鼠疫耶尔森菌亚单位疫苗鼻腔免疫微球的制备与性质

目的：制备F1，V，F1-V3种鼠疫耶尔森菌亚单位疫苗鼻腔免疫微球，研究其体外释放性质、抗原活性等性质。方法：采用复乳溶剂挥发法制备鼠疫疫苗微球，以激光粒度测定仪测定微球的平均粒径，以BCA法及微量BCA法测定微球的疫苗含量及疫苗从微球的释放，以ELISA法考察从微球中释放出的鼠疫疫苗的活性。结果：鼠疫耶尔森菌亚单位疫苗微球粒径均匀，F1，V，F1-V疫苗微球平均粒径分别为4．2，4．6和5．9μm，包裹率分别为68．2％，61．3％和51．0％，载药量分别为9．7％，8．7％和6．2％，微球中包裹的疫苗与原溶液相比活性降低不明显。结论：采用复乳溶剂挥发法，通过控制一定的因素，可以得到具有较高包封率的鼠疫耶尔森菌亚单位疫苗微球。     

人用炭疽吸附抗原接种后人体血清抗体水平的观察

本实验用ELISA对炭疽吸附抗原免疫后人群的血中抗体进行半定量测定。经三针基础免疫后,全部受试者的抗体滴度≥1/40,与免疫前相比,抗体滴度增高2～64倍,增高4倍以上者占受试者的92.86%。还对炭疽抗原接种后的人体抗体消长规律进行了观察:第二针注射后5天有可测出的抗体,第三针注射后抗体急剧升高,3个月仍保持较高值;6个月抗体量有所下降,但仍高于第三针接种前水平。第三针注射后1年的ELISA OD值与免疫前相比无显著差别。实验结果表明,炭疽吸附抗原免疫接种可使绝大多数人群获得特异性免疫改造,产生相应抗体。另外,对免疫方案也提出了初步意见。     

吗啡全抗原的制备及其免疫效果的评价

目的　制备吗啡及琥珀酰吗啡的全抗原 ,评价二种抗原诱导小鼠产生抗体效价的差异及其对吗啡致依赖的戒断症状的影响。方法　采用混合酸酐法制备琥珀酰吗啡 ,将吗啡及琥珀酰吗啡与BlueCarrier(BC)蛋白交联 ,与福氏佐剂等比例混合免疫小鼠 ;用ELISA法检测小鼠血清中抗体滴度 ;竞争性抑制实验检测抗体与吗啡的体外结合能力 ;观察免疫小鼠对吗啡的依赖能力。结果　二种交联物免疫小鼠第 9周血清中平均抗吗啡抗体滴度均超过 1∶80 0 0 ,其中M 6 S BC组效价强度较M BC组高 ,且效价维持时间较久 ;M BC组及M 6 S BC组与吗啡依赖组比较 15min内体重减轻、跳跃次数及潜伏期均有显著性差异 (P <0 .0 5 ,P <0 .0 1)。二组抗体对吗啡的抑制率能达 5 0 %以上。结论　二种载体蛋白交联物都能诱导小鼠产生高滴度的抗吗啡抗体 ,并使免疫小鼠对吗啡的成瘾性降低     

河豚毒素小鼠多克隆抗体的中和毒素效应及其活性-质量关系

目的:制备河豚毒素(TTX)的小鼠多克隆抗体,研究抗体中和TTX的效果,以探讨开发TTX抗素素的可能。方法:以中国鲎血蓝蛋白(TTH)为载体,通过甲醛与TTX化学连接,制成人工抗原(TTXTTH)并免疫BALB/c小鼠;以福氏佐剂诱导腹水抗体。酶联免疫分析方法检测血清和腹水抗体质量;将TTX与抗体在体外共温育而被中和,然后腹腔注射于KM小鼠,作体内攻毒实验,检验抗体的抗毒活性,并计算抗体的免疫当量。结果:经人工抗原免疫并福氏佐剂诱导,获得了20株具有不同亲和力的腹水抗体,与血清抗体具有同质性,其表观亲和力为10-4～10-7M。抗体可在体外和体内、完全或部分地中和毒素的毒性,有效保护中毒动物免于死亡。抗体体外中和毒素,最高可保护1.5×LD的TTX攻击,动物全部活存(1LD=14μg/kp,i.p.);抗体的最高免疫当量达1300μgTTX/L腹水;抗体的抗毒活性与抗体滴度、亲和力和质量因子显著相关(分别为P<0.05,P<0.01,P<0.001)。抗体在体内预防4d时,可保护1.3×LD的TTX攻击动物活存。结论:TTX小鼠腹水多克隆抗体可在体外和体内有效中和毒素,其抗毒活性依赖于抗体质量,提示了免疫防治对抗河豚毒素中毒的希望。研究提出的抗体“质量因子”是评价抗毒素质量的有效参数。     

