PLAGL2对SP-C基因表达的调控及其机制的初步研究

目的研究多形性腺瘤样因子2（pleiomorphic adenoma gene like -2, PLAGL2）对肺表面活性蛋白C基因（surfactant protein-C，SP-C）表达的影响及调控机制。方法通过定点诱变技术分别突变掉SP-C基因启动子上PLAGL2的结合位点以及PLAGL2的第6、7位锌指结构域并获得相应的突变体；利用细胞共转染和荧光素酶报告基因检测技术研究PLAGL2对SP-C基因启动子表达活性的影响及比较正常及突变体的PLAGL2或SP-C基因启动子之间相互作用的差异以明确PLAGL2对SP-C基因的调控及作用靶点。结果细胞共转染试验中，荧光素酶活性检测结果表明PIAGL2可明显增加SP-C基因的表达（P〈0．001），SP-C基因表达活性的增高与PLAGL2的作用浓度呈正相关；当定点诱变掉PLA-GL2的第6或7位锌指结构域后，PLAGL2的突变体质粒均不能增高SP-C基因的表达活性，与对照组相比较，差异具有显著性（P〈0．001）；同样，当定点诱变掉PIAGL2在SP-C基因启动子上的结合位点后，PLAGL2也不能增高SP-C基因启动子突变体质粒的表达活性，与对照组相比较，两者具有明显差异（P〈0．01）。结论在肺Ⅱ型细胞中，PLAGL2通过其第6和7位锌指结构域结合于SP-C基因启动子上的PLAGL2结合位点序列来促进SP-C基因的表达。     

PLAGL2与SP-C基因启动子相互作用的研究

目的研究PLAGL2(pleiomorphic adenoma gene like-2,PLAGL2)对SP-C基因(surfactant pro-tein-C,SP-C)启动子的结合与影响作用。方法定点诱变技术(site-directed mutagenesis)及凝胶电泳迁移实验(electrophoresis mobility shift assay,EMSA)研究PLAGL2与SP-C基因启动子之间的相互结合作用;体外培养MLE12细胞共转染和荧光素酶报告基因活性值检测技术,研究PLAGL2对SP-C基因启动子表达活性的影响;结果EMSA及竞争性EMSA实验表明:PLAGL2能通过其核心和簇结合位点序列与同位素标记的SP-C基因启动子片段相结合形成蛋白-DNA复合物;细胞共转染及荧光素酶报告基因活性值检测结果显示:PLAGL2能明显促进SP-C基因启动子的表达。结论在肺Ⅱ型细胞中,PLAGL2能与SP-C基因启动子相互作用并促进其表达。     

应用噬菌体展示技术筛选干扰素β基因启动子DNA结合蛋白的基因

目的 筛选干扰素β（IFN-β）启动子DNA结合蛋白的基因，探讨IFN-β基因调节的分子生物学机制。方法 应用噬菌体展示技术，以IFN-β启动子DNA的聚合酶链反应（PCR）产物作为固相筛选分子，对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行5轮“吸附-洗脱-扩增”的生物筛选过程，噬斑PCR扩增后，对所筛选克隆进行DNA序列测定和生物信息学分析。结果 噬菌体经富集后，随机挑选52个克隆，序列测定后经过同源性搜索，确定与IFN-β启动子具有结合作用的肝细胞蛋白有6种，包括谷胱甘肽S-转移酶（GST），淀粉酶突变体蛋白，锌指蛋白等与细胞发育和代谢有关的蛋白。结论 IFN-β启动子DNA与肝细胞中多种蛋白类型结合，为研究IFN-β基因在肝细胞中的表达调控奠定了基础。     

乙型肝炎病毒剪接特异性蛋白对病毒自身调控序列的影响

目的 研究双剪接型2.2 kb乙型肝炎病毒(HBV)剪接变异体特异性蛋白TPds对病毒自身调控序列的影响.方法 PCR扩增6种HBV启动子/增强子序列,以Kpn Ⅰ及Xho Ⅰ位点克隆于pGL3-basic,分别构建萤火虫荧光素酶重组报告载体pGL3-BCP(含HBV基本核心启动子)、pGL3-CP1601(含增强子Ⅱ的核心启动子)、pGL3-XP(X基因最小启动子)、pGL3-XP1071(含增强子Ⅰ的X基因启动子)、pGL3-SP1(表面抗原大蛋白基因启动子)、pGL3-SP2(表面抗原中蛋白基因启动子).以FuGENE6将TPds表达载体pcDNA3.1/HisC-TPds或空白载体pcDNA3.1/HisC分别与6种HBV启动子/增强子报告载体共转染Huh7细胞,转染后48 h裂解细胞并检测胞内萤火虫荧光素酶活性,实验重复5次,数据以SPSS11.5软件分析.结果 在一定的质量比值范围内,与pcDNA3.1/HisC空白载体对照相比,pcDNA3.1/HisC-TPds分别与pGL3-CP1601、pGL3-XP1071、pGL3-SP1、pGL3-SP2共转染后,Huh7细胞内萤火虫荧光素酶活性增高,而pcDNA3.1/HisC-TPds分别与pGL3-BCP或pGL3-XP共转染后,胞内荧光素酶活性无变化.结论 TPds蛋白可反式激活HBV启动子SP1、SP2和增强子Ⅰ、Ⅱ,对基本核心启动子和X基因最小启动子无影响.     

