Kartogenin与TGF-β3/BMP-2/DEX对兔滑膜间充质干细胞增殖及成软骨分化的对比研究

目的：比较Kartogenin（KGN）与转化生长因子β3（TGF?β3）/骨形态发生蛋白2（BMP?2）/地塞米松（DEX）对兔滑膜间充质干细胞（synovial?derived mesenchymal stem cells, SMSCs）增殖及成软骨分化的作用。方法于6~10月龄新西兰大白兔膝关节处滑膜中分离培养SMSCs,并进行鉴定。设置KGN组（采用KGN干预）、T/B/D组（TGF?β3/BMP?2/DEX联合干预）及空白对照组,采用PELLET系统培养法分别培养各组细胞。通过比较各组细胞的增殖速度、软骨微球的直径和重量、Ⅱ型胶原（Col?Ⅱ）表达情况、成软骨分化相关标志基因表达及蛋白质合成量等指标来评价KGN对SMSCs增殖及成软骨能力的影响。结果成功从兔膝关节滑膜分离出SMSCs;KGN组的SMSCs增殖能力弱于T/B/D组,但KGN组软骨微球直径最大,重量最重,Ⅱ型胶原合成量最多,且均显著高于其他组;PCR及Western Blot结果表明KGN组成软骨分化相关基因的表达最强,蛋白质合成量最多。结论 KGN不能明显增强SMSCs的增殖能力,但对SMSCs的成软骨分化能力强于TGF?β3/BMP?2/DEX,将来可能应用于修复软骨损伤。     

不同浓度葡萄糖对滑膜间充质干细胞成软骨能力调节作用的研究

目的研究分化前阶段不同浓度葡萄糖对滑膜间充质干细胞(SMSCs)成软骨能力的调节作用,并探究其分子调节机制。方法将分化前阶段SMSCs分组置于含有不同浓度葡萄糖的培养基中进行增殖培养:一组采用低浓度(1.0 g/L)葡萄糖培养SMSCs(LGMSMCs);另一组采用高浓度(4.5 g/L)葡萄糖培养SMSCs(HGMSMCs)。增殖培养7 d后,将两组SMSCs同时进行成软骨诱导分化,通过检测软骨标志基因的表达水平来评价两组SMSCs成软骨能力的大小;通过分析转化生长因子-β(TGF-β)和蛋白激酶-C(PKC)信号通路系统来研究其分子调节机制;设置平行实验,在高糖培养的SMSCs中加入PKC抑制剂G6983进一步研究TGF-β和PKC信号通路系统。不同浓度的葡萄糖培养基中分化前DNA总量,分化前、分化阶段的SMCSs成软骨相关基因的表达比较采用成组t检验。结果 SMSCs培养第21天,HGMSMCs组的蛋白聚糖(AGN)、Ⅰ型胶原(ColⅠ)及Ⅱ型胶原(ColⅡ)的表达明显少于LGMSMCs组的(t=-3.69,P0.05;t=-77.57,P0.01;t=-34.42,P0.01);在SMSCs分化前阶段,GMSMCs组的TGF-βⅡ型受体(TGFβ-RⅡ)的表达明显高于LGMSMCs组的(t=4.5,P0.01);在SMSCs分化阶段,GMSMCs组的PKC磷酸化水平及TGF-βⅡ型受体(TGFβ-RⅡ)的表达明显低于LGMSMCs组的(t=-5.84,P0.01;t=-4.79,P0.01)。另外,在平行实验中,SMSCs分化前阶段,往高糖培养的SMSCs中加入PKC抑制剂G6983较未加入抑制剂更能上调SMSCs在分化阶段TGFβ-RⅡ的表达水平(t=-1.03,P0.05)。结论在SMSCs分化前阶段,低糖培养可以增加SMSCs成软骨能力;其分子机制是葡萄糖对分化前阶段TGF-β和PKC信号通路进行调节,进而调节分化阶段SMSCs成软骨能力。     

