大鼠的不同纯度胰岛中干细胞标志物CK-19及PDX-1 mRNA的表达

目的探讨大鼠的不同纯度胰岛中干细胞标志物细胞角质蛋白19(CK-19)和胰十二指肠同源盒基因1(PDX-1)mRNA的表达。方法将30只雄性SD大鼠随机平均分成3组,均采用胶原酶Ⅴ型通过胰管对胰腺进行灌注,切取胰腺,剪碎、吹打、消化、离心获得胰岛细胞沉淀物。A组胰岛沉淀物不进行纯化;B组胰岛沉淀物中加入体积分数为25%的Ficoll-400液纯化;C组胰岛沉淀物依次加入25%及11%的Ficoll-400纯化。分别将上述3组纯化后的胰岛抽提RNA行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),分析胰岛干细胞标志物CK-19及PDX-1mRNA的表达。结果采用不同的纯化方法后,A、B、C三组获得胰岛的纯度分别为(43.6±6.29)%、(65.3±4.40)%和(77.6±6.36)%,三组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。A组胰岛中CK-19和PDX-1mRNA的表达明显高于B组和C组,而C组表达最弱。结论不同纯度的胰岛中均有CK-19及PDX-1mRNA的表达,表明在纯化胰岛中均有干细胞存在。     

不同纯度大鼠供体胰岛中巢蛋白、神经元素3的表达

目的 观察巢蛋白（Nestin）、神经元素（Ngn）3在不同纯度大鼠胰岛中的表达。方法 将30只成年雄性SD大鼠随机分为3组，采用胰管内注入胶原酶消化法分离成年大鼠胰腺，Ⅰ组（n=10）：胰岛沉淀物不进行纯化；Ⅱ组（n=10）：胰岛沉淀物加入25％Ficoll-400纯化，Ⅲ组（n=10）：胰岛沉淀物依次加入25％、11％的Ficoll-400纯化。逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测Nes．tin和Ngn3mRNA在不同纯度胰岛细胞中的表达。结果 Ⅰ组获得胰岛纯度为（43．60±6．29）％，Ⅱ组获得胰岛纯度为（65．30±4．40）％，Ⅲ组获得胰岛纯度为（77．60±6．36）％，各组差异均有统计学意义（P〈0．05）。Ⅰ组中Nestin和Ngn3的mRNA表达明显高于Ⅱ组、Ⅲ组，Ⅲ组中表达最弱。结论 Nestin、Ngn3在不同纯度胰岛细胞中均有表达，但是在低纯度胰岛中表达最明显，提示低纯度胰岛中可能携带较多的干细胞。     

成人胰腺干细胞转分化为胰岛的研究

目的：通过对成人胰腺干细胞转分化为胰岛过程的研究以便更深入了解及改进胰腺干细胞分离、培养、鉴定方法。方法：成人胰腺组织经胶原酶消化后,用密度梯度离心法将胰腺外分泌细胞、导管上皮细胞和胰岛分离、纯化,导管上皮细胞即具有转分化潜能的干细胞,在体外先后以CMRL1066和无血清DMEM／F12培养液共培养27d,在培养的不同时间点取样本于光镜和电镜下观察细胞形态学变化及干细胞特异性转录基因PDX－1,CK－19蛋白等单抗的免疫组化染色,并测定培养液中的淀粉酶和胰岛素含量。结果：上述方法可获得大量以往在胰岛分离时丢弃的胰腺导管上皮细胞。经体外一定条件的培养后,第1天即可见PDX－1,CK－19阳性细胞,胰腺导管上皮细胞迅速分裂增殖并转变为有分化能力的干细胞继而转分化为三维结构的胰岛细胞。培养27d后,平均每克胰腺组织可生成760个胰岛。结论：成人胰腺的导管上皮具有干细胞潜能并可在体外转分化为大量具有内分泌功能的胰岛,用此方法获得大量的胰岛可能为克服胰岛移植的供体短缺提供一条新的途径。     

胰岛发育和胰腺干细胞研究进展

胰腺移植手术可使糖尿病患者得到治愈,但供体不足成为制约其开展的瓶颈.胰腺干细胞移植治疗糖尿病是极具潜力的治疗方案,有希望克服尸体胰岛移植供体不足和需免疫抑制治疗的缺陷.众多研究者尝试利用不同来源的干细胞分化或转分化形成胰岛或β细胞,并努力寻找胰腺干细胞的特异性标志以确证和分离纯化胰腺干细胞.本文综述了近年胰岛发育和胰腺干细胞研究领域的一些研究进展.     