河豚毒素抗毒疫苗不同免疫方案的免疫效果比较

以河豚毒素 (TTX)与中国鲎血蓝蛋白 (TTH)的化学偶联物TTX TTH免疫BALB/c小鼠。在免疫总剂量 (4 5 0 μg)相同时 ,比较长(L)、短 (S)不同免疫时间间隔 (分别为 14～2 0天和 7～10天 )对疫苗有效时间的影响 ,以血清抗体质量和抗TTX攻毒效果检验疫苗的效价。结果发现 ,S组比L组的抗体质量升速更快。L和S两组抗毒效价比较 :首次免疫后一年内 ,15次 (15×LD)攻毒 ,平均存活率分别为92 9%和 99 3% (P <0 0 1) ;半数动物存活时间分别为首次免疫后 11 3和 14 6个月。说明TTX的实验疫苗不同免疫方案均有效预防了TTX的攻毒 ,但短间隔比长间隔免疫产生更优的抗体质量 ,具有更高的抗毒时效性     

BALB/c小鼠格雷夫斯病模型的构建

目的 通过免疫电穿孔的方法,构建稳定的BALB/c小鼠（简称小鼠）格雷夫斯病（GD）模型.方法 制备重组质粒pcDNA3.1/TSHR268.将50只小鼠按随机数字表法分为实验组（30只）、对照组（10只）和空白组（10只）.分别于实验第1、4、7、10周在实验组小鼠双后肢腓肠肌注射重组质粒,在对照组及空白组小鼠相同位置注射相同体积生理盐水;实验组及对照组小鼠每次注射后在注射区域行电穿孔加强免疫.以放射免疫法检测小鼠血清T4,ELISA法检测小鼠TRAb氨基端（TRAb N）抗体和TRAb羧基端（TRAb C）抗体.对模型小鼠进行甲状腺^99Tc^mO4^-显像及甲状腺形态学、病理学分析.多组间均数比较采用单因素方差分析及最小显著差异t检验.结果 实验组建模成功率为80％（24/30）.24只成功建模的BALB/c小鼠血清T4由第0周的（16.06±5.16） nmol/L升高至第12周的（95.04±68.92） nmol/L（F=18.906,t=-5.598,P＜0.05）,TRAb N抗体由第0周的（0.006±0.002） U/L升高至第12周的（0.251±0.110） U/L（F=47.491,t =-10.869,P＜0.05）,TRAbC抗体由第0周的（11.176±2.635） ×10^3任意单位（AU）/L升高至第12周的（46.395±22.001）×10^3 AU/L（F=14.642,t=-7.787,P＜0.05）.停止免疫后的第18周,小鼠血清T4为（36.64±23.68） nmoL/L、TRAb N抗体为（0.094±0.053） U/L、TRAb C抗体为（24.456±6.725）×10^3 AU/L,均有所下降,但仍明显高于免疫前水平（t=-4.161、-8.085和-9.008,均P＜0.05）.对照组与空白组小鼠T4、TRAb N抗体及TRAb C抗体在免疫前后均未见明显变化.经过4次免疫,实验组小鼠甲状腺对^99Tc^mO4^-的摄取能力较对照组及空白组明显增强.GD模型小鼠甲状腺较正常BALB/c小鼠体积增大,病理学检查可见甲状腺组织淋巴细胞浸润.结论 重组质粒pcDNA3.1/TSHR268＋免疫电穿孔方法可成功构建BALB/c小鼠GD模型.     

