基于氨基酸性质的EB病毒抗原MHC-Ⅰ类分子限制性表位的定量构效关系建模

目的建立EB病毒(EBV)抗原表位的理论计算模型并用于其定量预测,为肿瘤免疫的多肽疫苗设计提供理论基础。方法从表位数据库中收集33条EBV抗原表位,使用逐步回归(STR)方法筛选2个对平衡解离常数(KD)贡献较大的结构参数用于表位的结构表征,最后用多元线性回归(MLR)方法建立结构参数与KD的定量构效关系(QSAR)模型。结果该模型具有较好的稳定性(R2=0.637,Q2=0.581)与预测能力(R2test=0.501)。结论此方法可确定表位中各个氨基酸的物理性质对于平衡解离常数的贡献,为表位设计与改造提供直接线索;STR和MLR相结合建模方法具有物化意义明确、易于解释及操作简便易行等优点。     

结核分枝杆菌Rv0577抗原T细胞多肽预测及实验验证

目的建立一个预测和验证具有T细胞免疫功能的多肽的方法 ,用于耐多药结核病(MDR-TB)和广泛耐药结核病(XDR-TB)治疗或者辅助治疗。方法采用生物信息学方法预测Rv0577的T细胞表位,筛选并化学合成表位集中、亲和力较强、理化性质稳定的长链多肽,应用酶联免疫斑点(ELISPOT)技术检测多肽刺激活动性结核病患者免疫细胞分泌IFN-γ的能力。结果预测并筛选出Rv0577长链多肽2条,ELISPOT结果表明2条多肽可以激活活动性结核病患者的免疫细胞。结论软件预测与初步鉴定结果具有一致性,此方法的建立为寻找更多的T细胞免疫多肽奠定基础。     

欧洲女贞花粉主要过敏原Lig v 1 理化性质与结构的生物信息学分析

目的:运用生物信息学相关软件,预测欧洲女贞花粉主要过敏原Lig v 1 的理化性质和结构,为Lig v 1 重组表达系统的选择和过敏原性改造提供参考。方法:查询文献获得Lig v 1 的氨基酸序列,运用生物信息学软件分析其理化性质(ProtParam)、信号肽(SignalP 4.1 Server)、跨膜区(TMHMM Server v.2.0)、二级结构(GOR4)、MHC域类抗原表位(NetMHC域2.2 Server)、B 细胞抗原表位(ProteanTM 5.01)以及系统发生树(MEGA 6)。结果:Lig v 1 在大肠杆菌中稳定性较好,不存在信号肽与跨膜区;二级结构中无规则卷曲占大多数;Lig v 1 潜在MHC域类抗原表位为30 ~44 区域;B 细胞抗原表位既具有连续的氨基酸序列,也具有不连续的氨基酸序列;Lig v 1 与欧洲白蜡以及木犀榄的同源蛋白进化距离最近。结论:大肠杆菌是适合重组Lig v 1 的表达系统,Lig v 1 抗原表位分析为低过敏原性改造提供参考。     

癌胚抗原低亲和力表位改造中的分子对接

目的通过分子对接方法筛选表位改造后的高亲和力CTL表位。方法在图形工作站上,将癌胚抗原来源的低亲和力表位及其N末端第一位残基以酪氨酸替换后的突变体,分别与MHCⅠ类分子进行对接,对接所得最佳构象进行600ps分子动力学模拟修正。结果改造后的突变体与MHC分子间存在较强的氢键和疏水相互作用,组成肽结合槽口袋A的残基Tyr7、Tyr171和Tyr159与多肽N末端形成稳定的氢键作用网络,并且P1位酪氨酸上的苯环可与Trp167上的苯环发生π-π堆积作用。结论分子对接模型预测的肽-MHC复合物作用模式,提示改造后的突变体与MHCⅠ类分子间具有更高的亲和力,与实验结果一致。     

猫主要过敏原Fel d 1的T细胞抗原表位分析及三维结构模拟

目的:预测猫主要过敏原Fel d 1与MHC Ⅰ、MHCⅡ类分子的结合力获得T细胞优势抗原表位,并模拟Fel d 1的三维结构,为猫主要过敏原的改造及其临床研究等提供依据.方法:从Uniprot数据库中得到猫主要过敏原Fel d 1的氨基酸序列,通过在线软件NetMHCⅡ2.2对Fel d 1氨基酸序列进行MHCⅡ抗原表位分析,使用软件SYFPEITHI分析MHC Ⅰ的抗原表位,再通过在线软件Swiss-Model预测Feld1的三维结构,以Ramachandran图评估三维结构的稳定性.结果:运用生物学软件分析得到Fel d 1上两个高值MHCⅡ抗原表位区域分别为22～43、80～95,MHC Ⅰ抗原表位优势区为17～30、56～84、91 ～103.Ramachandran图显示Feld 1的空间构象稳定.结论:本研究有助于确定Fel d 1的T细胞优势抗原表位及其三维结构模型,为Fel d 1抗原性改造提供理论依据,及将来的临床研究奠定基础.     

