c-Raf基因对大肠癌细胞生长的作用及其分子机制研究

摘 要：［目的］ 通过转染siRNA沉默c-Raf基因以探讨其在大肠癌细胞生长中的作用及其相关分子机制。［方法］通过阳离子脂质体介导的方法将siRNA转染入大肠癌细胞HCT116和SW620,经Western blot验证siRNA的干扰效果。经MTT法、Transwell实验、细胞克隆形成实验和流式细胞术研究下调c-Raf基因对HCT116和SW620增殖、迁移和相关细胞活力的影响。采用Western blot法检测转染siRNA后相关细胞周期蛋白水平。［结果］ HCT116和SW620转染后细胞活力明显下降,转染siRNA 48h后HCT116与SW620细胞的抑制率分别为34%、28%。流式细胞术发现HCT116和SW620在c-Raf基因下调后,较多细胞滞留在G1期(P<0.05)。Western blot实验发现转染siRNA后细胞p-Cdc2、E2F1、CyclinD1表达水平均有下降(P<0.05)。siRNA转染HCT116 和SW620细胞后,细胞凋亡比例分别为9.68%±2.37%、7.29%±1.68%,均高于对照组(P<0.05)。siRNA转染HCT116 和SW620细胞后Caspase-3相对水平分别为0.57±0.11、0.47±0.09,Bcl-2相对水平分别为0.16±0.05、0.23±0.04,与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。siRNA转染HCT116和SW620细胞后N-cadherin相对水平分别为0.24±0.07、0.22±0.04,E-cadherin相对水平分别为0.47±0.12、0.58±0.13,与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。［结论］通过下调c-Raf基因的表达可将大肠癌细胞阻滞在G1期,促使细胞发生凋亡,同时抑制大肠癌细胞发生EMT转化。     

miR-340通过下调 CCND1 表达增加结直肠癌细胞对5-Fu的耐药

目的:探讨细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的编码基因CCND1 miR-340介导的逆转结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶(5-Fu)耐药的机制.方法:采用瞬时转染技术将结直肠癌细胞HCT116、SW480株分别转染si-CCND1和miR340-mimic.应用MTT法检测转染后的结直肠癌细胞对5-Fu敏感性的变化,应用双荧光素酶试验验证CCND1对miR340参与的影响结直肠癌细胞对5-Fu敏感性的影响.结果:瞬时转染siCCND1和过表达miR-340后,结直肠癌HCT116和SW480细胞的IC50值均显著低于对照组(10,10 vs 20 μmol/L和20,20 vs 40 μmol/L,均P＜0.05).共转染CCND1 3'UTR野生质粒和miR-340 inhibitor的结直肠癌HCT116和SW48细胞荧光素酶的活性显著高于共转染空载体和mimic细胞(P＜0.01).结论:CCND1作为不良因子通过抑制miR340的表达进而发挥增加结直肠癌细胞对5-Fu耐药的作用.     

MiR-885对结直肠癌细胞奥沙利铂化疗敏感性的影响

摘 要：［目的］ 探究miR-885对结直肠癌细胞奥沙利铂化疗敏感性的影响。［方法］利用qRT-PCR 验证在耐药和敏感结直肠癌蜡块组织中miR-885的相对表达量；运用质粒转染方法沉默结直肠癌细胞系HCT116中miR-885基因，按照miR-885表达水平分为2组：miR-NC和miR-885 inhibitor组，并且利用qRT-PCR验证转染效率。将细胞分成4组，分别是阴性对照组(NC)、阴性对照加奥沙利铂组（L-OHP）、miR-NC加奥沙利铂组（L-OHP/miR-NC）和miR-885 inhibitor加奥沙利铂组（L-OHP/miR-885 inhibitor）。利用CCK-8法检测HCT116细胞活性；Transwell检测HCT116细胞的侵袭能力；流式细胞术检测HCT116细胞的细胞周期。［结果］ 相比于癌旁正常组织（1.31±0.36），耐药组织（2.75±0.82）中miR-885的表达量增加，而敏感组织（0.31±0.14）中miR-885的表达量降低。在miR-885组中miR-885表达水平（0.02±0.01）相对于miR-NC组（0.80±0.19）呈显著降低(P<0.05）。与L-OHP/miR-NC组（0.77±0.14）相比，L-OHP/miR-885 inhibitor组（0.48±0.23）细胞活性降低（P<0.05）。与L-OHP/miR-NC组（169±25）相比，L-OHP/miR-885 inhibitor组（28±9）细胞的侵袭数量减少（P<0.05）。与NC组G0/G1期（42.27±3.33）相比，L-OHP组（3.33±0.41）细胞比例降低（P<0.001），与NC组S期（32.19±2.29）相比，L-OHP组（53.29±3.04）细胞比例增多(P<0.05)，与NC组（16.32±2.29）G2/M期相比，L-OHP组（4.83±0.76）细胞比例减少(P<0.05)。同时，与L-OHP/miR-NC组（5.07±0.31）G0/G1期相比，L-OHP/miR-885 inhibitor组（45.59±1.95）细胞比例增加（P<0.001），与L-OHP/miR-NC组（42.71±2.58）S期相比，L-OHP/miR-885 inhibitor组（12.72±1.60）细胞比例降低（P<0.001），与L-OHP/miR-NC组(18.19±1.30)G2/M期相比，L-OHP/miR-885 inhibitor组（2.55±0.51）细胞比例减少（P<0.01）。［结论］ 沉默miR-885能够增强结直肠癌细胞HCT116对奥沙利铂化疗敏感性，miR-885可能成为结直肠癌治疗的新靶点。     