人工锌指蛋白(ZFP)的设计及原核表达分析

本实验通过生物信息学手段人工设计了与A20基因启动子区特定靶序列特异作用的锌指蛋白结合域.首先对A20基因启动子进行了结构及功能分析,把经过分析获取的A20启动子区的目标序列提交Scrips研究院的ZF Tools在线服务器,经序列比较,成功获取了A20启动子区特定的18 bp靶序列及与这一靶序列特异性作用的锌指蛋白的氨基酸序列.进一步利用生物信息学手段对获取的锌指蛋白进行了序列特征分析及结构模建.把锌指蛋白的DNA优化序列重组于原核表达载体pTYB11上,并成功进行了原核表达.研究表明,利用生物信息学手段,人工设计特定的锌指蛋白可行,为进一步设计完整的人工转录因子,进而干预A20基因的表达奠定了基础.     

C/EBPα参与小鼠胰岛β细胞囊泡谷氨酰胺转运子2基因表达的调控

目的:探讨转录调节因子CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)在小鼠胰岛β细胞株MIN6的囊泡谷氨酰胺转运子2(VGLUT2)基因表达过程中的调控作用。方法:克隆小鼠VLGUT2基因的启动子区,并对其中C/EBPα的结合位点进行了核酸定点突变,以荧光素酶活力方法观察突变后的启动子活性改变情况。通过电泳迁移率实验(EMSA)检测C/EBPα与含有小鼠VGLUT2启动子区核酸序列的核苷核探针的结合能力,以CEBPαsiRNA特异性抑制转录调控因子C/EBPα的基因表达,通过荧光素酶,RT-PCR和Western blotting方法观察抑制C/EBPα基因表达后小鼠VGLUT2的基因表达情况。结果:在对小鼠VGLUT2启动子区C/EBPα结合位点进行核酸定点突变后,小鼠VGLUT2启动子活性下降约50%,EMSA实验表明C/EBPα可与小鼠VGLUT2启动子区结合,当以C/EBPαsiRNA特异性地下调C/EBPα的表达时,小鼠VGLUT2的启动子活性、mRNA和蛋白水平也相应各自下降约60%、40%及45%。结论:C/EBPα参与了小鼠VGLUT2的基因表达调控。     

小鼠CD86基因启动子的构建及活性分析

为构建小鼠CD86启动子,并对其特异性调控能力进行鉴定。首先自C57BL/6J小鼠基因组中采用高保真PCR扩增小鼠CD86基因的启动子,经测序鉴定后,插入pCDNA3.1-EGFP重组质粒。然后分别转染小鼠来源细胞株:RAW264.7、NIH/3T3、P815、SP2/0、EL4细胞,观察各细胞内绿色荧光蛋白的表达。结果显示,小鼠CD86基因启动子的序列与GenBank报道一致;双酶切鉴定证实小鼠CD86启动子序列已经克隆入重组载体;小鼠CD86启动子能调控EGFP在巨噬细胞系RAW264.7细胞中表达,不能调控EGFP在NIH/3T3、P815、SP2/0和EL4非抗原提呈细胞内表达。说明成功构建小鼠CD86基因启动子,且该启动子具有特异性调控目的基因表达的活性。     

人乳头瘤病毒16型E6和E7基因突变体表达蛋白的稳定性和抗原性分析

目的 筛选适合于宫颈癌治疗性疫苗研制的人乳头瘤病毒16型（HPV16）E6和E7突变基因。方法 采用定点诱变技术对E6和E7基因进行改造，得到几种E6和E7基因的突变体；构建成表达野生型和突变型E6与E7的重组痘苗病毒，对这些重组痘苗病毒表达的E6和E7蛋白的稳定性及其免疫原性进行了比较研究。结果 E6蛋白第50位氨基酸的突变、E7蛋白第24和26位氨基酸的突变都不影响蛋白的稳定性和抗原性，但E7蛋白第91位氨基酸的突变使E7蛋白的稳定性和抗原性大大减弱。结论 证实了E7蛋白C－末端的锌指结构对E7蛋白结构的完整性和稳定性是非常重要的。     