鼠Ⅲ型肝炎病毒H-2K~K限制性CTL表位的初步鉴定

目的预测和初步鉴定鼠Ⅲ型肝炎病毒(MHV-3)的CTL表位,为基于慢性肝炎病毒抗原表位的免疫治疗奠定理论基础。方法利用超基序、量化基序及人工神经网络方案相结合预测MHV-3 S蛋白的H-2K~K限制性CTL表位;用分子模拟对候选表位肽做进一步筛选;人工合成相关待测表位肽,利用T2-K~K细胞株测定各肽与H-2K~K分子的结合力。结果结合超基序、量化基序、人工神经网络预测结果及分子模拟结果,预测出了4条候选表位肽。MHC亲和力实验表明,在候选的4条表位肽中,IEPYNGVI(141-148)、YELSGYTV(306-313)与H-2K~K呈中等亲和力结合,荧光系数分别为1.25及1.04。结论表位预测的结果与亲和力分析结果一致性较好,两者联合应用初步认为IEPYNGVI(141-148)及YELSGYTV(306-313)为MHV-3 S蛋白H-2K~K限制性CTL表位的可能性最大,为下一步体内鉴定及基于小鼠肝炎病毒抗原表位的免疫治疗奠定基础。     

MUC1黏蛋白模拟表位的筛选和鉴定

目的从噬菌体表面展示的随机12肽库中筛选出MUC1抗原的模拟表位。方法通过生物淘洗，获得阳性噬菌体克隆，通过基因测序，推导氨基酸序列，同MUC1核心序列比较，选出2个模拟表位，进行抗原表位预测和竞争抑制实验。结果筛选到的两个模拟表位与MUC1单克隆抗体的亲和力均较强，能特异性抑制MUC1的抗原抗体结合，且包含有与某些MHCⅠ类分子较好结合的位点。结论从噬菌体12肽库中筛选出两个MUC1的模拟表位可以作为靶向MUC1肿瘤疫苗的候选肽。     

EV-D68 VP1 蛋白的生物信息学分析和候选疫苗表位肽段预测及筛选

目的:通过对人肠道病毒D68型(EV-D68)衣壳蛋白VP1理化性质、结构功能和B细胞表位分析,获取候选疫苗肽段用于后期疫苗研制。方法:应用Bioedit软件、Netphos和ExPASy等在线工具分析EV-D68 VP1蛋白氨基酸序列。结果:EV-D68 VP1蛋白是等电点为8.73、相对分子量34.0 kD的亲水性蛋白质,具有35个可能的磷酸化位点,无信号肽和跨膜区,二级结构中不规则卷区有最高比例,α-螺旋和β-折叠散落在蛋白中;预测VP1蛋白具有多个可能的B细胞表位。结论:本研究分析了EV-D68 VP1的基本理化性质,结构功能和可能的B细胞表位,筛选了B细胞表位肽段,为EV-D68的进一步研究和疫苗的制备奠定基础。     

扎伊尔埃博拉病毒糖蛋白泛MHC Ⅱ限制性表位预测及验证

目的生物信息学预测获得埃博拉病毒(EBOV)糖蛋白泛主要组织相容性复合体Ⅱ(MHCⅡ)限制性优势表位,分析其特征并筛选鉴定可用于疫苗研制的候选对象。方法通过IEDB分析预测EBOV糖蛋白的优势表位,并对优势表位进行聚类分析,保守性分析和分子对接。同时,利用编码糖蛋白DNA的质粒pVAX-GP免疫小鼠,酶联免疫斑点试验(ELISpot)验证预测获得的表位。结果在构成人群覆盖率达99%的人类白细胞抗原Ⅱ(HLAⅡ)超家族限制性15表位肽预测中筛选获得19个优势表位,H-2筛选获得13个优势表位。ELISpot结果显示pVAX-GP可诱导小鼠脾细胞产生针对合成优势表位的细胞免疫反应,其中表位LFLRATTELRTFSIL和GYYSTTIRYQATGFG在C3H小鼠体内具有显著激活细胞免疫反应的效果。保守性分析结果中存在种间和种内均保守的优势表位,不存在种内不保守而种间保守的优势表位。分子对接显示实验鉴定的两条优势表位可在人HLAⅡ类超家族分子中均可获得良好的对接分数,进一步肯定其在人群免疫中应用的可行性。结论多肽LFLRATTELRTFSIL和GYYSTTIRYQATGFG可作为EBOV表位疫苗的候选表位。     