棘球蚴基因工程疫苗免疫绵羊的保护效果观察

绵羊棘球蚴病是由棘球绦虫的幼虫感染绵羊所引起一种人兽共患病。该试验在新疆伊犁垦区用棘球蚴基因工程疫苗对8380只6～10月龄绵羊进行了两次免疫;免疫后用间接ELISA方法对不同时期采集的614份血清进行了抗体水平的动态监测;免疫后68周分别对随机挑选的30只免疫组羊和30只对照组羊进行了剖解检查。检测发现,免疫前抗体阳性率为0,首免第4周抗体阳性率达55.56%,随后进行二免,首免第6周～第22周血清样品抗体阳性率均在97%以上。剖解检查发现,免疫组羊细粒棘球蚴包囊感染率为3.33%,对照组感染率达46.00%。试验结果表明,该疫苗安全有效,对绵羊的棘球蚴感染具有很好的免疫保护效果。     

丙型肝炎病毒高变区1合成肽抗原性验证

设计合成丙型肝炎病毒高变区1合成肽,并验证其抗原性.应用计算机软件设计抗原肽,合成后免疫小鼠,检测小鼠血中抗体滴度;计算机模建抗原肽结构,预测其抗原性.7条合成肽中,计算机模建显示第4、5、6、7号肽具有较好的抗原性,酶联免疫吸附实验表明第4、6、7号肽可使机体产生抗体,抗原性较强,二者结果基本相符.     

肾综合征出血热病毒50K结构蛋白免疫学特性的初步研究(摘要)

以McAb亲和层析纯化的HFRS病毒50K结构蛋白免疫BALB/c小鼠,结果:第一次免疫后3周即有特异性抗体(包括中和抗体)被检出。抗体滴度随免疫进程而升高,第三次免疫后3周,其血清中和抗体滴度     

小鼠抗人Nanog多克隆抗体的制备及其鉴定

目的用基因免疫方法制备小鼠抗人Nanog多克隆抗体并进行鉴定。方法应用Accelrys软件分析Nanog抗原表位，选择其中免疫原性较强的抗原表位（A16-V101），从Nanog cDNA全长质粒中扩增其cDNA（258bp）序列，克隆到pBQAP-TT构建基因免疫载体，鉴定正确后与辅助载体pCMVi-GMCSF和pCMVi-Fh31。同时免疫小鼠，12周后用ELISA方法检测血清抗体滴度，Western blot方法鉴定抗体对人肾组织的特异性。同时将Nanog-AAV2病毒转染到HKC细胞，免疫荧光定位Nanog在细胞的表达。结果成功构建了Nanog基因免疫载体，经酶切及序列分析鉴定完全正确。ELISA结果显示抗体滴度为1：32000。Western blot结果显示小鼠抗Nanog多克隆抗体识别人肾组织34kD的Nanog蛋白。免疫荧光结果表明转染的Nanog基因主要表达在HKC细胞细胞核。结论用基因免疫的方法可以成功制备高效价和高特异性抗Nanog多克隆抗体。     

小鼠吸入性鼠疫病理学和毒力相关基因的体内转录

目的探讨吸入感染鼠疫的发生、发展过程及重要鼠疫菌致病相关基因的体内表达规律。方法采用滴鼻法建立小鼠吸入性鼠疫感染模型，并观察不同感染时间的组织病理学改变；采用免疫组化和逆转录一实时定量PCR方法检测感染小鼠组织中鼠疫菌5种毒力相关蛋白及其基因（cafl、lcrV、lcrG、pla、psaA）的表达和转录。结果鼠疫菌吸入后可诱导小鼠产生肺鼠疫型和非肺鼠疫型鼠疫。在小鼠体内感染状态下的鼠疫菌体表面能够检测到上述5种毒力相关蛋白的表达。其毒力基因的转录呈时相、组织差异性。结论在体内感染状态下，5种毒力相关蛋白均呈菌体表面可检测到的表达；各毒力相关基因在不同时间、不同组织中转录具有很大的差异性，这种差异性可能与其功能及宿主细胞的作用密切相关。     