YY1蛋白对HPV16启动子P97的抑制效应依赖于上游的增强子序列

目的　观测位于HPV16LCR序列YY1结合位点上游的组织特异性增强子序列对YY1蛋白的启动子P97抑制作用的影响。方法　构建带有不同长度的HPV16野生株、启动子远端YY1位点突变株、启动子近端YY1位点突变株的 5′端LCR缺损序列的荧光素酶报导质粒 ,以及不同长度的近端YY1/SP1重叠结合位点基因工程突变LCR的荧光素酶报导质粒 ;将各种质粒转染到人类子宫颈癌细胞系C33A中 ,检测在不同LCR序列的控制下对病毒启动子P97的活性的影响。结果　去除上游增强子序列后 ,远端YY1位点突变的P97激活作用完全消失 ,近端YY1位点突变的P97激活作用部分丧失。不同长度的近端YY1/SP1重叠位点基因工程突变LCR对P97活性的影响不受上游启动子序列的控制。结论　YY1蛋白对启动子P97的抑制效应受位于其上游序列的增强子的控制     

NF-κB结合位点在NOD2基因调控中的作用

目的 探讨NF-κB结合位点在NOD2基因调控中的作用.方法 以人基因组DNA为模板,PCR扩增含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子序列,以切除启动子的pEGFP-N3作为框架结构,将这段序列进行酶切并定向克隆入表达载体pEGFP-N3中,构建含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子驱动的绿色荧光蛋白(GFP)载体,将构建的重组质粒经脂质体LipofectAMINETM2000介导瞬时转染HeLa细胞,在倒置荧光显微镜下观察其能否在NOD2基因启动子的调控下表达报告基因GFP.用突变试剂盒将重组质粒pEGFP-N3-NOD2wt中的NF-κB结合位点缺失突变,将构建的突变重组质粒mpEGFP-N3-NOD2瞬时转染HeLa细胞,观察绿色荧光蛋白的表达情况.结果 pEGFP-N3-NOD2wt和mpEGFP-N3-NOD2经酶切鉴定和序列测定证实重组质粒构建成功,并且NF-κB结合位点突变成功.细胞转染结果表明,构建的重组质粒pEGFP-N3-NOD2wt转染HeLa细胞,在倒置荧光显微镜下能看到绿色荧光,而突变质粒mpEGFP-N3-NOD2荧光强度明显减弱,与未转染质粒相近.结论 成功构建了含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子的重组质粒和含有NF-κB结合位点缺失突变的重组质粒;NF-κB结合位点突变重组质粒在HeLa细胞巾绿色荧光表达明显减弱,说明NF-κB结合位点在NOD2基因调控中发挥了正调节作用;为进一步研究NOD2基因表达及调控机制奠定了良好的基础.     

人PLAGL2基因表达载体质4粒的构建

目的克隆人PLAGL2基因片段并插入（TetO）7-CMV表达载体。方法采用PCR技术扩增出人PLAGL2基因的两个DNA片段，经酶连后获得约2kb的目的DNA片段并插入（TetO）7-CMV载体中，PCR筛选阳性转化株并分析重组质粒的DNA序列。结果DNA测序结果显示重组质粒（TetO）7-CMV-PLAGL2序列正确。结论扩增并连接了人PLAGL2基因的两个DNA片段，最终成功构建了人PLAGL2基因的表达载体质粒-（TetO）7-CMV-PLAGL2。     

MTHFR和CBS基因多态性与低出生体重的关系研究

目的探讨母亲亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因C677T、胱硫醚β-合酶（CBS）基因T833C与子代低出生体重发生之间的关系。方法运用聚合酶链反应（PCR）-限制性片段长度多态性与PCR-扩增阻滞突变体系技术分别检测母亲的MTHFR、CBS基因型,对MTHFR基因型、CBS基因型、基因型的交互作用与低出生体重的关系进行分析。结果MTHFR基因突变型、CBS基因突变型对低出生体重影响无统计学意义（P〉0．05）,但MTHFR基因突变型与CBS基因突变型对低出生体重的影响存在交互作用（OR=3．155,95％CI：1．229—8．528）。结论母亲MTHFR基因C677T、CBS基因T833C,与子代低出生体重发生无关,但MTHFR基因突变型与CBS基因突变型存在交互作用,其能增加子代低出生体重发生的危险。     

鼻咽癌STGC3基因转录调控元件分析与鉴定*

目的：分析并鉴定STGC3基因转录调控元件,探讨鼻咽癌STGC3基因的转录调控分子机制。方法：运用 生物信息学,预测并分析STGC3基因核心启动子区的转录因子结合位点;将相关转录因子结合位点,制备3 种探 针即生物素标记野生型、突变型及未标记野生型;提取CNE2细胞核蛋白,利用电泳迁移率变动分析（ EMSA） 及染色质免疫共沉淀（ ChIP）分析,体内外鉴定转录因子结合位点。结果：在STGC3基因核心启动子区存在21 个转录因子结合位点,其中9 个为Sp1 转录因子结合位点;进一步严格限定参数,STGC3基因核心启动子区域含 有转录因子结合位点5 个,其中Sp1 转录因子结合位点2 个;EMSA和ChIP 实验结果显示,STGC3基因中存在转 录因子Sp1 特异性结合位点,从而鉴定出STGC3基因转录调控元件。结论： STGC3基因核心启动子区含有Sp1 特异性结合位点,为该基因的转录调控元件。     

