羊膜载体复合膜负载骨髓间充质干细胞促愈创面的研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)促进创面愈合的作用和用于创面修复的可行性,为组织工程化皮肤提供新的种子细胞来源.方法 自体来源的骨髓,经体外培养并纯化MSCs,应用5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记技术进行标记,以羊膜载体复合膜为载体植入兔背部左侧全层皮肤缺损创面(治疗组),右侧全层皮肤缺损创面仅植以羊膜载体复合膜(对照组).于术后1,2周观察创面收缩率,记录愈合时间;术后4,5周切取创面中央再生皮肤组织,行病理和BrdU免疫组织化学染色检测,进行比较.结果 创面收缩率,治疗组>对照组(P<0.05),愈合时间,治疗组<对照组(P<0.05).常规病理检测治疗组再生皮肤表皮层明显增厚,细胞数目显著增多.免疫组化检测,在治疗组再生皮肤附件毛囊内层以及表皮基底层可见BrdU阳性标记细胞.结论 MSCs自体移植在一定程度上可以显著提高创面愈合的质量,为皮肤损伤由解剖重建到功能修复的完美愈合提供了新的治疗思路.     

骨髓问充质干细胞对大鼠损伤汗腺的修复性研究

目的探讨皮肤汗腺受损后骨髓间充质干细胞对其的修复效果。方法大鼠骨髓间充质干细胞体外分离、培养、标记。机械损伤大鼠脚掌汗腺,干细胞治疗组于创面周围皮下注入MSCs,对照组注射相同剂量PBS,分别比较两组的创面愈合率及再生上皮的厚度,观察MSCs参与受损汗腺修复的情况。结果7d时干细胞治疗组的创面愈合率及14d时的表皮再生厚度均优于对照组（P〈0．05）;BrdU标记的MSCs参与了损伤汗腺导管部的修复。结论骨髓间充质干细胞有利于创伤皮肤的修复并可能参与损伤汗腺的修复。     

骨髓间充质干细胞促进皮肤创伤愈合的研究

目的:探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)在组织工程皮肤修复创面缺损中的作用.方法:以标记了PKH26的MSCs为种子细胞构建组织工程皮肤,修复皮肤缺损,HE染色和免疫组织化学染色观察愈合效果,荧光检测追踪细胞转归.结果:移植2 wk后实验组创面基本愈合,愈合时间明显快于对照组,6 wk时仍可检测到红色荧光标记的骨髓间充质干细胞,免疫组织化学染色显示角蛋白和Ⅰ型胶原表达阳性.结论:含有MSCs的组织工程皮肤移植后促进创面愈合,骨髓间充质干细胞在皮肤创伤愈合中起了重要作用,可作为组织工程领域中理想的种子细胞.     

骨髓间充质干细胞促进损伤汗腺修复的实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)分化为创面皮肤汗腺细胞的可能性及其参与创面修复的可能机制。方法无菌条件下取雄性Wistar大鼠(6只)股骨骨髓细胞,分离、纯化、体外扩增培养MSCs后,应用溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记技术标记细胞。雄性Wistar大鼠(30只)正常喂养1周后按随机数字表法分为2组:模型组和对照组(各15只),模型组大鼠背部正中,制备1cm×1cm全层皮肤缺损创面。从对照组和模型组大鼠尾静脉输注BrdU标记的MSCs(5×106 mL-1)0.1mL;术后第7天与第10天切取创面组织,采用PowerVisionTM免疫组织化学染色法检测BrdU。结果在创面皮下汗腺导管周围发现BrdU阳性细胞,且汗腺中也有呈现BrdU阳性的细胞。结论创面愈合过程中,MSCs归巢并参与创面修复;在创面微环境下,MSCs可分化为汗腺细胞,并参与创面修复。     