PLS方法应用于T细胞表位定量构效关系的研究

目的 研究了CTL表位与MHC分子结合的定量构效关系模型.方法 采用偏最小二乘法(PLS)对校正集进行校正,并对预测集中的样本进行预测.结果 得到比较满意的短肽-MHC分子结合亲合力与短肽氨基酸序列之间的关系式;模型的预测精确度达到66.8%.结论 偏最小二乘方法可作为CTL表位预测方法.用该模型对预测样本进行短肽-MHC分子的结合亲合力的预测,结果令人满意,说明这种模型在预测CTL表位方面是可行的.     

H1N1亚型流感病毒血凝素Th和B细胞表位预测及抗原性分析

目的:应用生物信息学方法预测H1N1亚型流感病毒血凝素Th和B细胞相关抗原表位,并初步分析其抗原性,为研制H1N1亚型流感病毒的表位疫苗奠定基础.方法:依据近年流感病毒流行趋势,从GenBank下载具有代表性的H1N1亚型流感病毒HA蛋白氨基酸序列.进行生物信息学综合分析预测,获得Th和B细胞相关抗原表位,并比较其保守性和特异性.通过Balb/c小鼠H1N1亚型流感病毒阳性血清与表位肽的结合试验,初步鉴定候选表位抗原性.结果:综合多项预测及空间构像模拟结果,我们获得了三条候选Th和B细胞表位,分别为HA_(73～87)、HA_(125～139)、HA_(188～205).候选表位处于H1N1亚型流感HAI蛋白序列上相对保守的区域内,且与目前流行的H1N1亚型流感病毒HA相应区域具有较好的一致性.而不同候选表位在BMB/e小鼠H1N1亚型流感病毒阳性血清反应中显示了不同抗体结合能力,预示了其成为功能表位的可能.结论:所筛选的表位具有成为H1N1亚型流感病毒HA Th和B细胞相关抗原表位的可能.此研究为深入揭示流感病毒感染与免疫机制,H1N1亚型流感功能表位认知及表位疫苗研究奠定了基础.     

HIV-1 Gag抗原HLA-A*0201限制性低亲和性CTL表位预测及改造分析

初步筛选HIV-1 Gag抗原的HLA-A*0201限制性低亲和性CTL表位,预测并初步鉴定修饰后的表位与HLA-A*0201之间亲和性的变化。采用超基序、蛋白酶解预测等相结合的办法筛选HLA-A*0201限制性低亲和性CTL表位,通过氨基酸置换适当修饰,并以T2细胞株测定肽与HLA-A*0201分子的亲和力和稳定性试验来评价修饰后表位与HLA-A*0201之间亲和性。结果:筛选出3个低亲和性CTL候选表位,经修饰后的表位与HLA-A*0201之间的亲和性均有不同程度的提高。YIYKRWIIL(259-267Y1),YQANFLGKI(429-437Y1)和YTNNPPIPV(249-257Y1)与HLA-A*0201呈高亲和力结合,荧光系数(flurorescene index,FI)分别为2.68、2.54和2.35,同时肽-HLA-A*0201复合物半数解离时间(dissociation complex50,DC50)均大于8h。预测的低亲和力表位经过修饰可能会成为潜在的HLA-A*0201限制性表位。     

抗HBsAg表位单克隆抗体的制备及HBV血清型夹心ELISA的建立

目的制备抗乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)表位单克隆抗体(mAb),建立HBV血清型夹心ELISA检测方法。方法将HBsAg亚型蛋白分别免疫小鼠,通过细胞融合、高通量筛选ELISA(HTS-ELISA)筛选后得到杂交瘤细胞株并在无血清培养基中扩大培养。采用蛋白A对抗体进行纯化并测定抗体亲和力、亚型、特异性,最后建立双抗体夹心ELISA。结果HBsAg的亚型蛋白ad、adr及ayw分别免疫小鼠后,其血清效价达到1∶105。细胞融合及HTS-ELISA筛选后获得4株杂交瘤细胞株。经过纯化后得到的mAb分别命名为#2-4,#18-3,#7-7,#56-5,亲和力都在1×109L/mol以上。间接ELISA结果显示,#2-4,#18-3,#7-7,#56-5分别特异性地与HBsAg的"d,y,r,w"表位结合。用抗HBsAg"a"表位的mAb#3-11分别与这4株抗体组合,进行夹心ELISA检测。结果显示,不同的ELISA组合能特异性地检测HBsAg的"d,y,r,w"表位。结论成功制备了亲和力高、特异性好的抗HBsAg 4个表位的mAb,建立了检测HBV血清型的双抗体夹心ELISA。     