EZH2-miR-139-5p通路在大肠癌中的表达及对化疗耐药性的影响

摘 要：［目的］ 探讨EZH2-miR-139-5p通路在大肠癌中的表达及对化疗耐药性的影响。［方法］ 选取54例大肠癌患者癌组织及癌旁组织,比较癌组织和癌旁组织EZH2及miR-139-5p mRNA水平,并分析大肠癌组织中EZH2 mRNA与miR-139-5p mRNA水平的相关性。选取6种大肠癌细胞株（LOVO、RKO、HCT116、LS174t、HT29、SW480）,采用Western blot法及RT-PCR法分析各细胞株EZH2蛋白及miR-139-5p mRNA相对表达量。向LOVO细胞株转染siRNA-EZH2后检测miR-139-5p相对表达量,再向SW480细胞株转染EZH2质粒后检测miR-139-5p相对表达量。通过在HCT116细胞内转染miR-139-5p类似物及阴性对照物24h后,加入不同浓度（0、0.465、3.720、29.800、238.000、1904.000μM）奥沙利铂,加药48h后采用CCK8法检测细胞活性。［结果］ 相较于癌旁组织,大肠癌组织EZH2 mRNA水平更高（P<0.05）,而miR-139-5p mRNA水平更低（P<0.05）,且大肠癌组织中,EZH2 mRNA与miR-139-5p mRNA水平呈负相关(r=-0.334,P<0.05)。在高侵袭力细胞株（LOVO、RKO、HCT116）中,EZH2 蛋白相对表达量较低,而miR-139-5p mRNA水平较高;在低侵袭力细胞株（LS174t、HT29、SW480）中EZH2 蛋白相对表达量较高,而miR-139-5p mRNA水平较低。转染siRNA-EZH2的细胞中,miR-139-5p mRNA相对表达量有所上升;转染EZH2质粒的细胞中,miR-139-5p mRNA相对表达量有所下降。在HCT116细胞中转染miR-139-5p类似物48h后,细胞活性随药物浓度有所降低,且降低程度比阴性对照显著。［结论］ MiR-139-5p参与大肠癌化疗药物的耐药机制,并可能通过调控靶基因EZH2从而抑制大肠癌细胞的增殖。     

