丹参酚酸B对转化生长因子β1和血小板衍生生长因子-BB在肝星状细胞内信号传导的影响

目的探讨丹参酚酸B（SA-B）抗肝纤维化作用机制.方法分离大鼠肝星状细胞（HSC）,于无包被塑料培养皿中原代培养7天,继以10-6mmol/L SA-B孵育,再加10 ng/ml的转化生长因子β1（TGF-β1）或血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）刺激.以Western blot法观察SA-B对TGF-β1或PDGF-BB刺激的HSC内ERK蛋白及其磷酸化表达的影响及对TGF-β1或PDGF-BB刺激的HSC表面TGF-β1Ⅰ型受体（TβRⅠ）、Ⅱ型受体（TβRⅡ）或PDGF受体β（PDGFR-β）表达的影响.结果SA-B可抑制原代正常培养9天的HSC及TGF-β1刺激的HSC中ERK1/2的磷酸化;对正常培养的HSC和TGF-β1刺激的HSC表面TβRⅠ和TβRⅡ的表达无明显影响.SA-B抑制原代正常培养9天的HSC和经PDGF-BB刺激的HSC中PDGFR-β的表达,但对PDGF-BB刺激的HSC中ERK1/2磷酸化没有明显作用.结论SA-B抑制TGF-β1诱导的HSC内ERK信号传导通路.这一抑制作用与HSC上TβR的表达无关,也与PDGF-BB在HSC内的ERK信号传导通路无关.SA-B对PDGF-BB在HSC内的信号传导通路的抑制作用在于抑制了HSC上PDGF受体的表达.     

丹参川芎嗪注射液对大鼠脑基底动脉的舒张作用及机制

目的 研究丹参川芎嗪注射液对大鼠脑基底动脉的扩张作用及机制。方法 利用小血管张力测量系统研究丹参川芎嗪注射液对经高钾、苯肾上腺素和血栓素受体激动剂（U46619）预收缩的血管环的扩张作用，并研究在不含钙的缓冲液中丹参川芎嗪注射液对苯肾上腺素、氯化钙及咖啡因收缩血管的影响。利用激光共聚焦显微镜观察丹参川芎嗪注射液对大鼠肠系膜血管平滑肌钙离子浓度的影响。结果 丹参川芎嗪注射液（15～80ml?L-1）可以浓度依赖性地降低经高钾、苯肾上腺素和血栓素受体激动剂（U46619）预收缩的大鼠脑基底动脉；在不含钙的缓冲液中，丹参川芎嗪注射液(15ml?L-1、45ml?L-1和80ml?L-1)可以抑制氯化钙诱导的血管收缩，对苯肾上腺素及咖啡因诱导的血管收缩无影响；丹参川芎嗪注射液(45ml?L-1、60ml?L-1和80ml?L-1)对高钾诱导的大鼠肠系膜血管环收缩及血管壁荧光增强有不同程度的抑制作用。结论 丹参川芎嗪注射液可以浓度依赖性的舒张大鼠脑基底动脉，对抑制血管平滑肌钙离子通道是主要作用机制之一，主要表现为抑制细胞外的钙离子进入。     

齐墩果酸对肝星状细胞收缩的抑制作用及其机制研究

目的以肝星状细胞(HSC)为靶标探讨齐墩果酸(OA)对门脉高压的影响。方法以胶原晶格收缩法观察OA对体外培养大鼠HSC-T6细胞收缩的影响,MTT法测定HSC-T6细胞增殖,硝酸还原酶法测定一氧化氮(NO),化学比色法测定内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性。结果 OA显著抑制HSC-T6收缩(P<0.01),抑制作用与剂量呈依赖关系;OA增加HSC分泌NO和增强eNOS的活性。结论 OA显著抑制HSC收缩,其抑制收缩的机制与提高HSC内的NO浓度和eNOS活性有关。OA抑制HSC的收缩作用可能是其抗肝硬化及抗门脉高压的机制之一。     

