腺体组织损伤后体外分离下颌下腺干/祖细胞后的克隆化培养

背景:体外构建组织工程化人工涎腺需获得分化增殖良好、数量充足的种子细胞,但正常下颌下腺中很难分离出成体干细胞.目的:利用腺体组织损伤动物模型体外分离下颌下腺干/祖细胞,并进行克隆化培养.设计、时间和地点:细胞学体外观察,于2006-03/2007-01在遵义医学院贵州省细胞工程实验室完成.材料:8周龄雄性SD大鼠10只,由解放军第三军医大学动物中心提供.方法:10只大鼠采用结扎下颌下腺主导管、抑制腺体分泌来建立组织损伤模型,1周后切取腺体组织,酶消化法体外分离下颌下腺干,祖细胞,原代培养10-14 d后,挑取培养皿中形成的小的类圆形、类上皮细胞集落予以纯化,传代后进行单克隆培养.主要观察指标:下颌下腺干,祖细胞免疫细胞化学染色及免疫荧光染色结果,通过绘制生长曲线分析下颌下腺干,祖细胞体外增殖能力.结果:实验获得表达层粘蛋白的细胞具有干细胞特征,CD29呈阳性表达表明其具有高黏附、高增殖等组织干细胞特性,角蛋白19的阳性表达提示下颌下腺干,祖细胞呈上皮源性.其生长曲线近似"S"形,体外培养增殖活跃.结论:实验结果显示,下颌下腺干,祖细胞具有组织干细胞的特征,有望成为组织工程化人工涎腺构建的一类种子细胞来源.     

异丙肾上腺素影响下颌下腺干/祖细胞增殖的数量还是能力？

背景：异丙肾上腺素注射能够促进啮齿类动物涎腺腺泡细胞增殖、肥大。然而,异丙肾上腺素注射后涎腺干/祖细胞的增殖能力目前仍不清楚。
　　目的：研究异丙肾上腺素腹腔注射对SD大鼠下颌下腺干/祖细胞激活、增殖能力。
　　方法：SD大鼠随机分为2组,分别腹腔注射异丙肾上腺素与生理盐水,连续注射5 d后取下颌下腺,酶消化法制取下颌下腺细胞悬液,体外培养,获得下颌下腺类上皮细胞集落并计数。挑取增殖较快的集落,进行CD90.1、层粘连蛋白、α6β1等免疫细胞化学检测。
　　结果与结论：与对照组相比,异丙肾上腺素注射组中、低增殖集落数量较少,高增殖集落数量较多,差异有显著性意义(P<0.05),而集落总数无明显区别(P>0.05)。高增殖下颌下腺类上皮细胞集落CD90.1、层粘连蛋白、α6β1抗体均为阳性表达。实验结果显示,异丙肾上腺素注射不能明显增加下颌下腺中的干/祖细胞数量,但是能提高腺体中干/祖细胞的增殖能力。     

基底样乳腺癌与管腔A乳腺癌干／祖细胞的表型分析

目的比较人基底样乳腺癌和管腔A乳腺癌干／祖细胞分化前后的细胞表型变化。方法应用乳腺癌细胞球无血清悬浮培养法获取乳腺癌干／祖细胞;分别以荧光免疫技术和流式细胞术检测基底样乳腺癌和管腔A乳腺癌干／祖细胞分化前后细胞角蛋白CK14、CK18、CK19和CD44、CD24的表达情况;分析原代细胞内CD44＋ CD24-细胞水平与克隆形成率的关系。结果基底样乳腺癌干／祖细胞表达CK19＋／CK14＋,不表达CK18,经血清诱导分化后,管腔上皮标志CK18和肌上皮标志CK14呈阳性表达;管腔A乳腺癌干／祖细胞呈CK18＋／CK19＋／CK14-表型,诱导分化后管腔上皮标志CK18和CK19表达,而肌上皮细胞标志CK14则不表达;CD24在基底样乳腺癌表达极低或无表达,但在管腔A乳腺癌高表达。基底样乳腺癌原代细胞中水平较高的是CD44-／CD24-/Low细胞,含CD44＋／CD24-／Low细胞（2．52±0．58）％,而管腔A乳腺癌CD44-／CD24＋细胞所占的比例最高,但不合CD44＋／CD24 -/Low细胞或水平极低。结论基底样乳腺癌和管腔A乳腺癌干／祖细胞有不同的细胞表型,二者的分化能力和分化方向也不同,可能起源于不同的乳腺上皮细胞。     

