基因-病毒治疗系统CNHK300-murine endostatin的构建及体外研究

目的构建一种新型的肿瘤基因．病毒治疗系统CNHK300-murine endostatin（CNHK300-mE），以肿瘤增殖病毒为载体，携带抗肿瘤新生血管生成的基因。方法利用基因重组技术将人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子插入腺病毒E1A基因上游，将小鼠内皮抑素基因表达盒插入到腺病毒包装信号和hTERT启动子之间，通过病毒增殖试验、电镜技术、Western blot分析、酶联免疫吸附实验（ELISA）、鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）试验，观察CNHK300-mE的复制情况、mE的表达情况及对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管的抑制情况。结果成功构建了基因-病毒治疗系统CNHK300-mE，该系统为hTERT启动子调控腺病毒E1A基因表达并携带小鼠内皮抑素基因的重组腺病毒。该病毒可以在端粒酶阳性的胃癌细胞株SGC-7901和肝癌细胞株HepGⅡ中大量增殖及复制，而在端粒酶阴性的正常纤维细胞中不增殖。电镜证实该重组病毒在胃癌细胞株SGC-7901中复制及增殖。ELISA检测表明SGC-7901感染CNHK300-mE后7d，小鼠内皮抑素的表达量为1000μg／L。CAM实验证实该病毒感染胃癌细胞后的培养液上清具有抗新生血管生成的生物活性。结论基因-病毒治疗系统CNHK300-mE能在端粒酶阳性的肿瘤细胞中特异性增殖复制，并大量表达具有抗新生血管生成生物活性的小鼠内皮抑素。     

基因-病毒治疗系统CNHK300-小鼠内皮抑素对裸鼠胃癌的抗肿瘤作用

目的探讨新构建的基因-病毒治疗系统CNHK300-小鼠内皮抑素murineendostatin（CNHK300-mE）对胃癌的抑制作用。方法通过胃癌SGC-7901细胞裸鼠皮下移植瘤模型观察该病毒治疗系统对胃癌生长和肿瘤血管生成的抑制作用。用电镜观察该病毒在肿瘤细胞中的复制情况及肿瘤细胞的超微结构改变。用酶联免疫吸附（ELISA）法检测mE基因在体内的表达。用免疫组织化学的方法检测腺病毒外壳蛋白六邻体（hexon）、增殖细胞核抗原（PCNA）及vWF因子相关抗原的表达情况。采用TUNEL法检测细胞凋亡。结果CNHK300-mE能在肿瘤细胞内复制,高表达mE,在第7天时,达到（2115±770）ng/ml（范围1745～3000ng/ml）;明显抑制胃癌皮下移植瘤的生长及瘤内的血管生成,并可引起胃癌细胞的凋亡[治疗组小鼠肿瘤细胞凋亡率（78.4±9.1）%,对照组仅（15.2±0.5）%,P〈0.01],抑制肿瘤细胞增殖[治疗组小鼠PCNA指数（55.0±1.4）%,对照组为（74.1±0.4）%,P〈0.05]。结论CNHK300-mE能在小鼠胃癌内增殖复制,高效表达mE基因,抑制胃癌生长。     

多重调控病毒.基因载体的构建及其体外抗肿瘤活性

目的 构建一种新型的病毒.基因治疗载体.方法 通过克隆技术将人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)基因插入质粒载体pBHGE3的E3区,得到由主要晚期启动子(MLP)调控的腺病毒质粒pPE3-hTRAIL,再通过与质粒pSGS00在293细胞中进行位点特异性重组得到E1A、E1B基因分别受hTERT启动子与HRE启动子双重调控的重组增殖型腺病毒,用TCID50方法测定病毒滴度.通过增殖实验观察重组病毒的选择性增殖能力.利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测人TRAIL基因的表达.并进行噻唑蓝(MTT)比色法实验检测其杀伤肿瘤细胞的能力.结果 CNHK500-hTRAIL的病毒滴度为2.39×1010pfu/ml,增殖实验结果证实CNHK500-hTRAIL可以选择性地在端粒酶阳性的人肺癌细胞A549中增殖,其所携带的人TRAIL基因在A549中的表达量(183.12μg/L)明显高于携带该基因的非增殖型腺病毒载体Ad-hTRAIL(24.53μg/L,P<0.01).MTr显示CNHK500-hTRAIL对A549的杀伤能力明显高于携带该基因的非增殖型腺病毒载体Ad-hTRAIL,其半数抑制MOI值分别为17.825、0.197(P<0.01).结论 CNHKS00一hTRAIL是一种具备治疗肺癌潜力的新型病毒-基因治疗系统.     