氨基酸非键作用指数用于HLA-A*0201限制性CTL表位定量预测研究

目的 预测SSX-1和SSX-4抗原HLA-A*0201限制性表位.方法 从分子的三维空间结构出发,基于静电、立体、疏水这三类与生物活性直接相关的非键作用方式,经主成分分析技术(PCA)得到了一种新的分子结构表达方法--氨基酸非键作用指数.利用该指数结合偏最小二乘(PLS)算法对152个HLA-A*0201限制性CTL表位进行了定量构效关系(QSAR)建模,再使用该模型对SSX-1和SSX-4抗原HLA.A*0201限制性表位进行预测.结果 预测出8个活性值大于7的九肽表位.结论 通过对SSX-1和SSX-4抗原HLA-A*0201限制性表位的预测,从而为SSX-1和SSD-4抗原HLA-A*0201限制性表位的实验探测和鉴定打下了基础.     

TIMP-1B细胞表位的预测和鉴定

目的: 预测并鉴定金属蛋白酶组织抑制物-1(TIMP-1)蛋白B细胞表位。方法: 采用DNAStar和BcePred分析软件联合预测TIMP-1的B细胞表位,以此合成8分支多抗原肽结构的表位肽(MAP),并与通用型T辅助表位肽(VQGEESNDK,氨基酸163~171)联合免疫家兔,检测免疫血清效价,用Western blotting和间接酶联免疫吸附测定等方法鉴定其特异性和抗体亲和力。结果: 软件预测显示,TIMP-1的第27~41 位(MAP1)、第57~71 位(MAP2)、第95~109 位(MAP3)和第193~207 位(MAP4)氨基酸序列最可能为其优势B细胞表位。抗体滴度动态检测表明,MAP2、MAP3和MAP4均能诱导产生特异性抗体,其中MAP2和MAP4诱导的抗体水平最高;免疫印迹证实MAP2、MAP3和MAP4诱导产生特异性的TIMP-1抗体;间接ELISA证实MAP4与商品化TIMP-1抗体具有最高的亲和力。结论: TIMP-1的第27~41位和第193~207位氨基酸为其优势B细胞表位,其中第193~207位氨基酸的免疫原性最强,这为TIMP-1多肽抗体和B细胞优势短肽疫苗研制提供了理论依据。     

HIV-1 pol抗原HLA-A＊0201限制性低亲和性CTL表位预测及改造分析

目的:初步筛选HIV-1 pol抗原的HLA-A*0201 限制性低亲和性CTL表位,预测并初步鉴定修饰后的表位与HLA-A*0201之间亲和性的变化.方法:采用超基序、蛋白酶解、HLA结合力等预测相结合的办法筛选HLA-A*0201限制性低亲和性CTL表位,通过氨基酸置换适当修饰,并以T2细胞检测HLA-A*0201分子与肽的亲和力和稳定性来评价修饰后表位.结果:筛选出的低亲和性CTL候选表位,经修饰后与HLA-A*0201 之间的亲和性均有不同程度的提高.其中,YVSLSFPQI (pol52-60Y1),YVSQIIEQL(pol673-681Y1),YIQKETWEA(pol548-556Y1)HLA-A*0201呈高亲和力结合,同时肽-HLA-A*0201复合物半数解离时间(Dissociation Complex50,DC50)均大于8 h.结论:预测的pol抗原表位经过修饰可能会成为潜在的HLA-A*0201限制性表位.     