鼠疫杆菌F1抗原结构基因caf1在酿酒酵母中的同源重组及初步鉴定

目的研究新型的防治鼠疫的基因疫苗。方法将鼠疫杆菌F1抗原结构基因caf1构建至pHSS6-mTn-3xHA／lacZ转座文库质粒中，将此重组质粒经Not Ⅰ酶切线性化，然后以醋酸锂法转化至酵母细胞中进行同源重组，再以尿嘧啶缺陷型培养基对阳性转化子进行筛选。结果转化子经菌落PCR方法分析鉴定，证明其为重组阳性转化子。结论以同源重组方式构建酿酒酵母表达系统，用以表达鼠疫杆菌F1表面抗原，为经消化道途径实现对鼠疫的基因防治创造条件。     

鼠疫耶尔森菌比较和进化基因组学研究

鼠疫菌是鼠疫的病原体,曾经引起3次世界范围的鼠疫大流行。从基因组角度认识鼠疫菌在不同疫源地的演化对鼠疫的检验、鉴定和防治具有重要意义。本文论述了目前对鼠疫菌基因组进化的认识,并讨论了这些研究成果的实际意义。     

鼠疫耶尔森菌活疫苗株的比较基因组学研究

目的揭示不同来源的鼠疫活疫苗株在基因组组成上的差异。方法以芯片比较基因组杂交为主要研究手段,结合PCR验证,对19株鼠疫活疫苗株进行比较基因组分析。结果鼠疫活疫苗株基因组中缺失了大量基因,但也有某些大片段基因的拷贝增多。结论不同来源的疫苗株在基因组组成上存在差异,构成了不同疫苗株的表型与使用效果具有差异性的遗传基础。     

鼠疫耶尔森菌的研究及其军事医学意义

随着军事医学的发展,防生物危害医学学科研究的范畴应当包括目前认识到的所有可以导致生物危害的领域,包括生物战、生物恐怖、外来有害生物入侵、生物资源流失、转基因生物安全和研发、突发疫情的应对研究等.鼠疫耶尔森菌是导致自然疫源性疾病鼠疫的病原菌,也是重要的生物战和生物恐怖剂之一,历史上曾3次导致世界鼠疫大流行,多次被用于战争,并多次在战争中导致军队感染.目前鼠疫主要分布在亚洲、非洲、美洲及俄罗斯地区,我国现有12种类型的鼠疫自然疫源地,分布在19个省(区),占国土面积的15％左右,疫情监测结果表明,疫区动物鼠疫自然疫源地异常活跃,面积不断扩大,逐渐向城市逼近,防治形势严峻.2001年美国“9·11”恐怖袭击后,鼠疫耶尔森菌的研究方兴未艾,其中很多研究进展对其他生物恐怖剂的研究具有借鉴意义.微生物法医学溯源数据库的建立及其检测新技术的研究进展为生物恐怖剂的溯源和应急处置提供了很好的经验.     

The clinico-immunological validation of associated immunization]

Clinico-immunological studies on men were conducted using associated immunization by pair combinations of 8 commercial national vaccines (typhoid, plague, typhus, smallpox, tick-borne encephalitis, yellow-fever, cholera and sextaanatoxine). As for reactogenicity and immunological efficiency (serological studies), these pair associations can be subdivided into three main groups. The first group consists of pair combinations of vaccines that cannot exert any influence on immunogenicity of cause the development of frequent post-vaccination reaction or temporary disability (typhus, smallpox, tick-borne encephalitis, yellow-fever vaccines). These preparations are completely compatible in every combination. The second group includes plague and cholera vaccines that reduce its immunogenicity under the influence of more active antigens or increase its reactogenicity being associated with typhoid vaccine or sextaanatoxine. The third group is composed of typhoid vaccine and sextaanatoxine that have high reactogenicity and stable serological shifts. Associations of the first group are the most favourable for anti-epidemiological practice.     