脱细胞真皮联合骨髓间充质干细胞修复糖尿病大鼠皮肤全层缺损创面的研究

目的研究以骨髓间充质干细胞为种子细胞、脱细胞真皮为支架的组织工程皮肤对糖尿病大鼠皮肤全层缺损创面愈合的影响。方法 36只大鼠随机分为3组,A组：骨髓间充质干细胞＋脱细胞真皮实验组;B组：脱细胞真皮对照组;C组：空白对照组。观察创面愈合及5-BrdU阳性细胞表达角蛋白的表达情况。结果 A组第3、5、7及14 d创面愈合率分别为（19.10%±3.52%）、（29.80%±4.10%）、（56.71%±8.07%）与（88.12%±5.31%）,明显快于B、C两组（P〈0.05）。A组新生皮肤的细胞结合有序,排列紧密,真皮层较厚,有大量皮肤附属器及血管形成,明显多于B、C两组。免疫组化检测BrdU阳性细胞表达角蛋白。结论骨髓间充质干细胞联合ADM可有效促进糖尿病大鼠创面的愈合。     

骨髓间充质干细胞治疗皮肤深Ⅱ度烧伤的实验研究

目的：观察骨髓间充质干细胞（MSCs）对皮肤深Ⅱ度烧伤的疗效。 方法：体外培养扩增雄性豚鼠骨髓MSCs,以2×10⁶•mL^-1、2×10⁷•mL^-1细胞密度,移植给皮肤深Ⅱ度烧伤的雌性受体鼠创面,对创面的愈合面积进行计算,用HE、Masson染色进行组织形态学观察。 结果：治疗组的皮肤创面修复较好,HE染色结果显示治疗组的真皮与表皮结构清晰,表皮各层清楚,而对照组的皮肤创面细胞各层次不清楚。Masson染色结果显示治疗组皮肤创面新生被覆上皮内,胶原纤维排列较整齐;对照组胶原增粗、排列不规则。2×10⁶•mL^-1、2×10⁷•mL^-1不同细胞密度的治疗侧之间比较差异无显著性。 结论：骨髓MSCs可促进皮肤深Ⅱ度烧伤的愈合,对皮肤深Ⅱ度烧伤具有明显的疗效。     

骨髓间充质干细胞自体移植提高猪皮肤创面修复质量的初步研究

目的　探讨骨髓间充质干细胞 (MSCs)局部移植对提高猪皮肤烫伤创面组织修复质量的作用 ,为临床皮肤损伤后功能性修复提供新的治疗方法。方法　抽取 6只小型香猪的骨髓 ,经体外培养并纯化MSCs,应用 5 溴脱氧尿嘧啶 (BrdU)标记技术进行标记。猪背部皮肤中线两侧各制备 6个面积为 2 5 4cm2 的深Ⅱ0 烫伤创面 ,将已标记的MSCs( 2× 10 6)以注射方式回植到提供骨髓猪的创面下 ,将创面随机分为 6组 ,即空白对照组、MSCs治疗组、MSCs 碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)治疗组、bFGF治疗组、MSCs 表皮细胞生长因子 (EGF)治疗组以及EGF治疗组。分别于伤后 7、14、2 1、4 2d采用大体观察、常规组织学检查、免疫组织化学及免疫荧光化学染色动态观察创面愈合情况。结果　实验猪皮肤烫伤后 7d开始 ,各组创面逐渐缩小 ,伤后 2 1d ,大部分创面愈合。虽然不同时间点各治疗组创面面积缩小率差异无显著意义 ,但以MSCs bFGF治疗组最为明显 ,伤后第 14天和 2 1天创面缩小的面积比其他 5组大 15 %～ 2 0 %。半定量评价结果显示MSCs bFGF治疗组肉芽组织中血管密度较大 ,为 ,而其他组别仅为 ～ 。再上皮化的新生表皮在MSCs bFGF治疗组较其余 5组厚 ,并有上皮角形成。半定量分析可见神经纤维在MSCs bFGF治疗组较其他 5     

骨髓间充质干细胞促进大鼠皮肤创面愈合的作用及机制研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)对大鼠皮肤创面的促愈作用及机制,为临床皮肤损伤修复提供新的治疗方法.方法 建立大鼠背部皮肤全层切割伤模型,将大鼠分为2组:空白对照组,MSCs处理组,分别于伤后3、6、9、12 d采用大体观察,常规组织学检查观察2组大鼠背部皮肤伤口愈合状况及RT-PCR观察转化生长因子(TGF-β1)、表皮生长因子(EGF)mRNA在愈合中的变化特点.结果 MSCs处理组大鼠皮肤愈合快,愈合指数高,创伤后第3天MSCs处理组大鼠皮肤TGF-β1上调明显,第6天EGF上调明显.结论 MSCs能促进大鼠皮肤创面愈合,其机制可能与其引起各种生长因子的合成和分泌有关.     