基因-病毒治疗系统CNHK500-p53的构建和体外初步研究

目的构建一种新的基因-病毒治疗系统。方法通过基因操作技术将目的基因表达盒mCMV启动子 p53基因 SV40polyA插入腺病毒E1A基因受端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控、E1B基因受缺氧反应元件(HRE)启动子调控的增殖病毒载体质粒pSG500的E1A下游,得到腺病毒质粒pSG500-p53;通过pSG500-p53与5型腺病毒右臂的质粒pBHGE3在293细胞中同源重组得到重组病毒CNHK500-p53;利用Westernblot和ELISA法检测病毒E1A、E1B基因和p53抑癌基因的表达;TCID50方法测定病毒滴度;通过增殖实验观察重组病毒的选择性增殖能力;应用细胞病理效应(CPE)实验检测病毒抗肿瘤作用。结果CNHK500-p53的病毒滴度为2×1010pfu/ml,增殖实验证实CNHK500-p53可以选择性地在端粒酶阳性和缺氧微环境的肝癌细胞中增殖,CNHK500-p53所携带的p53基因在肝癌细胞株中的表达量388±34.6μg/L明显高于非增殖型腺病毒载体Ad-p53的76.3±13.17μg/L(P<0.005),并显示了较强的抗肿瘤效应。结论CNHK500-p53是一种具备治疗肝癌潜力的新型基因-病毒治疗系统。     

携带治疗基因的增殖型腺病毒CNHK300-m干扰素-γ的构建

目的 研制出一种携带抗癌基因的选择增殖型腺病毒载体系统.方法 克隆鼠干扰素(IFN)-γ基因序列,利用分子克隆技术将其插入肿瘤特异性增殖病毒的病毒基因组中,得到腺病毒载体质粒pSG300-m IFN-γ.通过pSG300-m IFN-γ与质粒pBHGE3在293细胞中同源重组得到重组病毒CNHK300-mIFN-γ.扩增、纯化病毒,用TCID50方法测病毒滴度.通过病毒增殖实验观察重组病毒的选择性增殖能力,通过Western blot检测腺病毒蛋白的表达,通过双抗体夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)检测重组病毒在不同细胞及不同时相的mIFN-γ表达量.结果 成功构建了携带治疗基因的增殖型腺病毒CNHK300-mIFN-γ,病毒滴度为1.0×109 pfu/ml,增殖实验证实CNHK300-mIFN-γ可以选择性地在端粒酶阳性肿瘤中增殖,Western blot分析结果显示腺病毒的E1A蛋白选择性在端粒酶阳性的肿瘤细胞中表达,ELISA显示CNHK300-mIFN-γ感染端粒酶阳性肿瘤后有大量mIFN-γ的表达,并随着感染的时间表达量也相应上升.结论 CNHK300-mIFN-γ为肿瘤的生物治疗提供了一种新的策略.     

双重调控选择增殖型腺病毒CNHK500的构建及初步研究

目的　研制出一种双重调控的选择增殖型腺病毒载体系统。方法　先后经 2次定点突变重叠聚合酶链反应 (PCR)技术使腺病毒E1A及E1B启动子缺失 ,并将人工合成的人端粒酶逆转录酶启动子和缺氧反应启动子分别插入E1A及E1B基因的上游 ,得到腺病毒载体质粒pSG5 0 0。通过 pSG5 0 0与质粒 pBHGE3在 2 93细胞中同源重组得到重组病毒CNHK5 0 0。扩增、纯化病毒 ,用TCID5 0方法测病毒滴度。通过病毒增殖实验观察重组病毒的选择性增殖能力。结果　成功构建了由双重调控选择增殖型腺病毒CNHK5 0 0 ,病毒滴度为 1.9× 10 10 pfu/ml ,增殖实验结果证实CNHK5 0 0可以选择性地在端粒酶阳性肿瘤中增殖。结论　CNHK5 0 0为肿瘤的生物治疗提供了一种新的策略。     