抗纤软肝冲剂药物血清对肝星状态细胞胶原代谢及其相关基因表达的影响

目的：从细胞分子学水平探讨抗纤软肝冲剂抗肝纤维化的作用机制。方法：抗纤软肝冲剂药物血清温育传一代HSC，以生理盐水和秋水仙碱为对照。ELISA测定细胞上清Ⅰ型胶原，并测定细胞层总蛋白以校正胶原含量；半定量法RT－PCR法和检测Ⅰ型胶原，间质胶原酶（MMPI）的mRNA表达。结果：抗纤软肝冲剂组细胞上清中的Ⅰ型胶原含量明显低于其它两组（P＜0．01）；能明显抑制细胞的Ⅰ型胶原mRNA表达（P＜0．01），且能促进MMP1的mRNA表达（P＜0．01）。结论：抗纤软肝冲剂能明显抑制HSC的胶原基因表达和促进间质胶原酶基因表达，从而可达到抑制胶原合成，促进胶原降解，这可能是抗纤软肝冲剂抗肝纤维化的细胞分子学机制之一。     

调肝理脾方对HSC DNA及RNA的影响

目的 :探讨调肝理脾方对肝脏星状细胞 (HSC) DNA及 RNA合成的影响。方法 :将传代 HSC分为正常组、乙醛组、防治组 (乙醛加药物血清组 )及药物血清组。将以上细胞固定后进行 AO染色 ,应用激光共聚焦扫描显微镜进行观察。结果 :按荧光强度由强到弱的顺序排列为 :乙醛组 -正常组 -防治组 -药物血清组。结论 :调肝理脾方有抑制 HSC DNA及 RNA合成的作用 ,从而抑制 HSC的增殖     

瑶药猛老虎提取物对大鼠肝星状细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原、MMP-1和TGF-β1表达的影响

目的：观察瑶药猛老虎提取物对大鼠肝星状细胞（HSC）Ⅰ、Ⅲ型胶原、基质金属蛋白酶（MMP-1）和转化生长因子-β1（TGF-β1）表达的影响。方法：制备猛老虎乙酸乙酯部位分离物药物血清，分离培养大鼠肝HSC，温育HSC，EIJSA法检测上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量；MTT检测HSC的生长情况；逆转录多聚酶链反应（RT—PCR）法观察MMP-1的表达；免疫组化法观察TGF-β1的表达。结果：猛老虎乙酸乙酯部位各分离物和秋水仙碱药物血清对体外培养的HSC细胞增殖无抑制作用。与空白对照血清组比较，无显著性差异（P〉0．05）。分离物E中和高剂量组的药物血清均能明显促进体外培养HSC细胞MMP-1基因表达水平、抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原的分泌和TGF-β1表达并呈现剂量依赖关系，与空白对照血清组比较，均具有显著性的统计学意义（P〈0．05或P〈0．01），效果与秋水仙碱相当。结论：瑶药猛老虎抗肝纤维化作用不是直接抑制HSC的增殖，而是与其促进HSC细胞MMP-1基因表达水平、抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原的分泌和TGF-β1的表达有关。     

保肝宁对HSC—T6细胞增殖及I型胶原表达的影响

目的：探讨复方保肝宁对HSC－T6细胞增殖及I型胶原表达的影响。方法：复方保肝宁给正常大鼠灌胃，制备药物血清，温育培养HSC－T6细胞48小时。MTT法测定星状细胞增殖，ELISA法测定培养上清的I型胶原表达量。结果：复方保肝宁药物血清能明显抑制HSC－T6细胞增殖，抑制细胞的I型胶原分泌。实验表明，在抑制HSC－T6细胞增殖和I型胶原蛋白分泌方面，高剂量组药物血清无低、中剂量组明显，是否为血清药物浓度对细胞的影响，尚需进一步研究。结论：复方保肝宁能明显抑制HSC－T6细胞的活化，对HSC－T6细胞I型胶原表达的抑制可能是该方抗肝纤维化的主要作用机制之一。     