柯萨奇病毒A6 型VP1 蛋白的生物信息学分析

目的:预测柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A6,CVA6)的衣壳蛋白VP1的基本理化性质、结构功能及线性B细胞表位。方法:应用Bioedit软件、Sub Loc、Target P和生物信息学资源门户Ex PASy中的多种在线工具对CVA6 VP1的氨基酸序列进行分析。结果:CVA6 VP1为一亲水性蛋白,其相对分子量为33.6 k D,等电点为7.92,含有24个可能的磷酸化位点,没有信号肽、跨膜区和可能的脂酰化位点;其二级结构中以无规则卷曲居多,有48.52%的氨基酸残基暴露于溶液界面;该分子内存在多个潜在的线性B细胞表位,其中的155~165位氨基酸残基区域的抗原指数最高。结论:成功预测到CVA6 VP1的基本理化性质、结构功能特征及可能的线性B细胞表位,为该蛋白的进一步研究及疫苗和免疫诊断试剂的研制打下基础。     

应用免疫信息学技术预测严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的抗原表位

目的运用免疫信息学技术预测严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的B细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和辅助T(Th)细胞的抗原表位。方法从NCBI数据库检索SARS-CoV-2蛋白序列,根据抗原性≥0.5和氨基酸数≥100进行筛选,最终的蛋白序列用于后续的抗原肽的预测。用蛋白质结构预测软件Phyre2进行三维结构的预测、蛋白质模型结构的细化软件GalaxyRefine优化蛋白的三维结构,最后用蛋白质结构同源建模SWISS-MODEL系统对优化后的结构进行准确性评估。蛋白序列用于CTL、Th细胞和线性B细胞抗原肽预测,三维结构用于结构性B细胞抗原预测。免疫表位数据库和分析资源(IEDB)预测SARS-CoV-2的CTL和Th细胞抗原表位,B细胞线性抗原肽预测软件Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0和B细胞结构抗原肽预测软件ElliPro-Epitope prediction based upon structural protrusion分别预测B细胞线性和结构抗原肽。结果从NCBI数据库获得了27个SARS-CoV-2的蛋白序列,去掉抗原性0.5和氨基酸数100的蛋白质后,最终选定9个蛋白进行后续抗原肽预测。最终获得了24个CTL、20个Th细胞、12个B细胞线性表位和16个B细胞结构表位。结论获得的抗原表位可用于后续多表位疫苗的设计,相较于只针对单种蛋白靶点的抗原表位而言,多靶点抗原表位具有更强的免疫原性,这些抗原表位对SARS-CoV-2疫苗而言,具有一定的参考价值。     

人类肝素酶B细胞表位的预测和免疫原性鉴定

目的 预测并鉴定肝素酶(heparanase)蛋白B细胞表位免疫原性.方法 以肝素酶蛋白的氨基酸序列为基础,采用DNAStar分析软件以及Bcepred在线二级结构分析工具分析其蛋白二级结构并预测B细胞表位.根据预测结果 ,采用8分支多抗原肽结构合成针对该表位的抗原肽,将后者与通用型T辅助表位人IL-1β线性短肽(VQGEESNDK,氨基酸163～171)联合免疫日本白毛黑眼兔,检测免疫血清效价,鉴定其特异性和免疫原性.结果 软件预测显示,肝素酶蛋白大亚基的第1～15位(MAP1)、第279～293位(MAP2)及175～189位(MAP3)氨基酸序列最可能为其优势B细胞表位.间接酶联免疫吸附试验、免疫印迹及免疫组化分析,证实MAP1、MAP2及MAP3均能诱导机体产生高滴度抗体,但仅MAP1、MAP2抗体具有高特异性,MAP2抗体与肝癌组织的结合力最强.结论 肝素酶大亚基的第1～15位、第279～293位氨基酸为其优势B细胞表位,其中第279～293位氨基酸的免疫原性最强,这为肝素酶多肽抗体及B细胞优势短肽疫苗研制提供了理论依据.     

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)刺突蛋白的B细胞及T细胞抗原表位的生物信息学分析

目的 使用生物信息学方法预测严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)刺突蛋白(S蛋白)的结构特点，并预测可能的B细胞和T细胞表位。方法 从NCBI数据库中获取SARS-CoV-2的S蛋白氨基酸序列，通过蛋白质基本性质分析工具ProtParam分析S蛋白的理化性质；利用综合性序列工具软件Lasergene和蛋白质二级结构分析软件SOMPA分析S蛋白二级结构；蛋白质同源物/类似物Y识别引擎Phyre2和分子图像观察软件Rasmol构建并分析S蛋白三级结构；B细胞表位预测工具ABCpred、 BepiPred和BcePred预测S蛋白的B细胞抗原表位；利用免疫表位数据库IEDB预测S蛋白的T细胞抗原表位。结果S蛋白由1273个氨基酸组成，理论等电点为6.24,原子组成为C₆₃₃₆H₉₇₇₀N₁₆₅₆O₁₈₉₄S₅₄,属于稳定亲水性蛋白。Lasergene软件的Gramier-Robson方法预测显示：α螺旋占23.5%、 β折叠占53.7%、转角区域占14.9%、无规则卷...