表皮干细胞复合羊膜构建组织工程皮肤修复糖尿病难愈创面

目的探讨表皮干细胞复合羊膜构建组织工程皮肤修复糖尿病难愈创面的可行性和方法。方法分离培养SD大鼠皮肤表皮干细胞(ESCs),并用5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记。建立糖尿病SD大鼠创面模型,随机分为A、B、C 3组,A组创面移植羊膜负载BrdU标记的ESCs组织工程皮肤;B组创面移植羊膜;C组为空白对照组,创面未给予干预。观察创面愈合情况、计算创面愈合率,HE及免疫组织化学SP法检测创面愈合组织中BrdU及增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。用图像分析软件测量阳性细胞积分光密度平均值。结果与B、C组比较,A组创面愈合速度加快,创面愈合率明显增高,组间比较差异有显著性统计学意义(P0.01)。A组创面及新生表皮中可见BrdU阳性细胞,B、C组皮肤创面组织中始终未见BrdU阳性细胞。各组创面组织中可见PCNA阳性细胞表达,但A组的阳性细胞积分光密度值与B、C组比较差异显著(P0.01)。结论表皮干细胞复合羊膜构建组织工程皮肤可有效促进糖尿病创面愈合。     

兔骨髓间充质干细胞体外BrdU标记的实验研究

目的 探讨体外5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyuridine, BrdU)标记兔骨髓间充质干细胞 (bone marrow-derived mesenchymal stem cells, MSCs) 的方法,探索BrdU体外标记兔MSCs的最佳时间和最佳浓度。方法 通过形态学及流式细胞术鉴定全骨髓培养法分离培养的细胞为MSCs。MSCs经不同BrdU浓度标记及不同BrdU标记时间, 免疫细胞化学法鉴定并评估。结果 全骨髓培养法培养的MSCs经流式细胞术检测,证明所培养的细胞为较纯的MSCs。BrdU标记的阳性细胞率随标记时间延长以及标记物BrdU的浓度增加而逐渐增高, 40μmol/L及72h标记阳性率达85-95%。结论 应用BrdU体外标记MSCs是安全可靠的,兔MSCs体外BrdU标记最佳时间和最佳浓度分别为72h和40μmol/L。     

骨髓间充质干细胞-聚乳酸聚乙醇酸共聚复合物支架修复组织损伤的实验研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞-聚乳酸聚乙醇酸共聚复合物（PLGA）的构建及对损伤组织的修复效果。方法 （1）分离培养新西兰幼兔骨髓间充质干细胞（MSC）,4,6联脒-2苯基吲哚（DAPI）标记后接种于PLGA支架上。扫描电镜和免疫荧光显微镜观察不同时间段MSC在支架上的生长情况。（2）分别将MSC-PLGA复合物及PLGA支架移植于新西兰大白兔背部皮肤创面。术后观察创面愈合情况,5周后取移植物行HE染色、VG染色及细胞角蛋白AE1／AE3免疫荧光组化检测。结果 MSC在支架上生长良好,细胞数量随时间增长而逐渐增加,第10天细胞达到90％融合。MSC-PLGA复合物所修复创面,随着聚合材料的降解,逐渐形成新生皮肤,HE染色及VG染色示新生皮肤与正常皮肤结构相似,且荧光显微镜下可见胞核呈蓝色荧光的角化层细胞及毛囊细胞,其胞浆同时表达角蛋白。PLGA支架所修复创面则新生皮肤仅见少量毛囊,并见增厚的纤维瘢痕。结论 骨髓间充质干细胞复合PLGA聚合物是良好的移植替代物。     