保肝宁对HSC-T6细胞增殖及Ⅰ型胶原表达的影响

目的 :探讨复方保肝宁对HSC -T6细胞增殖及Ⅰ型胶原表达的影响。方法 :复方保肝宁给正常大鼠灌胃 ,制备药物血清 ,温育培养HSC -T6细胞 4 8小时。MTT法测定星状细胞增殖 ,ELISA法测定培养上清的Ⅰ型胶原表达量。结果 :复方保肝宁药物血清能明显抑制HSC -T6细胞增殖 ,抑制细胞的Ⅰ型胶原分泌。实验表明 ,在抑制HSC -T6细胞增殖和Ⅰ型胶原蛋白分泌方面 ,高剂量组药物血清无低、中剂量组明显 ,是否为血清药物浓度对细胞的影响 ,尚需进一步研究。结论 :复方保肝宁能明显抑制HSC -T6细胞的活化 ,对HSC -T6细胞Ⅰ型胶原表达的抑制可能是该方抗肝纤维化的主要作用机制之一。     

抑制内皮素诱导的肝星状细胞收缩的中药成分筛选

目的:观察5种经研究有抗肝纤维化作用的中药成分:灯盏花素、青蒿琥酯、红景天苷、黄芪总甙、粉防已碱对肝星状细胞(HSCs)收缩的影响,筛选出能抑制HSCs收缩的中药成分。方法:分离培养大鼠HSCs,通过MTT及细胞形态观察研究100～0.1μmol/L灯盏花素、青蒿琥酯、红景天苷、黄芪总甙、粉防已碱对HSCs增殖及毒性作用,以10nmol/L内皮素(ET-1)为刺激因子,用凝胶收缩实验观察各中药成分对ET-1刺激下HSCs收缩的影响,筛出能抑制HSCs收缩的成分,凝胶面积用"%原始面积"表示。结果:100～0.1μmol/L灯盏花素、青蒿琥酯、黄芪总甙、粉防已碱具有浓度依赖性地抑制HSC增殖的作用,其中100μmol/L黄芪总甙,100μmol/L及10μmol/L粉防己碱对HSCs有毒性作用。100μmol/L及10μmol/L灯盏花素凝胶面积分别为74.33±5.5%和67.39±3.47%,与ET-1组面积(49.96±4.46%)相比有显著差异(P﹤0.01);100μmol/L及10μmol/L青蒿琥酯凝胶面积分别为79.62±1.95%和58.86±2.99%,与ET-1组面积(39.85±3.12%)相比有显著差异(P﹤0.01)。100～0.1μmol/L红景天苷、10～0.1μmol/L黄芪总甙和1及0.1μmol/L粉防己碱凝胶面积与ET-1组相比无明显差异。结论:5种中药成分中,100及10μmol/L灯盏花素及青蒿琥酯均能抑制ET-1诱导的大鼠HSCs收缩。     

红景天苷体外抗肝纤维化的实验研究

目的：观察红景天苷对大鼠肝星状细胞增殖及细胞外基质分泌的影响。方法：用不同浓度的红蒂天苷处理大鼠肝星状细胞；以MTT比色法测定细胞的增殖；放射免疫法测定透明质酸和层粘连蛋白；酶联免疫吸附法(ELISA)测定Ⅰ型胶原的水平。结果：红景天苷可剂量依赖性地抑制HSC增殖，不同程度抑制Ⅰ型胶原、透明质酸和层粘连蛋白分泌。结论：红景天苷在体外有显著的抗肝纤维化作用。     