甲磺酸阿帕替尼联合放疗协同诱导结直肠癌细胞凋亡的体外研究及机制探讨

摘 要：［目的］ 探究甲磺酸阿帕替尼联合放疗对结直肠癌细胞体外抑制作用。［方法］ 体外培养结直肠癌细胞株HCT116、SW480和HT29，采用MTT法检测HCT116、SW480和HT29细胞株对甲磺酸阿帕替尼的敏感性，以药物敏感性最高的细胞进行后续联合治疗，分为对照组、药物组、放疗组和联合组，应用MTT检测不同处理组细胞的增殖抑制能力，筛选最强联合抑制效果时的药物浓度作为后续试验；Annexin Ⅴ-FITC/PI联合流式细胞术分析不同处理组对HCT116细胞凋亡和细胞周期的影响；ELISA分析不同处理组上清中VEGF分泌水平；Western blot 试验检测VEGFR2、VEGFA、ERK/p-ERK、STAT3/p-STAT3、BAX和BCL2蛋白的表达。［结果］ 甲磺酸阿帕替尼抑制结直肠癌细胞HCT116、SW480和HT29体外增殖且具有剂量依赖性，半数致死浓度(IC50)分别为14.90 μmol/L、25.99 μmol/L和24.19 μmol/L，HCT116细胞药物敏感性显著高于SW480和HT29细胞（P均<0.05），以敏感性最高的HCT116细胞进行不同分组，结果显示甲磺酸阿帕替尼浓度为8 μmol/L时，联合组对比药物组和放疗组显示更强的增殖抑制能力（65.97% vs 25.83% vs 21.97%，P均<0.001）；不同处理组细胞凋亡率有差异（F=237.930，P=0.000），对比药物组（8 μmol/L）和放疗组，联合组细胞凋亡率显著增加［（6.55±0.58）% vs （12.69±0.71）% vs （29.11±2.08）%，P均<0.001］；联合组未能增强阿帕替尼（8 μmol/L）对细胞周期的阻滞（P=0.09）；细胞上清中VEGF分泌水平在4组间无差异（P>0.05），联合组VEGFA蛋白的表达显著下调；但放疗未增加阿帕替尼（8 μmol/L）对VEGFR2的抑制作用；对比药物组（8 μmol/L）和放疗组，联合组增加了促凋亡基因BAX蛋白表达，并抑制抗凋亡基因BCL2蛋白表达，此外联合组处理后p-STAT3蛋白的磷酸化水平显著降低，STAT3和ERK总蛋白水平无改变。［结论］ 甲磺酸阿帕替尼联合放疗可能通过抑制STAT3通路诱导细胞凋亡，从而抑制HCT116细胞的增殖。     

G6PD对大肠癌细胞生长侵袭的影响及其与HKⅡ的相关性

目的 探讨G6PD对大肠癌HCT116和SW480细胞生长侵袭的影响,以及G6PD与HKⅡ在大肠癌及其癌旁上皮组织中的表达和两者的相关性。方法 将体外培养的大肠癌HCT116和SW480细胞进行G6PD过表达和干扰处理。Western blot法检测细胞中G6PD和HKⅡ的蛋白表达水平;流式细胞术分析细胞周期进程;葡萄糖氧化酶法检测培养液中葡萄糖的含量;划痕实验检测细胞侵袭能力;免疫组织化学法检测大肠癌及癌旁组织中G6PD与HKⅡ蛋白的表达水平。结果 过表达实验中,与Flag转染组相比,Flag-G6PD转染组HCT116和SW480两种细胞培养液中葡萄糖浓度、S期所占比例及侵袭能力均无明显变化;干扰实验中,与阴性对照转染组相比,G6PD-Homo-1504转染组两种细胞的葡萄糖浓度显著升高,S期所占比例和侵袭能力显著降低。G6PD与HKⅡ表达水平呈正相关。结论 干扰G6PD减少了大肠癌细胞葡萄糖的消耗,抑制了细胞的增殖和侵袭能力;同时G6PD对HKⅡ可能存在调控作用。     

RNA干扰 Rac1基因表达对结直肠癌LoVo细胞骨架和细胞周期的影响

目的:观察Rac1蛋白在结直肠癌细胞中的表达,并分析其与结直肠癌LoVo细胞骨架、细胞周期和细胞凋亡的相关性.方法:Western blotting测定5种结直肠癌细胞株(LoVo,SW480,SW620,SW1116,HT29)中Rac1蛋白的表达;Rac1-shRNA质粒转染LoVo细胞后,激光共聚焦显微镜观察LoVo细胞骨架的变化,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡的变化.结果:5种结直肠癌细胞株中均有Rac1蛋白的高表达.Rac1基因沉默后,LoVo细胞中交联状态的F-actin网明显减少且紊乱,G0/G1期细胞比例较对照组显著增加[(74.63 ±4.40)％ vs(56.46 ±3.09)％,P＜0.05],而S期细胞比例较对照组显著减少[(12.87±1.77)％vs(29.66±1.92)％,P＜0.05];Rac1-shRNA转染组LoVo细胞凋亡率较对照组显著增加[(25.31±2.05)％vs(9.38±1.16)％,P＜0.05].结论:RNA沉默Rac1基因的表达影响了LoVo细胞骨架的形成和细胞周期,为以Rac1为靶点治疗结直肠癌提供了实验依据.     