PAX6基因5′端非编码区剪接突变能够引起先天性无虹膜症

目的对一先天性无虹膜症家系进行了致病基因PAX6的突变分析。方法PCR反应扩增PAX6基因的所有外显子,PCR产物进行SSCP（单链构象多态性）分析,通过患者与正常人带型的差异来确定突变发生的外显子,对有差异SSCP带型的PCR产物进行直接测序找到突变位点。PCR产物进一步亚克隆到pGEM-T载体,测序验证突变位点。结果发现基因突变为PAX6基因第2内含子和第3外显子之间的剪接识别位点＂AG＂中的碱基A的丢失（IVS2-2delA）。结沦PAX6基因5′端非编码区剪接突变能够引起先天性无虹膜症。     

精氨酸调节蛋白 ArgR 调控铜绿假单胞菌Ⅵ型分泌系统表达

目的 研究精氨酸调节蛋白 ArgR 对铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa, PA) 中Ⅵ型分泌系 统 (type Ⅵ secretion system, T6SS) 相关基因表达的调节作用。 方法 构建带有 SUMO 标签的 ArgR 蛋白表 达载体, 利用大肠埃希菌 DH5α 异源表达铜绿假单胞菌 ArgR 蛋白。 采用凝胶电泳迁移 ( electrophoretic mobility shift assay, EMSA) 实验探究 ArgR 与 T6SS 相关基因 hsiA2 启动子的相互作用; 构建带有 Flag 标签 的 Hcp2-Flag 表达载体, 利用蛋白质免疫印迹实验和 qRT-PCR 技术检测 argR 基因对 T6SS 结构基因 hcp2 的 调控。 结果 通过酶切去标签, 得到可溶性的 ArgR 蛋白; EMSA 结果显示 ArgR 和 hsiA2 启动子有结合。 Western 印迹和 qRT-PCR 实验结果表明在 argR 缺失的突变体中 hcp2 的表达量明显升高, 回补 argR 后, hcp2 的表达量可以补回至野生型的水平。 结论 研究表明 ArgR 能结合 hsiA2 启动子并负调控 T6SS 相关基因的 表达。     

深圳地区β-珠蛋白生成障碍性贫血基因突变分析

目的对深圳地区β-珠蛋白生成障碍性贫血患者的β-珠蛋白基因序列进行分析,了解深圳地区人群β-珠蛋白基因的突变类型。方法收集100例深圳地区β-珠蛋白生成障碍性贫血患者的外周血并抽提基因组DNA,通过聚合酶链反应扩增全长β-珠蛋白基因,经DNA测序确定β-珠蛋白基因的突变类型。结果在89例深圳地区β-珠蛋白生成障碍性贫血患者中,我们在β-珠蛋白基因中共发现7种突变,以突变频率高低依次为IVS-Ⅱ-654(C→T)、Codon17(A→T)、Codon41/42(-TTCT)、Codon71/72(+A)、Codon27/28(+C)、Codon43(G→T)、-28(A→G)。剩余11例临床诊断的β-珠蛋白生成障碍性贫血患者的β-珠蛋白基因未检出突变。结论在深圳地区人群中IVS-Ⅱ-654(C→T)、Codon17(A→T)和Codon41/42(-TTCT)为β-珠蛋白基因的常见突变。不排除未检出突变患者存在β-珠蛋白基因座控制区存在突变,这将给产前诊断带来困难。     

儿童哮喘血清中SP-A、SP-D、IL-8、IgE的水平变化及临床意义

目的探讨哮喘患儿血清中肺表面活性蛋白A、D(SP-A,SP-D)、白介素8(IL-8)、免疫球蛋白E(IgE)含量的变化及其分析研究。方法测定30例儿童哮喘急性发作期和缓解期的SP-A、SP-D、IL-8、IgE及同期健康儿童30例。结果急性发作期的SP-A、SP-D水平均显著低于对照组(P<0.01),IL-8、IgE水平均显著高于对照组(P<0.01);缓解期的SP-A、SP-D水平明显高于发作期(P<0.05),IL-8水平明显低于发作期(P<0.05),IgE水平与发作期相比差异无显著性(P>0.05)。结论儿童哮喘的发作虽然是多种病因引起,IL-8、IgE等在其中的病理生理、免疫病理改变有重要作用。证明SP-A、SP-D含量及功能改变与哮喘的发病、发展关系密切。