基因-病毒治疗系统CNHK200-hA对肿瘤的治疗作用

肿瘤是目前人类死亡的主要原因之一，但传统的治疗手段对肿瘤尤其是中、晚期肿瘤效果不理想，同时存在较大的毒副作用。近年来不断涌现新的治疗策略，如基因治疗、病毒治疗、血管抑素蛋白治疗等。但单独使用均存在缺陷。因此，我们设想构建了一个能携带angiostatin k1—5基因又能靶向肿瘤细胞、在肿瘤细胞中特异增殖、复制的基因一病毒治疗系统观察其在体内对肺癌的治疗作用。     

新型的病毒-基因治疗系统CNHK500-hγ的构建

目的研制出一种新的基因-病毒治疗系统。方法通过基因操作技术将主要晚期启动子(MLP)调控的人干扰素-γ基因插入腺病毒E1A基因受hTERT启动子调控、E1B基因受HRE启动子调控的增殖病毒载体质粒PXC70-HRE-TP的E1A上游,得到腺病毒质粒pSG500-hγ。通过pSG500-hγ与质粒pBHGE3在293细胞中同源重组得到重组病毒CNHK500-hγ。用TCID50方法测定病毒滴度。通过增殖实验观察重组病毒的选择性增殖能力。利用ELISA法检测人干扰素-γ抗癌基因的表达。结果CNHK500-hγ的病毒滴度为4×109pfu/ml,增殖实验结果证实CNHK500-hγ可以选择性地在端粒酶阳性的肝癌细胞中增殖,CNHK500-hγ所携带的人干扰素-γ基因在肝癌细胞株中的表达量(442μg/L)明显高于携带该基因的非增殖型腺病毒载体(120μg/L)Ad-hγ(P<0.005)。结论CNHK500-hγ是一种具备治疗肝癌潜力的新型基因-病毒治疗系统。     

携带小鼠白细胞介素-12基因的增殖型腺病毒对胃癌细胞的作用

目的观察携带小鼠白细胞介素12(mIL12)基因的增殖型腺病毒载体对胃癌细胞的杀伤作用及mIL12表达情况。方法以携带目的基因的增殖型腺病毒CNHK200mIL12感染人胃癌细胞株SGC7901、人正常肝细胞株L02。首先,通过荧光显微镜下观察、细胞杀伤实验等观察病毒对细胞的杀伤能力;其次,通过Westernblot分析及双抗体夹心法(ELISA)检测mIL12表达情况。结果CNHK200mIL12感染SGC7901后,当MOI=10时即可杀伤大部分的肿瘤细胞,与ONYX015相当,而对正常细胞无明显杀伤。ELISA检测表明mIL12基因表达量达(267.2±34.6)ng/5×105个细胞/48h,较复制缺陷型腺病毒载体高近百倍。结论CNHK200mIL12能在胃癌细胞中复制及增殖杀死胃癌细胞,并高水平表达目的基因。     

