒时间的长短有所变化，不同接种方法在病毒滴度也无显著性差异。培养上清夜病毒含量以第4～9d滴度最高，细胞病毒感染率在第4d达80％以上，第10d后开始下降，第15d降入低谷。结论 以0．01～0．10MOI的加毒比例，培养第4，9d收获效果最佳。     

用浓缩地鼠肾细胞狂犬病毒抗原免疫马匹获得高效价血浆

目的制备高效价马抗狂犬病免疫血浆。方法通过细胞制备、病毒的接种、培养、收获、浓缩等步骤，研制了浓缩地鼠。肾细胞狂犬病毒抗原，并与羊脑狂犬病毒抗原作马匹免疫对比试验。结果浓缩地鼠。肾细胞抗狂犬病免疫血浆的效价明显高于羊脑抗狂犬病免疫血浆。试验组血浆平均效价为157IU／ml，对照组为113IU／ml，两组差异有统计学意义。结论已成功制备高效价抗狂犬病免疫血浆。     

用微载体培养Vero细胞制备狂犬疫苗

目的研究微载体培养Vero细胞生产狂犬疫苗。方法搅拌式生物反应器培养Vero细胞,待细胞在微载体上长成单层后,用狂犬病毒aG株感染细胞。培养5d后,开始灌流收获病毒液,每天取样测定病毒滴度。经灭活后制备成试验疫苗,进行效力试验。结果3次培养,细胞密度均达到1×106/ml以上,病毒滴度都在106LD50以上,3批试验疫苗的效价分别达到5.88、6.49和5.98IU/ml。结论在生物反应罐中用微载体培养Vero细胞制备狂犬疫苗工艺合理,所获免疫原性良好,适用于工业化生产,有较好的应用前景。     

血清对联合培养神经上皮干细胞与Schwann细胞的影响

目的：探讨血清对联合培养神经上皮干细胞与Schwann细胞的影响，进一步寻求诱导神经上皮干细胞定向分化的影响因素。方法：采用不同浓度血清联合培养神经上皮干细胞与Schwann细胞，收集上清液作为条件培养液，免疫细胞化学染色观察条件培养液诱导神经上皮干细胞分化，统计分析分化为神经元与星形胶质细胞的比例；MTT检测条件培养液促Schwann细胞存活及增殖的作用。结果：Schwann细胞促进神经上皮干细胞存活和分化，随着血清浓度增加，神经上皮干细胞分化形成的神经元比例减少；神经上皮干细胞及血清均促进Schwann细胞存活和增殖，随血清浓度增加，存活及增殖率增加。结论：无血清或较低血清浓度有利于共培养的Schwann细胞存活和增殖，同时也有利于共培养神经上皮干细胞存活和向神经元方向分化。     

肾综合征出血热病毒在体外培养的人肾小球系膜细胞中的复制

为探讨肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）能否感染体外培养的人肾小球系膜细胞及在其中复制，能否引起细胞病变，方法：用ＨＦＲＳＶ７６－１１８株，ＳＲ－１１株和陈株分别攻击体外传代培养的人肾小球系膜细胞。结果：于培养第一代即在受染细胞的胞浆中检出特异性病毒抗原，阳性细胞数及胞浆内抗原的含量随传代次数的增加而增加，感染细胞在光镜下未见明显病理损害，结论：ＨＦＲＳＶ可以感染体培养的人肾小球系膜细胞并可以在其中     

单纯疱疹病毒Ⅱ型在Vero细胞中培养与增殖特性的研究

目的研究单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2）在非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）中培养及增殖的合适条件。方法把HSV-2接种于Vero细胞中培养和传代,于不同时间收获病毒液并测毒力,进行不同培养条件的摸索。结果pH值、残留牛血清是HSV-2在Vero细胞培养的影响因素,最佳收毒时间为36-72h。在Vero细胞上培养病毒3-5代,病毒毒力较高。结论建立了单纯疱疹病毒Ⅱ型在Vero细胞上培养增殖的初步方法,为下一步建立HSV-2的潜伏与激发细胞模型打下基础。     

单纯疱疹病毒Ⅰ型在单层细胞培养中的增殖特征

目的：通过对HSV-1在BHK-2l单层细胞培养中的增殖特征的研究，得出获得较高病毒含量的条件，从而对基础研究以及今后即将开展的临床病毒培养进行指导。方法：使用不同滴度的HSV-1毒株接种不同浓度培养的BHK-2l单层细胞，病毒感染后用免疫荧光法及ELISA法检测病毒滴度，并绘制曲线。结果：在细胞传代时，较大浓度的细胞在长成单层细胞后对病毒敏感性较高，并随细胞浓度减少而逐渐下降，但如将病毒滴度控制在适当范围内，仍可得到较高的病毒含量。结论：如需获得较高滴度的病毒悬液，应将培养用单层细胞以较大浓度传代或使接种病毒滴度处于适当范围。     