骨髓间充质干细胞对合并局部放射损伤创面促愈作用及机理研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC)对合并局部放射损伤难愈性创面的作用及其机理研究。方法 成年健康贵州小香猪8只,3%戊巴比妥钠静脉麻醉,电子线照射脊柱两旁皮肤,深度1cm,立即在受照射创面打孔,直径2cm,每侧8-10个,一侧为对照组,局部注射生理盐水,一侧为MSC组,局部注射自体MSC,采用早期贴壁法分离小香猪骨髓MSC,将自体的MSC移植到局部合并20Gy的放射损伤创面,采用激素共聚焦,胶原定量EISA,细胞划痕实验,RT-PCR等方法,观察了MSC对合并放射损伤创面,采用激光共聚焦,胶原定量,ELISA,细胞划痕实验,RT-PCR等方法,观察了MSC对合并放射损伤创面的促愈作用及其促愈的机理。结果 将自体的MSC移植到局部合并20Gy创面后能加快创面愈拿 速度,使愈合的时间比对照组提前了3-4d,肉芽组织形成丰富,胶原合成增加,其促愈的机理与MSC分泌IL-8,IL-6,G-CSF等细胞因子吸引和趋化炎症细胞和修复细胞向创面迁移,启动修复,增加伤口中修复细胞（成纤维细胞,血管内皮细胞）的数量有关,同时MSC在创伤局部微环境的作用下,基因和蛋白表达发生变化,尤其是I型胶原基因表达和蛋白合成增加,提示在局部微环境作用下,MSC可分泌细胞外基质或/和直接分化为成纤维细胞参与组织的修复。结论 MSC对局部合并放射损伤的创面有明显有效的促愈效应,MSC的促愈作用是在干细胞与创伤局部微环境相互作用下实现。     

创面愈合过程中创缘表皮干细胞的再分布

目的：研究皮肤干细胞在全层皮肤创面愈合过程中的分布与增殖分化特征,以及该特征在创面愈合过程中的作用。方法：20只Wistar大鼠背部各制备4个面积为2．54cm^2的全层皮肤缺损创面,将创面随机分为2组,即银锌霜治疗组（40个创面）,空白对照组（40个创面）。分别于伤后3天、1周、2周和3周以组织学检查动态观察各组治疗效果,并以β1整合素、角蛋白19（K19）免疫组化法检测表皮干细胞在创面愈合过程中的分布情况。结果：两组创面愈合率在银锌霜组为80％（32／40）,对照组为60％（24／40）。两组创面肉芽组织于各时相点均未见β1整合素、K19阳性细胞出现,但于创缘表皮的棘层或颗粒层出现了散在的β1整合素和K19同时染色阳性细胞,且越接近创面这些阳性细胞更加密集,组织学上与基底层的阳性细胞无直接联系。其数量随着创面的缩小渐渐增加,直至创面愈合。创面上皮化后,这些阳性细胞逐渐减少,并随着愈合创面表皮脚的出现而消失;而感染创面的阳性细胞数量明显少于未感染创面。结论：表皮干细胞能动的参与创面的修复,创缘表皮干细胞再分布的主要功能可能是促进创面再上皮化。     

HLA—A2表达沉默的MSCs对兔桡骨缺损修复的影响

目的探讨沉默人白细胞抗原-A2（HLA-A2）基因后的骨髓间充质干细胞（MSCs）对兔桡骨缺损修复的影响。方法将HLA-A2沉默后的MSCs经体外诱导成骨后,与羟基磷灰石（HA）复合培养,形成MSCs/HA复合体,并植入骨缺损中。将日本大耳白兔24只分为2组：HLA-A2沉默后的MSCs/HA复合体修复桡骨缺损为实验组（n=12）,自体MSCs/HA复合体修复桡骨缺损为对照组（n=12）。于术后2、4、8周比较两组饮食与伤口的愈合情况、X线检测、HE染色结果,综合评价HLA-A2沉默后的MSCs/HA复合体对桡骨缺损修复的影响。结果实验组和对照组的伤口无明显渗出、红肿,愈合好;X线结果显示,2、4周骨缺损处有纤维骨痂形成,8周骨缺损处密度增高,骨痂形成;两组细胞钙结节数量、X线评分、组织学评分比较差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 HLA-A2沉默后的MSCs免疫原性低,不影响其成骨能力及骨缺损的愈合,为同种异体骨缺损修复提供了新的依据。     