滑膜间充质干细胞成纤维软骨分化条件初步探索

目的采用正交实验研究滑膜间充质干细胞(synovial derived MSCs,SMSCs)成纤维软骨分化的条件。方法 5只成年新西兰白兔,活检取滑膜组织。贴壁法获取SMSCs后采用流式细胞仪及成脂、成骨、成软骨诱导分化鉴定。根据预实验与文献综述寻找与SMSCs成纤维软骨分化可能相关的条件,采用缺失实验初筛必要条件后,TGF-β1、BMP-2、地塞米松、脯氨酸、柠檬酸(ascorbic acid,ASA)、丙酮酸、胰岛素+转铁蛋白+亚硒酸预混液、牛血清白蛋白、b FGF、间断静水压、BMP-7、IGF纳入正交实验,采用SPSS18.0统计软件设计L60(212)正交实验及表头,定义2水平条件,在SMSCs-三维小肠黏膜下层(small intestinal submucosa,SIS)支架上诱导成纤维软骨分化。使用流式细胞仪计数,检测CD151+/CD44+细胞并记录SMSCs向纤维软骨分化的转换率,采用免疫组织化学染色,结合细胞形态、甲苯胺蓝染色、半定量RT-PCR检测SOX9、聚集蛋白聚糖、Ⅰ型胶原(collagen typeⅠ,ColⅠ)、ColⅡ、ColⅨ基因表达,进一步验证结果。检验指标rate是CD151+/CD44+细胞与高表达ColⅠ细胞的比例乘积。同时采用Pico Green Assay测量细胞总DNA量,以反映细胞扩增情况。正交实验结果采用直观观察和主体间方差分析方法,考虑部分因子间的1阶交互作用,组间差异采用LSD和q检验验证,使用Ⅲ型平方和校正模型,检验水准α=0.05。结果实验获取的细胞为SMSCs,细胞倍增时间为28 h。成纤维软骨分化过程中SMSCs-三维SIS支架体积5 d倍增,14 d后得到甲苯胺蓝染色阳性的细胞-支架复合物。正交实验结果直观分析示,TGF-β1对成纤维软骨分化转化率的作用最明显,BMP-7采用水平2有利于得到更高的转化率,但与BMP-2存在交互作用;其余第1区组水平值加和高于22.5的因子有DEX、ASA、ITS、转铁蛋白、b FGF,模型的相关性好。方差分析校正模型P=0.000,能够满足实验设计;截距P=0.000,说明各因子对因变量影响差异不完全相同。TGF-β1、ASA、b FGF、IGF对因变量调控作用较其他因子显著,差异有统计学意义,与直观观察结果相似。结论 TGF-β1、ASA、b FGF、IGF显著影响SMSCs成纤维软骨分化,通过合理调整上述因子浓度,可显著提高SMSCs成纤维软骨分化转化率;精确的调控条件和调控机制有待进一步探索。     

CD105+滑膜间充质干细胞成软骨能力

目的 分选CD105+滑膜间充质干细胞(SMSCs),观察其增殖和向软骨细胞分化的能力.方法 酶消化滑膜组织分离SMSCs,流式细胞仪分选CD105+ SMSCs;第3、7天采用WST-1测定SMSCs的增殖能力;软骨诱导21 d进行免疫组织化学染色,检测蛋白聚糖和Ⅱ型胶原.结果 酶消化获取的SMSCs为星形或梭形,分选后SMSCs形态无明显变化.免疫荧光显示分选组CD105+细胞较未分选组明显增多.WST-1增殖检测提示两组细胞吸光度值3 d(0.376±0.012、0.329±0.012)、7 d(0.581±0.009、0.524±0.007)比较差异有统计学意义(P＜0.05).成软骨诱导培养21 d后,分选组甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原染色均较未分选组多且深,说明CD105+ SMSCs合成更多软骨细胞外基质.结论 CD105+ SMSCs具有较强的增殖和成软骨能力,CD105+ SMSCs可成为软骨组织工程良好的种子细胞.     

膝骨关节炎滑膜间充质干细胞多向分化及免疫抑制能力

目的观察骨关节炎(OA)患者膝关节滑膜来源的间充质干细胞(SMSCs)多向分化能力以及免疫抑制能力。方法无菌环境下通过关节镜取出中山大学孙逸仙纪念医院10例OA患者膝关节滑膜组织,分离培养出SMSCs,采用CCK-8法检测细胞增殖能力,通过成骨、成软骨和成脂肪诱导分化培养基对SMSCs诱导分化,于诱导第21天分别行茜素红、甲苯胺蓝和油红O染色。将SMSCs和CD3、CD28抗体刺激后的人外周血单核细胞(PBMC)进行共培养,通过流式细胞术对PBMC的增殖率进行检测,组间比较通过方差分析总体差异后再通过Bonferroni法进行组间两两比较。结果OA患者SMSCs第3天开始进入对数增长期,第7天细胞增殖进入平台期。SMSCs经过成骨、成软骨和成脂肪诱导分化后,茜素红、甲苯胺蓝和油红O染色均为阳性。SMSCs和CD3、CD28抗体刺激后的PBMC进行共培养5 d后,阴性对照组PBMC增殖率为(3.8±0.4)%,几乎不增殖,阳性对照组PBMC增殖率为(80.9±8.1)%,实验组PBMC的增殖率为(52.3±5.1)%,实验组与阳性对照组的差异具有统计学意义(t=8.97,P0.01)。结论 OA患者SMSCs同样具有多向分化能力和免疫抑制能力,可作为组织工程理想的种子细胞来源。     