淫羊藿苷干预核因子NF-κB抑制肝星状细胞活化的研究

目的:研究淫羊藿苷(ICA)对肝星状细胞(HSC)活化的作用,及其对HSC活化过程核因子NF-κB蛋白表达及核转位的影响。方法:肝脏原位灌流酶消化、Nycodenz密度梯度离心方法分离培养大鼠HSC,Alamar blue法观察10-4¹0-8M浓度ICA对4 d的HSC增殖的作用;传代培养的HSC分为对照组、转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGFβ1)刺激组,ICA组,TGFβ1加ICA组,药物孵育24 h后,Alamar blue法检测HSC增殖,real-time PCR及蛋白印记法检测淫羊藿苷对TGFβ1刺激的HSC内Ⅰ型胶原(CollagenⅠ,ColⅠ)、平滑肌肌动蛋白-α(α-smooth muscle actin,α-SMA)、NF-κB表达的变化,高内涵药物筛选系统检测HSC内NF-κB核转位的变化特点。结果:10-410-8M浓度ICA对4 d的HSC增殖的作用;传代培养的HSC分为对照组、转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGFβ1)刺激组,ICA组,TGFβ1加ICA组,药物孵育24 h后,Alamar blue法检测HSC增殖,real-time PCR及蛋白印记法检测淫羊藿苷对TGFβ1刺激的HSC内Ⅰ型胶原(CollagenⅠ,ColⅠ)、平滑肌肌动蛋白-α(α-smooth muscle actin,α-SMA)、NF-κB表达的变化,高内涵药物筛选系统检测HSC内NF-κB核转位的变化特点。结果:10-4¹0-8M ICA可一定程度抑制HSC的增殖,并且无明显细胞毒作用;10-6M ICA可抑制TGFβ1诱导的HSC增殖,减少HSC内ColⅠmRNA表达和α-SMA蛋白表达的增加,抑制NF-κB的蛋白表达;减少TGFβ1刺激的HSC内NF-κB核转位。结论:淫羊藿苷可抑制肝星状细胞活化,其机制可能与抑制核因子NF-κB蛋白表达及核转位有关。     

Effect of Salvianolic-acid B on inhibiting MAPK signaling induced by transforming growth factor-β1 in activated rat hepatic stellate cells

Aim of the study

Salvianolic-acid B (SA-B) is an effective component of Radix Salviae miltiorrhizae for anti-hepatic fibrotic herbs. MAPK signaling pathway has been implicated in hepatic stellate cells (HSC) stimulated by TGF-(1. We have investigated the effect of SA-B on MAPK pathway in rat HSC.

Materials and methods

To observe the pharmacological effect of SA-B on HSC, SA-B was added into the medium of primary HSC. TGF-(1 was added during last 2 h, and PD98059 (ERK inhibitor) and SB203580 (p38 inhibitor) were added just 30 min before adding TGF-(1. MEF2 and Col. I were measured by luciferase reporter gene assay and Western blot. (-SMA, MEF2, Raf, ERK, p-ERK, MEK, p-MEK, p38, p-p38, MKK3 and p-MKK3/6 were assayed by Western blot. Activity of MMP-2 and MMP-9 was analyzed by zymography. Each experiment was repeated for three times.

Results

The expression of (-SMA and Col. I in HSC was inhibited by SA-B. There was no effect of SA-B on the activity of MMP-2 or MMP-9 in the media of cultured HSC. Phosphorylation of ERK1/2 in HSC stimulated with or without TGF-(1 was inhibited by SA-B. Specifically, phosphorylation of MEK (upstream kinase of ERK pathway) was inhibited by SA-B. SA-B also inhibited phosphorylation of MKK3/6 (upstream kinases of p38 pathway) and inhibited the synthesis of MEF2.

Conclusions

SA-B performs anti-hepatic fibrosis through inhibiting ERK and p38 MAPK pathway in HSC. SA-B inhibits ERK pathway via inhibiting phosphorylation of MEK and inhibits p38 MAPK pathway via blocking phosphorylation of MKK3/6 and inhibiting expression of MEF2 in HSC with or without TGF-(1 stimulation.     