POKemon、p14ARF基因链在大肠癌细胞系的表达及其临床意义

目的 研究POKemon、p14ARF基因在结直肠癌细胞系中的表达情况.方法 采用反转录.聚合酶链反应(RT-PCR)、细胞免疫化学技术检测POKemon、p14ARF在5种人类结直肠癌细胞中的表达.结果 POKemon在SW480、SW480/M5、LOVO、SW620中阳性表达,在HCT116阴性表达;p14ARF在HCT116阳性表达,其余细胞均阴性表达.结论 结直肠癌细胞系中存在POKemon的表达,且与p14ARF作用呈负相关.

Abstract：

Objective To study the expression of POKemon and pl4ARF genes in colorectal cancer cell lines. Methods The expressions of POKemon and pl4ARF were detected in 5 human colorectal cancer cell lines by RT-PCR and immucytochemistry method. Results The expressions of POKemon were positive in cell lines of SW480, SW480/M5, SW620 and LOVO, and were negative in HCT116. The expression of pl4ARF was positive in HCT116 and negative in other cell lines. Conclusion POkemon is expressed positively in colorectal cancer cell lines and its function is negatively correlated with pl4ARF.     

黏着斑激酶在结肠癌细胞株中的表达及其RNA干扰载体的构建

目的 检测结肠癌细胞株中FAK的蛋白表达水平,并构建FAK靶向RNA干扰重组体.方法 通过免疫细胞化学SP法和Western Blotting技术检测结肠癌细胞株SW480、HCT116、HT29、LOVO中FAK的表达水平;针对FAK序列设计并合成具有小发夹结构的两条DNA序列,经退火后再重组入pGenesil-1载体,并转化大肠杆菌DH5α,经酶切及测序鉴定后转染结肠癌HT29细胞株.结果 FAK在SW480、HCT116、HT29、LOVO等细胞株中均有较高表达,其中HT29为最高.重组体经鉴定与设计序列一致,并稳定转染HT29细胞.结论 FAK在4个细胞株中高表达可能对结肠癌及其进展有重要作用;FAK靶向RNA干扰重组体的成功构建和转染,为结直肠癌新的基因治疗方法提供可能的思路.     

负载肿瘤干细胞膜微粒的DC-CIK/CTL细胞协同西妥昔单抗对结直肠癌细胞的杀伤作用及其机制

目的:探讨负载结直肠癌干细胞膜微粒(membrane microparticles,MMPs)DC-CIK与西妥昔单抗(Cetuximab,C225)对EGFR靶向药耐药结直肠癌细胞的靶向协同杀伤作用及其机制.方法:PCR法检测结直肠癌SW480、SW620、HCT1 16株细胞k-RAS突变状态,无血清悬浮细胞培养法富集SW480、HCT116肿瘤干细胞,RT-PCR检测干细胞标志物Sox-2和Oct-4.提取外周血单个核细胞培养DC与CIK,将结直肠癌干细胞MMPs负载DC后再与CIK共孵育.形态观察及MTT法分别检测DC-CIK/CTL细胞及其培养上清、C225单独和合并处理对SW480、SW620、HCT116及其干细胞的杀伤效应;RT-PCR检测DC-CIK/CTL细胞培养上清、C225单独和合并作用对SW480、SW620、HCT116细胞凋亡相关基因Fas和上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关E-钙黏蛋白和波形蛋白基因的表达,划痕实验测定DC-CIK/CTL细胞培养上清、C225单独及联合作用对结直肠癌细胞侵袭行为影响.结果:SW480、SW620和HCT116细胞均为k-RAS突变型;富集培养获得的结直肠癌干细胞样细胞高表达Sox-2和Oct-4 mRNA.MMPs负载DC-CIK/CTL细胞及其分泌上清与C225对结直肠癌细胞的抑制有协同作用.C225与MMPs负载DC-CIK/CTL上清联合组相对于两者单独作用组能提高Fas与E-钙黏蛋白基因的表达;联合组的迁移率比两者单独作用组小.结论:负载结直肠癌干细胞MMPs的DC-CIK/CTL细胞对EGFR靶向药耐药结直肠癌细胞有体外特异靶向杀伤效应,且与C225显著协同,其发生机制与逆转细胞EMT和诱导细胞凋亡有关.     