膝关节滑膜间质干细胞分离、培养及其多向分化潜能特性的研究

目的 探讨晚期骨关节炎患者膝关节滑膜间质干细胞(synovium-derived mesenchymalstem cells,SMSCs)体外分离、培养的可行性及其在体外向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞定向分化的特性.方法 取膝关节滑膜组织,胶原酶消化获得有核细胞.挑选单细胞克隆,筛选获得SMSCs.流式细胞技术检测细胞表面特异性抗原标志.培养至第三代,分别向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞诱导分化.油红O染色鉴定向脂肪细胞分化;碱性磷酸酶染色、茜素红染色鉴定向成骨细胞分化;甲苯胺蓝染色鉴定向软骨细胞分化.RT-PCR检测脂肪细胞、成骨细胞标志基因.Ⅱ型胶原免疫组化染色检测软骨细胞Ⅱ型胶原的表达.结果 原代SMSCs体外培养呈葵花样细胞集落,传代后可见圆形巨噬样细胞和纺锤形成纤维样细胞,融合后呈成纤维细胞样生长.CD44、CD90呈阳性,CD34、CD71和CD45呈阴性.向脂肪细胞诱导21d,油红O染色阳性;RT-PCR检测有脂蛋白酶、乙二腈及PPARγ2表达;向成骨细胞诱导7、28 d,ALP,茜素红染色阳性,有ALP、Osteopontin及Osteocalcin表达;向软骨细胞诱导21d,甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性.结论 晚期骨关节炎患者膝关节滑膜组织可以分离、培养获得SMSCs. SMSCs具有向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞发生定向分化的潜能.     

微小RNA-564基因下调对滑膜间充质干细胞成软骨分化的影响

目的探究下调微小RNA-564(miR-564)基因对滑膜间充质干细胞成软骨分化的作用。 方法取第3代的人滑膜间充质干细胞(SMSCs)作为实验细胞,实验设计为3组：SMSCs空白对照组(空白组);miRNA抑制剂转染SMSCs对照组(对照组);miR-564抑制剂转染SMSCs实验组(实验组)。将3组SMSCs同时成软骨诱导培养,观察诱导后软骨细胞的组织形态,并检测诱导前7 d内的3组细胞增殖曲线,和软骨分化特异性基因和蛋白[Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、性别决定区Y框蛋白9(Sox9)、母亲DPP同源物4(Smad4)];本次实验所有数据均采用单因素方差分析(one-way ANOVA)检验。 结果甲苯胺蓝染色观察细胞形态与特点基本符合软骨细胞,实验组细胞数量更多,蓝染更明显;细胞增殖曲线表明实验组细胞增殖速度明显快于对照组(F＝0.842, P <0.01);RT-PCR检测与Western Blotting检测表明实验组软骨细胞分化特异基因和蛋白表达较对照组明显升高(F＝2274.75, F＝447.31, F＝30476.22; P <0.01),并且实验组TGF-BMP关键基因及蛋白Smad 4有所升高(F＝457.02, P <0.01)。 结论下调miR-564基因的表达可促进滑膜间充质干细胞向软骨细胞增殖与分化,并且有可能是通过作用于TGF-BMP通路实现。     

滑膜间充质干细胞的研究进展

【摘要】〓软骨损伤及滑膜组织疾病引起的肢体运动障碍是临床治疗的棘手问题之一,滑膜间充质干细胞(SMSCs)是骨髓间充质干细胞(MSCs)家族的新成员,由于其具有突出的增殖特性和强大的成软骨分化能力等优点,SMSCs被视为治疗骨关节系统疾病颇有希望的种子细胞,已成为近年来研究的热点。本文就近年来有关SMSCs的分离纯化、基本特性及临床应用等方面进行综述,旨在阐明SMSCs的研究现状及存在的相关问题。     