非增殖型和靶向增殖型腺病毒携带TRAIL基因治疗肝癌的实验研究

目的比较携带人TRAIL基因的增殖型腺病毒（CNHK500-hTRAIL）和非增殖型腺病毒（Ad-hTRAIL）对TRAIL基因的表达以及对SMMC-7721肝癌细胞的杀伤能力。方法通过病毒增殖实验评估增殖型腺病毒CNHK500-hTRAIL的选择性增殖能力。通过MTT实验,评估增殖型腺病毒CNHK500-hTRAIL以及非增殖型腺病毒Ad-hTRAIL对人正常肝细胞株L02、人肝癌细胞株SMMC-7721的杀伤能力。采用ELISA法检测CNHK500-hTRAIL和Ad-hTRAIL感染SMMC-7721肝癌细胞后TRAIL基因的表达情况。以及通过流式细胞术（FCM）检测其对细胞早期凋亡的影响。结果CNHK500-hTRAIL能选择性地在SMMC-7721细胞内大量增殖,感染96 h后增殖达225137倍,在极低的MOI值（MOI=0.1）即可大量杀伤SMMC-7721细胞,明显强于Ad-hTRAIL,而对L02细胞无明显杀伤。CNHK500-hTRAIL和Ad-hTRAIL感染SMMC-7721细胞后,其TRAIL基因表达量,前者是后者的近10倍;CNHK500-hTRAIL可选择性地诱导SMMC-7721细胞早期凋亡,其能力显著高于Ad-hTRAIL。结论靶向增殖型腺病毒载体携带TRAIL基因对肿瘤细胞的杀伤能力和目的基因的表达,明显优于传统的非增殖型腺病毒载体,应用前景广阔。     

新型增殖性腺病毒的构建及对肝癌细胞的抑制

目的 构建携带p53基因新型增殖性腺病毒CNHK600-p53,研究其对肝癌细胞株抑制效应是否优于Ad-p53.方法 PCR扩增p53基因,利用酶切连接方法 将其插入CNHK600载体,PCR鉴定.经293细胞包装成病毒,抽提病毒DNA,PCR鉴定.氯化铯密度梯度离心法纯化病毒,TCID50 方法 测病毒滴度.病毒增殖实验检测病毒在不同细胞增殖能力.四甲基偶氮唑盐(methyl-thiazolyl tetrazolium assay,MTT)法观察CNHK600-p53、Ad-p53两种病毒分别对肝癌细胞株的抑制率.结果 成功构建新型增殖性腺病毒载体CNHK600-p53;293细胞包装成病毒,PCR方法 鉴定无野生型病毒存在;病毒滴度为1.99×10~（10）pfu/ml;CNHK600-p53在肝癌细胞HepG2、SMMC-7721内复制能力明显高于正常肝细胞HEL-1和L02.对6种肝癌细胞(PLC/PRF5、SMMC7721、HepaG2、BEL-7402、BEL-7404、QGY-7703)而言,随着MOI值的不断增高.其对肝癌细胞的抑制作用也不断增强;在相同MOI情况下,CNHK600-p53组较Ad-p53组的细胞抑制率高(P＜0.05).当细胞抑制率达到80%以上时.两组之间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 利用新型增殖性腺病毒CNHK600一p53较 Ad-p53能更有效的抑制肝癌细胞,可能成为肝癌的基因治疗更有效的一种基因治疗手段.     

携带γ-干扰素的溶瘤病毒CNHK300-mIFN-γ治疗肝癌

目的 观察鼠源γ-干扰素(mIFN-γ)基因插入溶瘤腺病毒CNHK300后,该病毒对不同的肝癌细胞株及其裸鼠移植瘤的增殖力及特异性杀伤作用.方法 用噻唑蓝(MTT)法观察CNHK300-mIFN-γ(简称CNHK300-Mγ)对人正常肝细胞WRL-68、人肝癌细胞SMMC-7721、HepG Ⅱ的特异性杀伤作用.裸鼠肝癌SMMC-7721模型观察CNHK300-Mγ、CNHK300和ONYX-015的抗肿瘤疗效,并用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中mIFN-γ的表达量.结果 CNHK300-Mγ能选择性地杀伤肝癌细胞,在肿瘤细胞中半数抑制浓度(IC50)＜1,而在正常肝细胞中为370.肝癌模型中,CNHK300-Mγ治疗组能表达mIFN-γ,治疗结束后第3天和第7天血清中的mIFN-γ分别为(231±101)ng/L和(1733±191)ng/L.CNHK300-Mγ具有明显的肿瘤生长抑制作用,与CNHK300、ONYX2015和对照组的差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 mIFN-γ的插入使病毒对肿瘤细胞的杀伤能力提高,CNHK300-Mγ具有明显的肿瘤生长抑制作用.