狂犬病固定毒aG株在Vero细胞上的传代适应研究

目的为研制安全,有效和使用方便的Veto细胞狂犬疫苗提供基础资料。方法对狂犬病固定毒3aG株在Yero细胞上的传代适应性进行了研究,同时进行了狂犬病毒在Veto细胞上繁殖最适条件的选择实验。结果狂犬病固定毒3aG株在Veto细胞上多次传代后得到高滴度表达毒力可达8．3LogLD50/ml,具有较好的抗原性及免疫原性,并且确定了狂犬病病毒在Vero细胞上繁殖的最适条件,即种毒量在0．1—0．01LD50／cell之间病毒滴度最高。蛄论3aG-V毒株在Veto细胞上繁殖可维持相当长时间,并可进行多次加液,检测证实多次收获毒液毒力均达到疫苗制造要求。     

苏拉明对黄病毒类NS3蛋白质合成的影响

寻找有效的抗黄病毒类药物，为临床应用提供理论依据。在病毒吸附培养细胞HepG2后加入不同浓度的苏拉明，48h后采取培养上清液及感染细胞，运用病毒滴度测算（plaque法）、Western blot法及RT－PCR法，检测其对病毒增殖的影响。结果显示用苏拉明50μg/ml处理后产生的病毒量是对照组的51.8%，同时显示病毒NS3蛋白质合成量减少，而对病毒RNA无任何影响。提示苏拉明抑制病毒复制作用主要是阻碍了病毒NS3蛋白质的合成。     

全人源抗狂犬病病毒糖蛋白抗体的制备及鉴定

目的:利用重组狂犬病病毒糖蛋白(RVG)免疫人源IgM转基因小鼠,制备全人源抗重组RVG蛋白单克隆抗体,并对其免疫学特性进行初步鉴定?方法:以重组RVG蛋白作为抗原免疫人源IgM转基因小鼠,采用杂交瘤技术制备筛选全人源抗重组RVG蛋白杂交瘤细胞株,双抗体夹心ELISA实验鉴定单抗的人源性及抗体类型,并对其特异性及与灭活狂犬病病毒CVS-11株的结合能力进行鉴定?结果:建立了5株稳定分泌抗重组RVG的全人源单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为5D1?6H11?9A3?15D6?19E6,均为人源IgM免疫球蛋白,5株单抗均能特异性识别重组RVG蛋白,其中3株能与灭活狂犬病病毒CVS-11株特异性结合?结论:筛选制备了特异性全人源抗重组RVG蛋白的单克隆抗体,能与灭活狂犬病病毒CVS-11株特异性结合,为进一步研制用于狂犬病防治的抗体药物奠定了基础?     

狂犬病毒隐性感染者生存状况研究

目的:查明人群中是否真正存在狂犬病毒隐性感染者。方法:检测有暴露史的自愿者体内的狂犬病毒抗体、随访调查其生存状况和抗体的消长情况,并与狂犬病死亡者的一些情况进行比较分析。结果:有暴露史222例自愿者中检出隐性感染者45例,其中密切接触者23例,被咬伤者22例,其体内的狂犬病毒抗体逐年下降,2006年其检测阳性率为0;这些隐性感染者的感染期绝大部分已超过我市狂犬病患者的最长潜伏期。结论:我们检出的45例感染者是真正意义上的隐性感染,而非潜伏期内感染。     

全人源抗狂犬病病毒G蛋白单链抗体制备及中和活性鉴定

目的:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,筛选针对狂犬病病毒G蛋白不同表位的单链抗体(scFv)并鉴定其中和活性?方法:分离130例经狂犬病疫苗免疫接种志愿者的外周血淋巴细胞,提取总RNA,逆转录制备cDNA,构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库?以纯化的狂犬病病毒G蛋白包板筛选,对阳性克隆进行可溶性表达,并鉴定中和活性?结果:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,库容为5.0 × 107,经核酸序列分析,证实插入片段为scFv?经过5轮筛选,从富集的次级抗体库中随机挑出140个克隆,通过phage-ELISA鉴定得到4株核酸序列不同的scFv抗体?经His-Trap纯化后进行中和活性鉴定,获得1株有中和活性的scFv,其中和效价为0.13 IU/mg?结论:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,获得1株具有中和活性的抗狂犬病病毒G蛋白scFv抗体,为进一步研发狂犬病治疗性抗体药物奠定了基础?     

狂犬病毒非临床型感染初探

目的：探讨狂犬病毒非临床型感染的可能性。方法：收集病例资料和检测暴露人群血清中的狂犬病毒抗体。结果：(1)收集到的2例患者，在被犬咬伤，愈后又复发不良反应，同时伴有血清中狂犬病毒抗体4倍增长的现象；(2)检测的暴露人群49例中(无疫苗接种史)，检出狂犬病毒抗体7例(14．28％)。结论：狂犬病毒可以引起非临床型感染即隐性感染(亚临床感染)。     