人滑膜间充质干细胞的分离培养与鉴定

背景：软骨一旦损伤将很难自我修复,组织工程学修复损伤软骨是目前的研究热点。组织工程学中找到合适的“种子细胞”至关重要。滑膜间充质干细胞（SMSCs）因较其他来源的间充质干细胞成软骨能力、增殖能力更强,且细胞容易获取、对机体损伤小等优点,越来越受到研究者的青睐。 目的：探讨人SMSCs体外分离、培养的方法与步骤,探索对SMSCs进行鉴定的最新方法。 方法：关节镜下获取11例行关节镜手术患者的滑膜组织,按照Pei等[6]的方法分离培养滑膜干细胞;从细胞形态学观察、细胞生长曲线分析、CCK-8测定增殖活力、流式细胞仪检测细胞周期和细胞表面抗原、对SMSCs进行成脂/成骨/成软骨诱导、免疫细胞荧光染色以及RT-PCR检测成脂/成骨/成软骨相关基因的表达等方面对SMSCs进行鉴定。 结果与结论：按照Pei等的方法可以成功地从人滑膜组织中分离出干细胞,分离出的干细胞具有间充质干细胞特异性表型和多向分化潜能。     

猪滑膜源性MSCs体外多向分化潜能的研究

目的 体外分离培养猪滑膜源性MSCs(synovium-derived MSCs,SMSCs),探讨其在体外多向分化潜能.方法 2月龄长枫杂交猪3头,雌雄不限,体重8～10kg.取猪膝关节滑膜组织分离SMSCs并行原代及传代培养,待第3代SMSCs长满培养皿后,吸去基础培养液,分别加入特定培养液进行成软骨、成骨、成脂诱导分化,作为实验组;以基础培养液培养作为对照组.成软骨诱导21 d后行甲苯胺蓝染色、免疫组织化学染色和实时荧光定量PCR检测;成骨诱导10 d后行ALP染色检测,21 d后行茜素红染色检测;成脂诱导21 d后行油红O染色检测.结果 SMSCs培养24 h后细胞形态细长或呈多角形;48 h后细胞数量增多;72 h后可见大量纺锤形细胞,其间散在分布少许小圆形细胞.实验组成软骨诱导21 d后甲苯胺蓝染色早阳性,细胞外有蛋白多糖(Aggrecan)形成;免疫组织化学染色示特异软骨基质ColⅡ表达;实时荧光定量PCR检测示Col Ⅱ A1、Aggrecan、SOX9 mRNA表达量与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).成骨诱导10 d后ALP染色阳性,21d后茜素红染色阳性,有钙结节形成.成脂诱导21 d后油红O染色示细胞内有脂滴形成.对照组除ALP染色观察呈弱阳性外,余染色均呈阴性.结论 猪膝关节滑膜组织可分离获取SMSCs,其在体外具有向成软骨、成骨、成脂多向分化潜能,有望成为组织工程种子细胞来源.     

Faculty of Anaesthetists of the Royal College of Surgeons of Ireland

The Faculty of Anaesthetists of the Royal College of Surgeons of England, 35–43 Lincoln's Inn Fields, London WC2A 3PN. Telephone: 01-405 3474.     

深圳市某两所小学流行性腮腺炎突发疫情的流行病学分析

目的：通过对深圳市某两所小学发生的流行性腮腺炎突发疫情的流行病学特点及差异性进行分析,为制定科学、高效的防控策略提供科学依据。方法2013年5～7月深圳市大鹏新区某两所小学爆发流行性腮腺炎,以学校为整体研究对象,分别标记为学校A（24个班,学生1210例）和学校B（27个班,学生1274例）,对比两所小学的疫情流行病学差异性。结果分析发现,学校A流行性腮腺炎发病率为4.30%,发病班级所占比54.17%,均较学校B1.73%和29.63%高,对比差异有统计学意义（P＜0.05）;分析显示学校A学生出现疫病平均年龄为（11.2±1.1）岁,较学校B（9.34±1.0）岁,对比差异明显（P＜0.05）;且两组疫病患儿在接种疫苗率对比上差异无统计学意义（P＞0.05）;但疫情发生时,学校B疫苗紧急接种率明显高于学校A,对比差异有统计学意义（P＜0.05）。结论小学作为流行性腮腺炎爆发的主要场所之一,疫病爆发高峰季节前,针对易感染人群给予相应的疫苗接种等预防控制措施,同时加强流行性腮腺炎的监测,对于降低感染人群数量,减轻、遏制疫情有着积极的意义,值得相关防控部门重视。