食管平滑肌瘤10例临床治疗体会

我院１９７５年６月～１９９０年７月共收治食管平滑肌瘤１０例，占同期食管肿瘤总数的０．１９２％（１０／１０９２）。位于食管上段２例，中段５例，下段３例。Ｘ线食管钡餐造影是诊断本病的主要方法。行食管粘膜外肿瘤摘除９例，食管部分切除１例，效果良好。本文就其诊断与手术治疗进行了讨论。     

仙人掌原液毒性的初步研究

背景与目的： 研究仙人掌原液的毒性。 材料与方法： 小鼠急性毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、大鼠30 d喂养试验。 结果： 仙人掌原液雌、雄小鼠LD50均大于20.0 g/kg,属无毒物质;Ames试验、微核试验和精子畸形试验结果均为阴性;大鼠30 d喂养试验结果显示该样品30 d喂养对大鼠各项观察指标未见毒性作用。结论： 在本次实验条件下,仙人掌原液为无毒物质,未显示有遗传毒性和亚急性毒性作用。     

Assessment of the degree of carcinogenicity of small doses of nitrites

Chronic experiments on CBA and C57B1 mice and acute experiments on CBA mice established: (a) carcinogenic effect of sodium nitrite given continuously with drinking water (0.1; 1.0 and 10.0 maximum allowable concentration) in combination with morpholine fed with bread, and (b) endogenous synthesis of nitrosomorpholine as a result of simultaneous intragastric administration of same doses of sodium nitrite and morpholine. Also, nitrosomorpholine and N-nitrosodimethylamine synthesis was observed in vitro following addition of low-dose sodium nitrite, morpholine and amidopyrine to human gastric juice. Carcinogenic hazard associated with low-dose nitrite consumption in humans is discussed.     

仙人掌原毒性的初步研究

背景与目的:研究仙人掌原液的毒性。材料与方法:小鼠急性毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、大鼠30 d喂养试验。结果:仙人掌原液雌、雄小鼠LD50均大于20.0 g／kg,属无毒物质;Ames试验、微核试验和精子畸形试验结果均为阴性;大鼠30 d喂养试验结果显示该样品30 d喂养对大鼠各项观察指标未见毒性作用。结论:在本次实验条件下,仙人掌原液为无毒物质,未显示有遗传毒性和亚急性毒性作用。     

胰头癌手术切除可能性的术前评价

目的通过总结胰头癌病人的临床表现和影象学检查结果来评价手术切除的可能性。方法总结32例胰头癌病人的临床表现和CT、磁共振（MRI）检查结果,判断肿瘤是否已发生邻近浸润或远处转移,以此来评价其手术切除的可能性。结果在22例作CT检查的病例中,判断正确的为17例,准确率为77．3%。作MR检查9例,全部判断正确,准确率为100%。结论某些特殊的临床表现和CT、MR检查对判断肿瘤是否发生邻近浸润或转移有较大价值,为术前评价手术切除的可能性提供依据。     

胆囊癌29例分析

目的探索胆囊癌的防治方法。方法分析29例胆囊癌病人临床资料、治疗方法及结果。结果术前诊断明确者21例，剖腹探查发现已属晚期，9例为Ⅳ期行根治术，12例为Ⅴ期未行根治术，均于术后1年内死亡。术前怀疑胆囊癌者5例，剖腹探查冰冻切片证实为Ⅴ期及Ⅳ期者各1例，Ⅴ期未行根治术，Ⅳ期行根治术，均于术后1年内死亡；Ⅲ期者3例，行胆囊癌根治术分别于术后10月、13月、17月死亡。2例术中冰冻切片发现的Ⅱ期胆囊癌，行胆囊癌根治术，分别于术后23月、26月死亡。1例意外胆囊癌属Ⅰ期胆囊癌，术后5年半死亡。结论要减少胆囊癌危害，重在及时治疗胆囊结石。     

中晚期贲门癌148例的外科治疗

目的　总结贲门癌手术治疗影响生存率的因素 ,提供今后工作参考。方法　对 14 8例经手术治疗的贲门癌患者进行术后并发症、绝对生存率的X2 检验。结果　本组切除率为 94.5 9% ,近半胃切除占 72 .14 % ,1、3、5年生存率分别为 67.9%、45 %和 2 4.3 %。病期、外侵程度和淋巴结转移等因素对 5年生存率有显著影响 (P <0 .0 1)。术后并发症以吻合口瘘及肺癌并发症为多见 ,其发生率为 3 .6% ,手术死亡率 1.4%。结论　提高生存率的关键在于早期诊断 ,根治手术和术后积极综合治疗。