Abstract：

Objective To study the effect of mouse interferon-γ (mIFN-γ) insertion on the selective replication and cytotoxicity of a tumor-specific oncolytic adenovirus CNHK300 in hepatocellular carcinoma (HCC) cells and HCC xenografts. Methods The cytotoxicity of CNHK300-mIFN-γ (CNHK300-Mγ) was examined by methyl thiazol tetrazolium (MTT) colorimetric assay in normal and HCC cells.Healthy nude BALB/C mice were injected with the SMMC-7221 cells. Forty mice with tumors of 5-8 mm in diameter were randomly divided into 4 groups of 10 mice: CNHK300-Mγ group (CNHK300-Mγ was injected into the tumor once every other day for 5 times) , CNHK300 group ( CNHK300 was injected) , ONYX-015 group (ONYX-015 was injected) , and control group (diluent of virus was injected). Seven, 14, 21, 28, 35, and 42 days after the initial injection the size of tumor was examined ( Tumor volume was estimated as a × b2 × 0. 5 , where a and b were the maximal and minimal diameters, respectively). Forty-eighth after the finish of the whole course of treatment, the mice were killed. Twenty-four mice with the same tumors were randomly divided into 3 groups of 8 mice: CNHK300-Mr group, CHNK300 group and control group.The mice were killed in half, 3, 7 days after the last injection. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the expression of mIFN-γ in blood. Results CNHK300-Mγ could selectively kill tumor cell lines, whose 50% inhibitory concentration (IC50) was under 1 in tumor cells and 370 in normal liver cells. ELISA showed that the expression of mIFN-γ in the blood of the CNHK300-Mγ group was (231 ± 101) ng/L or (1733 ± 191) ng/L in 3 days or 7 days after virus infection, while no mIFN-γ could be detected in CHNK300 group and control group. The tumor size in the CNHK300-Mr group was significantly smaller than in the CNHK300 group, ONYX-015 group, and control group (P＜0. 05). Conclusion Being capable of specifically killed HCC cells and mediating effective expression of therapeutic gene in vivo, CNHK300-Mγ holds a splendid future as a potential antitumor agent.     

Expression of angiostatin cDNA in a murine renal cell carcinoma suppresses tumor growth in vivo

Objectives. To investigate the effectiveness of angiostatin gene therapy for renal cancer using a mouse model. The generally poor prognosis of advanced renal cancer indicates the need for new therapeutic modalities. The dependency of solid tumor growth on angiogenesis suggests that antiangiogenic therapy would be effective against renal cell carcinoma, which is generally a hypervascular tumor.Methods. Murine renal cancer cells (Renca) transfected with murine angiostatin cDNA (AST-Renca) were subcutaneously implanted in BALB/c mice. Subsequently, the macroscopic appearance and volume of tumors were evaluated once per week. Renca cells transfected with empty plasmid DNA (mock-Renca) were used as a control. In addition, histologic sections of tumor were analyzed for neovascularization on the basis of an immunohistochemical analysis for CD31. The antitumor effect of AST-Renca on a parental Renca tumor at a distant site was also evaluated.Results. The mean volume of AST-Renca tumors was significantly less than that of the control vector-transfected tumors 3 weeks after implantation. In the cell proliferation assay, the expression of angiostatin did not inhibit the proliferation of Renca cells in vitro. Immunohistochemical analysis of neovascularization by staining with anti-CD31 antibody revealed that angiostatin suppressed tumor vessel formation. Moreover, implantation of AST-Renca inhibited the growth of parental Renca implanted simultaneously at a distant site.Conclusions. Expression of an angiostatin transgene can suppress the growth of murine renal cancer through the inhibition of tumor-induced angiogenesis. Angiostatin gene therapy may be effective against renal cancer.     