柔肝消癥饮对肝硬化大鼠血一氧化氮和内皮素-1的影响

目的：观察柔肝消癥饮对肝硬化大鼠血清一氧化氮（NO）和血浆内皮素-1（ET-1）含量的影响。方法：采用复合因素造模法复制肝硬化大鼠模型,实验分组为正常组、模型组、阳性药（复方鳖甲软肝片）对照组和柔肝消癥饮高、低剂量组。观察柔肝消癥饮对肝硬化大鼠肝组织病理形态学、血清NO和血浆ET-1含量的影响。结果：模型组大鼠出现肝小叶损害,纤维组织增生,假小叶形成;血清NO和血浆ET-1含量以及二者比值显著增加。各治疗组肝脏病理损害较轻,血清NO和血浆ET-1含量以及二者比值明显降低。结论：柔肝消癥饮通过显著抑制肝硬化大鼠血清NO和血浆ET-1水平的异常升高,以达到抗肝硬化的作用。     

低钙透析对终末期肾病高血压患者的降压作用

目的：观察二种不同浓度钙离子透析液对终末期肾病（end—stage renal disease,ESRD）高血压患者的降压作用。方法：选取维持性血液透析的ESRD高血压患者18例,分二个阶段,先用含钙离子浓度1．5mmol／L（DCa1．5）透析液透析三个月,再用含钙离子浓度1．25mmol／L（DCa1．25）透析液透析三个月。观察透析开始（Oh）、透析1小时（1h）、透析1个月及透析3个月结束时血压的变化：对比分析二种不同钙离子浓度透析各时段对血压的影响,同时观察对钙磷代谢的影响。结果：DCa1．5透析液透析收缩压（systolic blood pressure,SBP）呈逐渐升高趋势,透析3个月SBP明显升高（P〈0．05）;而DCa1．25透析液透析SBP呈逐渐下降趋势,透析1个月时收缩压明显下降（P〈0．05）,3个月时SBP及舒张压（diastolic blood pressure,DBP）均明显下降,以SBP下降更为明显（P〈0．01）;而对血钙、血磷影响无统计学意义。结论：低钙（DCa1．25）透析可降低ESRD高血压患者的血压,对钙磷代谢无明显影响。     

内毒素对大鼠肝星状细胞活化和瘦素表达的影响

目的观察内毒素对肝星状细胞(HSC)增殖、Ⅰ型胶原及瘦素表达的影响。方法取传代培养的大鼠肝星状细胞系rHSC-99,以1×108L-1浓度接种于96孔培养板,每孔100μL,加入内毒素使内毒素浓度分别为0.1,1.0,10.0 EIU/mL,同时设对照组,以MTT比色法检测培养24 h和48 h时HSC吸光度。采用ELISA法检测其培养48 h时瘦素和I型胶原水平。结果内毒素组浓度为0.1,1.0 EIU/mL时HSC的平均每孔吸光度和瘦素浓度均显著高于对照组(P<0.05)。内毒素组浓度为1.0 EIU/mL时HSC的平均I型胶原水平显著高于对照组。而内毒素浓度为10.0 EIU/mL时HSC的胶原和瘦素表达水平无明显增高。结论一定浓度的内毒素可以促进大鼠HSC活化,使细胞增殖和I型胶原的表达增加,并促进HSC瘦素的表达,这可能是引起肝纤维化的重要因素。     