兔骨髓间充质干细胞自体移植治疗急性心肌梗塞

目的 :了解骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstemcells ,MSCs)在缺血心肌中转化为心肌细胞并改善心功能的可行性。方法 :结扎兔左前降支制作急性心肌梗塞 (acutemyocardiuminfarction ,AMI)模型 ,骨穿抽取骨髓 ,分离、培养、扩增骨髓间充质干细胞。术后 2周进行心肌梗塞瘢痕处移植 5 溴脱氧尿嘧啶 (Bromodeoxyuridine,Br dU)标记的骨髓间充质干细胞 ,对照组注射培养基。AMI术前、AMI术后 3d及移植后 4周做超声心动图检测心功能 ,移植后 4周用导管检查法测左室压力变化 ,随后处死动物取左室标本切片 ,采用免疫荧光方法鉴定植入细胞。结果 :细胞移植组左室切片中可见BrdU染色阳性细胞即植入细胞 ,对照组未见BrdU染色阳性细胞。超声心动图检查证实MSCs移植后 4周左室收缩末期直径 (LVESD)、舒张末期直径 (LVEDD)均小于对照组 (分别为P <0 .0 1及P <0 .0 5 ) ,小轴缩短率 (△D % )、射血分数 (EF)均大于对照组 (均为P <0 .0 1 )。导管测压显示MSCs移植组左室舒张末期压 (LVEDP)低于对照组、左室压上升及下降最大速率 (±dp/dt)高于对照组 (均为P <0 .0 1 )。 结论 :缺血心肌内注射骨髓间充质干细胞可依赖组织微环境转化为心肌细胞修复梗塞心肌 ,显著改善心功能 ,可用于心肌梗塞的治疗。     

骨髓间充质干细胞向肺泡细胞转化的实验研究

目的通过观察外源性骨髓间充质干细胞（MSC）的肺脏迁移及分化情况,探讨MSC治疗肺纤维化的细胞学机制。方法体外分离、培养雄性Wistar大鼠的MSC。将60只雌性Wistar大鼠随机分为4组,A组制备博莱霉素致肺纤维化模型;B组和C组分别于博莱霉素注射后,立即和7 d后通过尾静脉注入5-溴-2-脱氧尿苷（BrdU）标记的雄鼠MSC液0.5 mL（含细胞数2.5×106个）;D组造模后,立即注入未标记的等量雄鼠MSC液,作为阴性对照。提取肺组织的DNA,通过聚合酶链反应（PCR）检测雄性鼠的性别决定基因（sry基因）,以判断外源性MSC是否存在于雌性鼠肺组织中;留取肺组织、新鲜提取的骨髓干细胞和培养至第5代的MSC行BrdU和肺表面活性蛋白C（SP-C）的双重免疫荧光染色,通过逆转录PCR（RT-PCR）检测其是否表达SP-C mRNA和水通道蛋白5（AQP-5）的mRNA,观察MSC移植前后的分化情况。结果造模后立即和7 d后移入雄性MSC的雌性鼠肺组织均可表达sry基因,且肺组织中的MSC可转化为Ⅱ型肺泡上皮细胞（AECⅡ）,并具备AECⅡ的形态学特征和分子生物学表型,但立即移入组明显好于7 d后移入组（P〈0.01）。新提取的骨髓干细胞和培养至第5代的MSC表达SP-C mRNA,而不表达AQP-5 mRNA,且SP-C的免疫荧光染色阴性。结论外源性MSC可移入到损伤的肺组织内并转化为AECⅡ,而且早期移入更显著。这种分化潜能在骨髓阶段已具备,但要到损伤的微环境下才能发生转化。