人羊膜上皮细胞的干细胞特性

背景:研究发现人羊膜上皮细胞具有类似胚胎干细胞或多能干细胞的多向分化潜能,说明其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞.目的:研究体外培养的人羊膜上皮细胞的干细胞特性.方法:取足月剖宫产的人羊膜组织,经酶消化法和差异黏附法获得纯度高的人羊膜上皮细胞,接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中进行原代和传代培养,用免疫荧光法和流式细胞仪检测法检测人羊膜上皮细胞表面胚胎干细胞的表面标记蛋白OCT-4和干细胞表面分子标记CD29、CD34、CD44、CD45、CD105的表达.结果与结论:人羊膜上皮细胞在体外培养条件下呈上皮细胞特有的铺路石样外观,其胞浆中有OCT-4免疫荧光表达,其干细胞标记分子CD29、CD34的表达是阳性,但干细胞标记分子CD44、CD45、CD105的表达为阴性.结果表明人羊膜上皮细胞具有干细胞的某些特性,其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞.     

人羊膜上皮细胞的干细胞特性

背景：研究发现人羊膜上皮细胞具有类似胚胎干细胞或多能干细胞的多向分化潜能,说明其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞。目的：研究体外培养的人羊膜上皮细胞的干细胞特性。方法：取足月剖宫产的人羊膜组织,经酶消化法和差异黏附法获得纯度高的人羊膜上皮细胞,接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中进行原代和传代培养,用免疫荧光法和流式细胞仪检测法检测人羊膜上皮细胞表面胚胎干细胞的表面标记蛋白OCT-4和干细胞表面分子标记CD29、CD34、CD44、CD45、CD105的表达。结果与结论：人羊膜上皮细胞在体外培养条件下呈上皮细胞特有的铺路石样外观,其胞浆中有OCT-4免疫荧光表达,其干细胞标记分子CD29、CD34的表达是阳性,但干细胞标记分子CD44、CD45、CD105的表达为阴性。结果表明人羊膜上皮细胞具有干细胞的某些特性,其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞。     

Turner综合征羊水干细胞的分离及特征

背景：羊水干细胞的分离培养及生物学特性相关研究取得了明显进展,但未见45,X／46,XX（Turner综合征）羊水细胞建系的报道。目的：建立体外培养人羊水来源干细胞的方法,初步探讨羊水干细胞的生物学特性。方法：孕中期羊膜腔穿刺获得1例染色体核型异常（45,X／46,XX）羊水标本,采用梯度稀释后低密度种植的方法获得羊水干细胞,体外传代培养,倒置显微镜观察细胞的贴壁生长情况,细胞染色体检查确认核型,流式细胞仪检测羊水干细胞特异性表面标志和细胞周期,进行成骨诱导分化及碱性磷酸酶染色和茜素红染色鉴定。结果与结论：羊水干细胞在体外培养体系中增殖迅速,核型为45,X／46,XX,流式细胞仪检测羊水干细胞表达CD29、CD44、CD90和CD105间充质干细胞表面标志,不表达造血干细胞标志CD45和CD34：大部分细胞处于G1期,增殖能力强。羊水干细胞经成骨诱导分化后,碱性磷酸酶染色和茜素红染色阳性。结果可见该实验成功分离获得45,X／46,XX（Turner综合征）羊水干细胞,其增殖能力强,表现间充质干细胞的特性。     

人脐血CD34+CD38-细胞免疫表型和染色体核型特征分析

目的 分离脐血干／祖细胞(CD34^ CD38)进行体外长期培养，观察分析其增殖、细胞表面分子标志和染色体核型的特征。方法 用流式细胞仪分选CD34-FITC和CD38-PE标记的CD34^ CD38脐血原始细胞，在含细胞生长因子IL-3、IL-6、GM-CSF、EPO、SCF和胰岛素样生长因子的干细胞培养基中培养6个月，用流式细胞术检测体外培养30d的干／祖细胞表面标记，并用G显带方法分析其染色体核型。结果 在一定培养条件下，经7～12d培养，脐血干／祖细胞(CD34^ CD38)开始增殖。培养6个月后，每孔接种1个细胞，细胞数增殖至250～350个；每孔接种10个细胞，细胞数可增殖至400～500个。每孔接种1个细胞其细胞增殖峰持续时间(8～9代)比接种10个细胞(6～7代)长：经体外长期培养增殖，细胞仍强烈显示十／祖细胞表面分子标记(CD34^ CD38^-)；细胞染色体数目、结构未见异常。结论 脐血干／祖细胞(CD34^ CD38^ )经体外特异性培养增殖，可为大量脐血干／祖细胞移植提供细胞来源。     