丹红软肝胶囊药物血清对肝星状细胞增殖的干预作用

目的观察丹红软肝胶囊含药血清对肝星状细胞(HSC)增殖及分泌的相关细胞因子的干预作用。方法 15只SD大鼠按随机数字法分为3组,即丹红软肝胶囊组、复方鳖甲软肝片组和正常对照组,各5只,通过灌胃制备丹红软肝胶囊及复方鳖甲软肝片药物血清。将HSC-6细胞分为3组,分别加入含丹红软肝胶囊、复方鳖甲软肝片药物血清及正常小鼠血清的培养基,培养24 h后,采用噻唑蓝(MTT)法检测HSC的增殖率,收集培养上清,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测Ⅰ型胶原及转化生长因子β1(TGF-β1)的含量。结果丹红软肝胶囊组、复方鳖甲软肝片组吸光度(OD)值均低于正常血清对照组(P<0.01);丹红软肝胶囊组、复方鳖甲软肝片组HSC细胞增殖的抑制率比较差异无统计学意义(P>0.05)。丹红软肝胶囊组、复方鳖甲软肝片组培养上清中Ⅰ型胶原、TGF-β1的含量与正常血清对照组比较均降低(P<0.01);丹红软肝胶囊组、复方鳖甲软肝片组培养上清中Ⅰ型胶原、TGF-β1的含量比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论丹红软肝胶囊可抑制活化的HSC产生TGF-β1,并对HSC分泌胶原产生抑制作用,进而抑制HSC的增殖,这可能是其抗纤维化作用机制之一。     

玄参提取物舒张血管作用及机制研究

目的观察玄参提取物(extract from scrophulariae,radix,ES)血管舒张作用及其机制。方法采用大鼠离体血管环功能实验装置,记录张力变化,每组血管来自6只同批大鼠,分别保留或去除内皮,各阻断剂预处理25 min后做ES舒张曲线;ES预处理10 min后做钙离子收缩曲线。结果玄参提取物(ES)(0.05 mg/L~2 000 mg/L)剂量依赖性地舒张苯肾上腺素(PE)预收缩的内皮完好或内皮去除大鼠胸主动脉环,在去除内皮前后最大舒张效应(E max)无显著性差异,分别为(78.29%±1.20%)和(76.89%±3.20%);亚硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)、吲哚美辛、普萘洛尔、鸟甘酸环化酶抑制剂(ODQ)预处理不能抑制ES的血管舒张效应;ES(500 mg/L)对血管紧张素Ⅱ、前列环素F2α、多巴胺、血管加压素收缩血管显示出抑制效应(P0.05),而对5-羟色胺、内皮素-1(ET-1)的收缩作用无影响;ES(1 000 mg/L)预处理可显著抑制无钙高钾液中由Ca2+内流引起的血管收缩(P0.05),ES(500 mg/L)预处理可抑制无钙液中PE血管收缩强度(P0.01);钾通道阻断剂四乙胺(TEA)3 mmol/L、BaCl20.1 mmol/L预处理可阻断ES血管舒张作用(P0.01),半数效应浓度EC50分别为TEA组(1 900 mg/L)、BaCl2组(1 400 mg/L)。结论 ES具有非内皮依赖性血管舒张作用,其机制与影响血管平滑肌上钾通道有关;部分与阻断钙通道,调节细胞内钙离子浓度相关。     

川芎嗪对肝星状细胞TGF-β1及其Ⅰ、Ⅱ型受体mRNA与NF-κB表达的影响

目的：探讨中药单体川芎嗪（TMP）对肝星状细胞（HSC）核因子-κB（NF-κB）、转化生长因子-β1（TGF-β1）及其Ⅰ、Ⅱ型受体表达的影响。方法：体外培养人肝星状细胞,免疫细胞化学法检测HSC中NF-κB表达以及核迁移情况,RT-PCR法检测HSC中TGF-β1及其Ⅰ、Ⅱ型受体mRNA表达。结果：TMP组NF-κB表达量较少并且主要位于细胞质,很少发生核迁移。RT—PCR显示,与阴性对照组相比,TMP组TGF-β1 mRNA相对表达量均有显著性差异（P〈0．01）;TMP200mg／L、800mg／L组TβRⅠ mRNA相对表达量降低,其差异有显著性（P〈0．05或P〈0．01）;TMP200mg／L、800mg／L组TβRⅡ mRNA相对表达量均有显著性差异（P〈0．01）。结论：川芎嗪可降低HSC中NF-κB表达并抑制其核转移,降低TGF-β1及其Ⅰ、Ⅱ型受体mRNA表达,表明川芎嗪可抑制HSC活化,这可能与阻断NF-κB信号通路、阻断TGF-β／Smad通路的信号传导有关。