同种异体胰岛及胰腺干细胞来源的胰岛样结构序贯移植治疗糖尿病

目的 观察同种异体大鼠胰岛及胰腺干细胞来源的胰岛样结构序贯移植在糖尿病治疗中的作用.方法 分离胰腺组织获得胰岛及胰腺导管上皮细胞,将具有干细胞潜能的胰腺导管上皮细胞在体外培养27d.将新鲜分离的胰岛(200±50)个及诱导分化2周的胰腺干细胞来源的胰岛样结构(2×106)个序贯移植到糖尿病大鼠的肾被膜下观察大鼠的血糖及生存情况.结果 将胰岛及胰腺干细胞来源的胰岛样结构序贯移植到同一糖尿病大鼠3周后血糖仍在5 mmol/L水平,对照组血糖无明显下降.结论 胰腺干细胞可诱导分化为分泌胰岛素的胰岛样结构,胰岛及胰腺干细胞来源的胰岛样结构序贯移植对大鼠糖尿病有治疗作用.     

大鼠胰岛移植物制备与异种移植

增加胰岛收获量，提高胰岛纯度一直是胰岛移植中面临的重要问题，本实验经胰管注射胶原酶，胰静止消化分离成年大鼠胰岛纯度一直是胰岛葡聚糖离心纯化。纯化后胰岛收获量为６１０－８２０个／胰纯度达９２％；胰岛形态结构完整，内分泌细胞超微结构保持良好，对葡萄糖刺激反应胰岛素释放量是基本分泌水平的８倍；异种移植可逆转实验性糖尿病小鼠的高血糖达一周。     

成人胰腺干细胞转分化为胰岛细胞过程中的形态学观察

目的：观察成人胰腺干细胞转化化为胰岛过程中的形态学变化，以便更深入了解有关机制。方法：人胰腺组织经胶原酶消化后，用梯度离心法将胰腺外分泌细胞和胰岛分离，混于外分泌组织中的导管上皮细胞即具有转分化潜能的干细胞。在体外经CMRL1066及不含血清的DMEM／F12加多种营养因子的培养液中培养27d，在培养的不同时间点取细胞作PDX－1、CK－19等单抗的免疫组化染色。光镜和电镜观察不同时间点的形态学变化。结论：上述方法可获得大量以往在胰岛分离时丢弃的胰腺导管上皮细胞。经体外一定条件的培养后，其形态学变化过程为：导管上皮细胞迅速分裂增殖转变为有分化能力的干细胞继而转分化为胰岛细胞。结论：成人胰腺的导管上皮具有干细胞潜能，并可在体外转分化为大量具有内分泌功能的胰岛。用此方法获得大量的胰岛可能为克服胰岛移植的供体短缺提供一条新的途径。     

扩大标准的供者胰腺在胰岛移植中应用的动物实验

目的 通过系列的动物实验,从供者胰腺(简称:供胰)的热缺血时间、脂肪浸润程度和灌注损伤程度三个方面初步探讨扩大标准的供胰在胰岛移植中的应用. 方法 实验动物采用雄性Wistar大鼠.根据不同的干预冈素,将供胰分为3组,热缺血组、灌注水肿组和脂肪浸润组;另选正常胰腺作为正常对照组.胰岛提取采用原位灌注、胶原酶消化和Ficoll梯度密度离心法.获取的胰岛用双硫腙染色来计算分离的胰岛数目并判断所获取的胰岛纯度;丫啶橙/溴乙啶荧光染色法检测胰岛细胞的活率;体外葡萄糖刺激下胰岛素释放试验检测胰岛功能. 结果 胰腺热缺血15 min内对胰岛的提取量和活率无明显影响,纯度略有下降;热缺血30 min内胰岛的提取量、活率及纯度均明显下降,但胰岛体外功能良好;热缺血45 min时,胰岛体外功能不良.胰腺轻度和中度脂肪浸润时,胰岛提取量及胰岛素释放指数(SI)明显高于正常对照组,而重度脂肪浸润时,胰岛提取量较正常对照组明显降低,且体外功能不良,SI显著下降.胰腺轻度和中度水肿对胰岛提取量、活率、纯度及功能均无明显影响;胰腺重度水肿(含水量＞80%)时,胰岛的提取量、活率及纯度下降,体外功能不良,SI显著低于正常对照组. 结论 供胰质量是影响胰岛提取及功能的重要因素,重度脂肪浸润、严重灌注水肿、热缺血时间超过30 min均影响胰岛提取的数量、纯度及活率,对胰岛功能也有较大影响.     