胎儿心脏来源细胞的分离培养及鉴定

目的:胎儿心脏正处于组织器官形成和发育时期,其中的细胞数量和增殖能力应该高于成体组织,但是目前关于培养人胎儿心脏来源细胞的方法以及基本生物学特征还鲜见报道.实验拟建立体外培养胎儿心脏来源细胞的方法,探讨心脏来源细胞基本的生物学特征和细胞种类.方法:实验于2005-10/2007-05在南京大学医学院和国家生物医药技术重点实验室完成.①实验材料:水囊引产的12～18周胎儿10例由南京大学医学院附属鼓楼医院提供,实验经产妇及家属同意,并经医院医学伦理委员会批准.②实验方法:取胎龄12～18周水囊引产的胎儿心脏,将消化后获得的细胞培养于添加内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、干细胞生长因子、心肌营养素及含10?S的DMEM/F12培养基中.③实验评估:应用显微镜观察细胞的形态特征,采用RT-PCR检测培养前后心脏来源细胞于细胞标志基因等基因的表达,流式细胞仪检删培养前及培养19 d后细胞的表面标志.结果:①心脏来源的细胞可以生长增殖.培养16 d后出现克隆,并有类似生长中心的区域形成,类似生长中心区域内的细胞较小,形态接近圆形,细胞核占细胞比例大,而周围的细胞形状多为梭形核多角形,细胞核所占的比例较小,并且显微镜下可见正在分裂的细胞.②RT-PCR检测显示,胎儿心脏组织分离获得的心肌细胞中表达c-Kit、KDR、GATA-4、Nkx-2.5、MEF-2c,不表达c-Tnl.培养19 d后细胞中GATA-4、KDR、MEF-2c表达量降低,不表达c-Kit,Nkx-2.5和c-Tnl.③流式细胞仪检测发现培养19 d后细胞群中CD29和CD44高表达.CD45、GATA-4和c-Tnt低表达.结论:建立了一种体外培养胎儿心脏来源细胞的方法,并确定细胞群中有心脏来源的间充质干细胞和心肌祖细胞.     

脂肪干细胞体外分离培养鉴定及免疫学性质

背景：脂肪干细胞由于具备易于获取等特点,在组织工程中比骨髓间充质干细胞具有更加广阔的应用前景,并因此成为当今的研究热点之一。目的：观察脂肪干细胞的生长规律,鉴定其干细胞特性和免疫学性质。方法：自整形外科行抽脂的3名健康志愿者身上获取皮下脂肪组织及外周血,志愿者年龄20一30岁,均为女性。用I型胶原酶消化脂肪组织获得脂肪干细胞,在体外原代培养及传代培养,观察其体外增殖能力等生物学特性;通过流式细胞术检测人脂肪干细胞分化群表面抗原和主要组织相容性抗原的表达。并将异体脂肪干细胞和淋巴细胞共培养,观察脂肪干细胞是否可以刺激后者增殖。结果与结论：所获脂肪干细胞具有很强的体外增殖能力,其生长曲线呈“S”形;第3代脂肪干细胞表面CD29、CD44、CD90以及主要组织相容性抗原I呈阳性表达,CD31、CD45、CD34及主要组织相容性抗原II呈阴性表达;未发现异体脂肪干细胞刺激淋巴细胞增殖。提示所获细胞确为脂肪干细胞,且具有较弱的排斥反应,有可能成为细胞治疗或组织工程的同种异体细胞来源。     

体外诱导人类诱导性多能干细胞分化为造血干 / 祖细胞的研究简

本研究探讨体外诱导人诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell,iPSC）分化为造血干/祖细胞的能力.在体外用小鼠骨髓基质细胞OP9与人类iPSC共培养的方法,将iPSC诱导分化为造血干/祖细胞;用流式细胞术检测造血干/祖细胞表面标志物的表达水平;用实时定量PCR检测分化过程中iPSC及造血干/祖细胞的相关基因mRNA表达水平的变化;用免疫磁珠法分离CD34＋造血干/祖细胞并进行半固体集落形成实验检测细胞的集落形成能力.结果表明,iPSC与OP9细胞共培养诱导造血分化的第4天即可观察到iPSC形态变化;流式细胞术检测显示,分化得到的细胞表达已知的造血干/祖细胞相关表面标志物CD34和CD43分子.在体外分化过程中多能性的标志基因Oct4的表达逐渐下降,造血相关转录因子Gata-2的表达逐渐升高,而Runx-1的表达量则呈波浪式变化,CD34表达量逐渐升高.集落培养14 d能够得到红系集落（CFU-E）,粒系集落（CFU-G）,巨核系集落（CFU-M）,粒-巨核系集落（CFU-GM）和混合系集落（CFU-GEMM）.结论：iPSC细胞能够在体外通过与OP9细胞共培养分化为造血干/祖细胞.