温度和酸度对田鼠型鼠疫耶尔森菌psa位点的转录调控研究

目的研究温度和酸度对田鼠型鼠疫耶尔森菌psa位点的转录调控作用。方法首先设计相关跨基因引物,用RT-PCR方法验证psa位点的相关操纵子结构。扩增操纵子首基因上游启动子区500 nt序列,并克隆入pRW50质粒β-半乳糖苷酶基因的上游,将重组质粒转入鼠疫菌中,通过测定β-半乳糖苷酶活性差异来判断不同温度（26和37℃）和酸度（pH 6.0和pH 8.0）对psaE和psaA的调控关系。最后提取鼠疫菌在上述不同温度和酸度条件下的总RNA,采用引物延伸实验进一步明确温度和酸度对psaA的调控关系。结果与结论 RT-PCR结果证实了田鼠型鼠疫菌的psa位点由操纵子psaEF和psaABC构成;半乳糖苷酶和引物延伸实验结果显示在37℃、pH 6.0培养条件下psaABC的转录水平最高,而psaEF的转录水平无明显变化,提示psaA的表达水平在37℃酸性条件下表达量最高,psaE则不受温度和酸度的调控。     

鼠疫耶尔森菌DNA标识序列的鉴定及其应用研究

目的确定鼠疫耶尔森菌DNA标识序列,以用于鼠疫耶尔森菌的快速检测和鉴定。方法通过芯片比较基因组杂交和PCR验证,鉴定鼠疫耶尔森菌DNA标识序列,针对标识序列设计特定的PCR引物。结果鼠疫耶尔森菌基因组中存在3个区段,共28条基因,均是鼠疫耶尔森菌DNA标识序列。针对其中3条基因设计PCR引物,能特异性扩增出鼠疫耶尔森菌,与来自其他非鼠疫耶尔森菌的DNA无交叉反应。结论鼠疫耶尔森菌存在DNA标识序列,并能用于鼠疫耶尔森菌的快速检测与鉴定。     

鼠疫耶尔森菌基因组进化与生态位适应研究

目的 探索鼠疫耶尔森菌基因组进化的基本规律及其与该菌在自然界适应性演化之间的内在联系。方法 对36株鼠疫耶尔森菌和7株假结核耶尔森菌进行芯片比较基因组分析,鉴定差异区段(DFR),并对260株鼠疫耶尔森菌进行PCR验证,分析各DFR在这些鼠疫耶尔森菌中的分布,同时进行基因组岛分析。结果 在鼠疫耶尔森菌基因组中鉴定出22个DFR,基于DFR图谱,将鼠疫耶尔森菌中国分离株分成14个基因组型。鼠疫耶尔森菌共有21个基因组岛,其中18个已存在于假结核杆菌中,余下3个为鼠疫耶尔森菌独有。结论 探明了各基因组岛在鼠疫耶尔森菌和假结核耶尔森菌间的差异分布,探究了鼠疫耶尔森菌的起源进化;建立了鼠疫耶尔森菌基因组分型系统;建立了各基因组型别间的系统发育关系,初步揭示了鼠疫耶尔森菌基因组的进化规律及其与鼠疫耶尔森菌生态位适应和鼠疫疫源地扩展之间的关系,基本探明了鼠疫耶尔森菌在中国的演化规律。     

应用抑制消减杂交技术研究鼠疫菌与假结核菌基因组之间的差异

目的：研究古典型鼠疫菌与假结核菌ATCC29833基因组间的差异，为进一步认识鼠疫菌的起源与进化奠定基础。方法：通过抑制消减杂交技术比较两种细菌基因组间的差异。结果：与已测序的3株鼠疫菌基因组进行同源性比较，发现了259个假结核菌基因组中存在的特异序列，与基因库进行同源性比较发现了10个假结核菌ATCC29833基因组中存在的新序列。结论：抑制消减杂交技术是一个简单而有效的比较近源微生物基因组之间差异的方法，鼠疫菌在进化过程中失去了大量的基因，假结核菌基因组之间也存在着一定的差别。