胰岛干细胞移植

胰岛细胞的替代治疗是糖尿病治疗的新方向,但由于受到供体来源的限制无法推广。利用干细胞移植分化成为胰岛功能细胞是目前的热门科研项目。本文综述了近年来从胚胎干细胞和成体干细胞分化为胰岛细胞的试验成果。     

胰岛干细胞移植

胰岛细胞的替代治疗是糖尿病治疗的新方向，但由于受到供体来源的限制无法推广。利用干细胞移植分化成为胰岛功能细胞是目前的热门科研项目。本文综述了近年来从胚胎干细胞和成体干细胞分化为胰岛细胞的试验成果。     

实验大鼠胰岛分离移植技术方法的比较分析

目的 探索高效的大鼠胰岛分离移植技术方法.方法 应用Wistai-Furth大鼠,于体内或体外胶原酶经胰管灌注膨化胰腺,联合不同密度Ficoll液或Histopaque液纯化胰岛细胞,评估胰岛的数量、纯度、胰岛当量以及肾被膜下胰岛移植的有效性.结果 体外经胰管灌注膨化胰腺结合Histopaque液纯化提取胰岛的数量、纯度和胰岛当量值均显著高于体内灌注组各数值(P＜0.01),其提取时间无显著差别.1000个胰岛细胞移植进入左肾被膜下,有效的逆转了糖尿病大鼠高血糖,其远期糖耐受结果优于500和800个胰岛细胞移植组.结论 体外灌注膨化消化胰腺结合Histopaque液纯化胰岛的分离方法是一种满意的分离技术.1000个胰岛细胞是保证肾被膜下胰岛移植成功的最低有效数量.     

胰岛细胞与骨髓间充质干细胞联合移植治疗糖尿病的进展

目的总结胰岛细胞与骨髓间充质干细胞联合移植治疗糖尿病的可行性与安全性。方法收集国内外有关胰岛细胞与骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病的文献并作综述。结果目前糖尿病的治疗方法主要为胰腺移植和胰岛细胞移植,其中胰腺移植的手术创伤大、死亡率高;胰岛细胞移植虽安全性较高,但排斥反应强,胰岛细胞在体内的长期存活时间不理想,严重影响其远期疗效。骨髓间充质干细胞与胰岛细胞联合移植能缓解排斥反应,延长胰岛细胞的存活时间,可以更有效地治疗糖尿病。结论胰岛细胞与骨髓间充质干细胞联合移植具有降低排斥反应、减轻炎症反应、延长胰岛细胞的存活时间及延长降血糖时间的效果,可能是新的治疗糖尿病的手段。     

PDX-1基因提高脂肪间充质干细胞分化为胰岛分泌细胞能力的研究前景

1型糖尿病主要是由于胰岛β细胞破坏导致胰岛素绝对缺乏引起,胰岛β细胞无法再生,也不能进行异种移植,干细胞移植是治疗糖尿病的新型方法。已有研究证实了脂肪间充质干细胞(adipose mesenchymal stem cells,ADSC)能够被诱导分化成胰岛素分泌细胞,也有研究显示了胰十二指肠同源盒基因-1(PDX-1)可诱导非胰岛分泌细胞如骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞等向胰岛素分泌细胞分化,提示PDX-1在改善胰岛β细胞再生和促进胰岛细胞恢复中有着巨大潜能。本文就当前PDX-1基因提高脂肪间充质干细胞分化为胰岛分泌细胞能力的研究前景作一综述。     

小鼠胰岛的分离纯化及体外功能检测的实验研究

目的：探讨获得高质量小鼠胰岛的分离纯化方法，评价其功能。方法：采用胆总管内胶原酶灌注膨胀消化胰腺的方法分离小鼠胰岛，不连续密度梯度离心法纯化胰岛，用双硫腙（Dithizone，DTZ）对胰岛进行特异性染色计算胰岛产量及纯度，以葡萄糖和茶碱刺激胰岛素释放检测胰岛功能。结果：胰岛的产量和活性主要与胰腺均匀膨胀和胶原酶的消化时间有关。平均每个小鼠胰腺能得到150～250个高质量胰岛，活性〉95％，纯度〉90％。葡萄糖及茶碱（carbachol，Cch）刺激后胰岛素释放量明显增加。结论：改良的胆总管内胶原酶灌注膨胀消化小鼠胰腺及不连续密度梯度Ficoll-400纯化胰岛的方法，可获得产量较高、纯度及功能较好的胰岛。     