携带IL-24的溶瘤腺病毒对裸鼠乳腺癌移植瘤的抑制作用

目的 构建携带IL-24基因的溶瘤腺病毒CNHK600-IL24,评估该病毒在裸鼠体内对乳腺癌的抑瘤能力.方法 将IL-24基因插入腺病毒穿梭载体SG502-△CR2,与5型腺病毒骨架载体pPE3共转染至293细胞,获得溶瘤腺病毒CNHK600-IL24.建立乳腺癌原位成瘤模型、尾静脉注射及左心室注射模拟转移瘤模型,通过尾静脉注射CNHK600-IL24,应用"活体内光学成像系统"动态地观察病毒的疗效.结果 CNHK600-IL24经测序及PCR鉴定正确,滴度为1.9×1010pfu/ml.乳腺癌原位成瘤模型:对照组的光子数以及肿瘤体积均明显高于CNHK600-IL24各治疗组(P＜0.05).CNHK600-IL24治疗后肿瘤组织出现明显的坏死,肿瘤细胞发生显著的凋亡,免疫组化检测可见肿瘤细胞内Hexon和IL-24的表达.尾静脉注射模拟转移瘤模型:对照组的裸鼠大部分于38 d前死亡,而CNHK600-IL24组的生存天数明显延长(P＜0.05).左心室注射模拟转移瘤模型:活体内光学成像可见对照组与治疗组之间具有明显差别.结论 高滴度的溶瘤腺病毒CNHK600-IL24对于乳腺癌具有明显的抑瘤效果.     

分泌型凋亡素真核表达载体的构建及对肝癌细胞HepG2凋亡的影响

目的 构建含有NT4和HA2-TAT的分泌型VP3真核表达载体,并观察其表达对人肝癌细胞HepG2和小鼠成纤维细胞NIH3T3的影响.方法 构建了含鸡贫血病毒VP3基因和NT4、HA2-TAT基因的分泌型真核表达载体--NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体.体外转染人肝癌细胞HepG2和小鼠成纤维细胞NIH3T3,用MTT法和流式细胞学,检测凋亡素融合基因诱导细胞凋亡的效果.结果 携带融合基因的重组腺相关病毒感染人肝癌HepG2细胞48 h后,显示了很强的诱导肿瘤细胞凋亡的能力.而对小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞无明显凋亡作用.结论 分泌型NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体转染细胞后能够被正常分泌、穿膜并特异性诱导肿瘤细胞凋亡,为肿瘤的基因治疗提供了新的思路.     

分泌型凋亡素真核表达载体的构建及对肝癌细胞HepG2凋亡的影响

目的 构建含有NT4和HA2-TAT的分泌型VP3真核表达载体,并观察其表达对人肝癌细胞HepG2和小鼠成纤维细胞NIH3T3的影响.方法 构建了含鸡贫血病毒VP3基因和NT4、HA2-TAT基因的分泌型真核表达载体--NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体.体外转染人肝癌细胞HepG2和小鼠成纤维细胞NIH3T3,用MTT法和流式细胞学,检测凋亡素融合基因诱导细胞凋亡的效果.结果 携带融合基因的重组腺相关病毒感染人肝癌HepG2细胞48 h后,显示了很强的诱导肿瘤细胞凋亡的能力.而对小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞无明显凋亡作用.结论 分泌型NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体转染细胞后能够被正常分泌、穿膜并特异性诱导肿瘤细胞凋亡,为肿瘤的基因治疗提供了新的思路.     

分泌型凋亡素真核表达载体的构建及对肝癌细胞HepG2凋亡的影响

目的 构建含有NT4和HA2-TAT的分泌型VP3真核表达载体,并观察其表达对人肝癌细胞HepG2和小鼠成纤维细胞NIH3T3的影响.方法 构建了含鸡贫血病毒VP3基因和NT4、HA2-TAT基因的分泌型真核表达载体--NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体.体外转染人肝癌细胞HepG2和小鼠成纤维细胞NIH3T3,用MTT法和流式细胞学,检测凋亡素融合基因诱导细胞凋亡的效果.结果 携带融合基因的重组腺相关病毒感染人肝癌HepG2细胞48 h后,显示了很强的诱导肿瘤细胞凋亡的能力.而对小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞无明显凋亡作用.结论 分泌型NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体转染细胞后能够被正常分泌、穿膜并特异性诱导肿瘤细胞凋亡,为肿瘤的基因治疗提供了新的思路.