应用毕赤酵母分泌表达筛选人抗狂犬病毒抗体scFv-Fc

目的：利用毕赤酵母人抗狂犬病毒抗体分泌表达文库获得具特异性狂犬病毒抗原结合活性的分泌型小分子抗体（scFv-Fc）。方法： RT-PCR方法扩增获得一组轻链和重链可变区基因。利用重叠延伸PCR方法组装scFv基因后克隆入毕赤酵母scFv-Fc抗体库通用表达质粒pPICZα/Fc后，电转化X33酵母菌，甲醇诱导表达后进行ELISA筛选、基因序列分析及免疫印迹分析。结果：构建了抗狂犬病毒毕赤酵母分泌型scFv-Fc库，获得了12株阳性菌株。对其中2株阳性克隆进行了序列分析证实为新的抗体可变区基因。ELISA、Western blotting分析，证实该scFv-Fc具有特异性狂犬病毒抗原结合活性，相对分子质量为56 000。结论：通过毕赤酵母人抗狂犬病毒抗体scFv-Fc分泌表达文库筛选获得具较高亲和力的新scFv-Fc抗体。     

免疫酶标法检测犬脑组织狂犬病毒的实验研究

目的 用免疫酶标技术对犬脑组织狂犬病毒抗原进行分析。方法 应用单克隆抗体和免疫酶标技术标记犬脑组织中狂犬病毒抗原。结果 在以HE法检测全部阴性的48例狗脑组织中，有2例呈阳性反应，阳性率为4.17％。大脑、海马区出现明显的弥漫型和局灶型阳性颗粒，结论 免疫组化单克隆抗体标记狂犬病毒其敏感度高，可提高狂犬病毒的诊断率；对研究狂犬病毒在犬脑组织神经细胞的分布有一定的意义。     

The ERA strain of rabies vaccine

An antigenic extinction trial in cats showed that the ERA rabies vaccine had superior antigenic properties over Flury H.E.P. C.E.O. and killed tissue culture rabies vaccine.Dogs and cats on a duration of immunity study of ERA rabies vaccine were challenged with fox salivary gland "street" rabies virus. The results of this challenge show a duration of immunity of five years in dogs and four years in cats.Vaccination of dams in late pregnancy with ERA rabies vaccine resulted in transference of maternal antibody to the newborn, in both cattle and dogs. This maternally derived antibody interfered with the successful active immunization of the young calf. Calves free of antibodies for rabies could be successfully vaccinated as early as 17 days of age and were able to withstand a challenge with virulent "street" rabies virus two years later.     

狂犬病毒G蛋白基因的克隆?表达及生物学活性鉴定

目的:将狂犬病毒G蛋白(rabies virus G protein, RVG)基因片段克隆到原核表达载体中,表达并纯化GST融合G蛋白,为研制狂犬病新型ELISA抗体检测试剂盒提供诊断抗原?方法:根据GenBank发表的狂犬病病毒CVS-11株G蛋白结构基因序列设计引物,利用RT-PCR扩增出RVG基因片段,并定向克隆于pGEX-6P-1载体中,构建原核表达载体pGEX-RVG?阳性重组质粒转化宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,通过对表达条件的优化,确定可溶性表达的最佳条件?利用谷胱甘肽转移酶(GST)亲和层析法获得纯化的目的蛋白,Western blot对表达的蛋白进行鉴定?结果:构建了原核表达载体pGEX-RVG,经IPTG诱导后可表达分子量约36 000融合蛋白,经纯化获得高纯度的目的蛋白?Western blot检测表明重组的融合蛋白有较好的生物学活性?结论:成功表达并纯化狂犬病毒G蛋白,为进一步研制狂犬病新型ELISA抗体检测试剂盒提供抗原?     

四川省200O年犬只携带狂犬病毒及免疫后效果的流行病学调查

目的为进一步预防和控制狂犬病.方法从7个监测点随机采集436份犬只唾液和132份血清,冷冻保存,分别用法国巴斯德诊断试剂盒检测狂犬病毒抗原和抗体.结果在436份唾液标本中,抗原阳性18份,平均阳性率4.13%,带毒率在0～10%之间,最高为宜宾市高县(10%),最低为资中(0),经x2检验,各地区犬只带毒率无显著性差异(P＞0.05).132份血清标本中,抗体阳性仅12份,阳性率9.09%,抗体阳转率最高为双流县(25%),资中县、荣县均为0,经x2检验,无显著性差异(P＞0.05).结论我省监测点犬只携带狂犬病毒普遍存在,有严重的流行隐患.     

不同疫区家犬携带狂犬病毒的比较研究

目的比较河南和陕西两省外观健康的家犬狂犬病毒携带率，为加强当前犬只管理、控制我国狂犬病不断上升的疫情提供参考依据。方法调查河南和陕西两省近年来人间狂犬病疫情；分别采集河南和陕西两省外观健康的家犬脑组织样品121份和645份，以免疫荧光实验（IFA）、小鼠颅内接种试验（MIT）以及逆转录聚合酶链式反应（RT—PCR）检测样品带毒情况；以MEGA及DNAStar等生物信息学软件对病毒核蛋白基因进行分析。结果从河南省121份犬脑样品中栓出阳性结果9份，陕西省645份样品无阳性；9株狂犬病毒与我国人用精制狂犬病疫苗CTN株系统发育关系较近。结论外观健康的家犬能够携带狂犬病毒；犬养殖量大、免疫率低以及狂犬病毒携带率高仍是当前我国狂犬病流行的主要原因。