Nestin阳性细胞的研究进展

胰岛干细胞移植有望能治疗Ⅰ型和部分Ⅱ型糖尿病。从胰腺组织分离得到的Nestin阳性细胞，可以转分化为胰腺的内、外分泌细胞和肝细胞，因而被认为是胰岛干细胞；但是也有研究表明Nestin阳性细胞不能转分化为胰岛细胞，主要与未成熟胰岛细胞向胰岛细胞过渡过程中的血管生成有关，并向未成熟胰岛细胞传递信号，促进胰岛细胞的成型(formation)并维持胰岛细胞的形态功能。本文就Nestin阳性细胞的研究进展进行综述。     

多潜能干细胞定向分化为胰腺β细胞的研究进展

近几年利用多潜能干细胞体外诱导分化为胰岛β细胞的研究进展迅速.本文主要讨论近几年来维甲酸、骨形态发生蛋白、成纤维生长因子家族在多潜能干细胞分化为胰岛β细胞过程中的作用及其可能机制方面的研究进展,以及多潜能干细胞于体外诱导分化为胰岛β细胞的不同阶段其表面抗原CD14、CD49e、CD238、CD24、上皮细胞表面黏附分子阶段特异型胚胎抗原1和 3的表达与分化的关系及组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导小分子1和2、间变性淋巴瘤激酶的抑制物1和2在分化中的作用.     

Nestin阳性细胞的研究进展

胰岛干细胞移植有望能治疗Ⅰ型和部分Ⅱ型糖尿病。从胰腺组织分离得到的Nestin阳性细胞,可以转分化为胰腺的内、外分泌细胞和肝细胞,因而被认为是胰岛干细胞;但是也有研究表明Nestin阳性细胞不能转分化为胰岛细胞,主要与未成熟胰岛细胞向胰岛细胞过渡过程中的血管生成有关,并向未成熟胰岛细胞传递信号,促进胰岛细胞的成型(formation)并维持胰岛细胞的形态功能。本文就Nestin阳性细胞的研究进展进行综述。     

同种异体胰岛细胞和干细胞来源胰岛移植的现况与未来

同种异体胰岛移植为治愈糖尿病带来了希望。20世纪90年代以来，干细胞研究的迅速进展，为移植提供了新的移植物来源，用干细胞或祖细胞增殖分化获得足够数量和功能的胰岛进行移植，是未来胰岛移植的方向。     

家兔胰岛分离纯化方法的改进

目的介绍一种新的家兔胰岛分离纯化方法并进行纯化后胰岛的外观、活性和胰岛细胞团表面结构等质量分析。方法雄性日本大耳白,采用2 mg/m L胶原酶V逆行胰管灌注和消化,并用Hanks液洗涤,用Histopaque-1119、Histopaque-1077密度梯度离心进行胰岛纯化,DTZ、FD-PI染色鉴定胰岛纯度和活性,扫描电镜观察纯化后胰岛表面结构。结果家兔胰管开口于小肠,纯化得到家兔胰岛外形圆整,纯度90%,活性(87.4±5.9)%,纯化前胰岛当量为(1 874.8±464.5)IEQ,纯化后胰岛当量为(1 254.8±235.8)IEQ;扫描电镜结果显示胰岛细胞团表面有被膜,但部分胰岛被膜被消化。结论采用此方法可快速得到纯度高、活性好且结构完整的家兔胰岛,为进一步进行家兔胰岛体外质量及体内移植研究奠定了基础。     

大鼠胰腺干细胞转分化为胰岛样细胞簇的研究

胰岛细胞来源有限，且受到伦理及免疫排斥等因素的制约，极大地限制了胰岛移植治疗糖尿病在临床上的广泛应用。成体干细胞能避开上述缺陷，且其可塑性为临床应用提供了可能。我们进行了将大鼠胰腺干细胞转分化为胰岛样细胞簇的研究，现报告如下。