不对称PCR制备单链探针检测登革Ⅱ型病毒复制型RNA和复制中间体RNA

登革病毒是具包膜的单股正链RNA虫媒病毒 ,病毒的复制过程发生在感染细胞胞浆 ,复制型 (RF)RNA是病毒半保留复制的循环模板 ,复制中间体 (RI)RNA的合成则是病毒复制所必需的。经RT PCR获得的DNA模板进行不对称PCR扩增 ,当限制性引物终浓度为 2 5 0nmol L ,两引物比例为 1 0 0∶1时 ,即得到不对称PCR的预计单链和双链DNA产物。此单链产物用于标记探针进行核酸杂交。结果表明不对称PCR制备单链探针进行核酸杂交可用于检测病毒复制型RNA和复制中间体RNA的合成     

逆转录和PCR检测HCV RNA负链

PCR是一种极其敏感的检测方法,但用该方法检测组织中的HCV时就不能鉴别是血中的HCV沾染组织表面,还是组织中本身就存在。HCV是单股正链RNA病毒,在HCV复制细胞中就会有负链RNA作为模板合成基因组RNA。作者检测了血浆、外周血单个核细胞(PBMC),以及肝组织中的正链和负     

脊髓灰质炎病毒的多尿苷酸聚合酶和RNA复制酶具有同样的病毒多肽

脊髓灰质炎病毒的基因组是单链RNA,在感染的细胞质内借助于依赖RNA的RNA聚合酶(复制酶)进行复制。这种复制酶可能会有一种或多种病毒编码的蛋白质,但证据还不充分。作者曾分离到一种可溶性的脊髓灰质炎病毒特异的依赖RNA的RNA聚合酶,多尿苷酸聚合酶,     

负链RNA病毒反向遗传学技术的建立及发展应用

负链RNA病毒基因组由单负链RNA构成。其基因组RNA需要被转录为mRNA才能引导病毒蛋白在细胞内合成。使用传统的DNA重组技术对负链RNA病毒进行基因操作已经难以奏效。反向遗传学方法是通过反转录病毒RNA为cDNA,从而构建成含有病毒基因组cDNA的质粒并转染相应细胞产生病毒。通过中间的DNA环节在DNA相对负链RNA病毒基因组进行人工操作,这使得研究者可以自定义产生需要的病毒。因而研究反向遗传学技术的建立、发展过程以及它在相关病毒基因片段结构功能、疫苗研制、外源基因表达、基因治疗等方面的应用很有意义。     

RNA沉寂及其抗病毒效应研究进展

RNA沉寂 (RNAsilencing)是一种新发现的、在RNA水平发挥作用的基因调控机制 ,以序列特异性方式降解病毒、转基因的RNA或内源性mRNA ,发生于真核生物 ,包括在植物细胞中描述的转录后基因沉寂、真菌中的压制现象和动物细胞中的RNA干扰。RNA沉寂发挥作用的一般机制是由dsRNA启动 ,经Dicer酶处理成2 1～ 2 5nt的小片段siRNA ,作为向导序列与核糖核酸酶构成RNA诱导的沉寂复合体 ,降解与dsRNA同源的RNA序列 ,防御外来核酸序列的入侵和调节细胞内基因的表达。作为一种古老的病毒防御机制 ,可通过沉寂同源的病毒基因或沉寂与病毒复制有关的宿主细胞基因 ,在病毒感染的不同时期抑制病毒的复制。RNA沉寂的应用非常广泛 ,在某种意义上 ,RNA沉寂将会产生一场新的生物学革命。     

中药心康口服液抗柯萨奇B3病毒RNA复制作用的研究

目的研究探讨中药心康口服液对感染心肌中柯萨奇B3病毒RNA复制的影响。方法小鼠感染柯萨奇病毒B3(CVB3)诱发急性病毒性心肌炎,于急性期治疗后提取鼠心肌总RNA,用逆转录-聚合酶链反应技术检测心肌CVB3RNA含量,经琼脂糖凝胶电泳后,在凝胶成像系统下观察。结果中药心康口服液能明显降低心肌CVB3-RNA的含量,与病毒对照组比较差异有统计学意义,P<0.01;感染期不同阶段心肌病毒RNA含量的检测显示,心康口服液2个治疗组的病毒含量的检出,并没有随着用药时间的延长而显著降低。结论中药心康口服液能有效地影响心肌CVB3RNA的复制,其对病毒的作用是抑制复制而非杀灭。     

冠状病毒全长cDNA感染性克隆研究进展

冠状病毒是已知RNA病毒中基因组最大的一类病毒,其基因组复制不涉及DNA中间体,所以要进行病毒分子水平上的研究,必须将病毒基因组RNA转换成cDNA,然后构建出cDNA克隆,通过对cDNA克隆的操作间接实现对病毒基因组RNA的操作,从而为冠状病毒基因组研究提供易于操作的技术平台,大大提高了病毒的研究潜力.本文就构建冠状病毒基因组全长cDNA感染性克隆的最新进展做一综述.     

乙肝病毒基因突变的分子流行病学

乙肝病毒 (HBV)是双链 DNA病毒 ,复制过程包含了合成 RNA中间体和逆转录两个过程 ,其核酸长链带有全部病毒蛋白编码 ,共有四个开放读码框架 ,S、C、P、X病毒蛋白 ,对应于HBs Ag、HBc Ag和 HBe Ag以及 DNA聚合酶、HBx Ag。随着乙肝在人群中不断地传播感染以及抗病毒药物如干扰素的应用 ,越来越多的乙肝变异株被人们发现。1　概述HBV变异株在十多年前第一次被英国的研究者鉴定出 ,起初人们并未认识到这种变异株的危害性[1] ,后来在美国鉴定出的表面抗原突变提示了这些突变株对公众健康的潜在影响 [2 ] 。由于基因组读码框架之间…     

RT-PCR检测肝炎和肝癌组织中的HCV复制中间体

应用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)检测11例血清抗HCV阳性的药瘾患者尸检肝组织和10例原发性肝细胞癌(PHC)患者手术切除肝癌组织中HCV基因(正链HCV RNA)和HCV复制中间体(负链HCV RNA)。结果8/11例肝组织和7/10例肝癌组织中正链HCV RNA阳性,其中各有6例负链HCV RNA亦阳性。HCV各基因区的检出率差别较大,5′NC区检出率最高、C区次之、NS区检出率较低。在同例肝(癌)组织中,若负链HCV RNA阳性,则其信号强度与正链基因无明显差别;但未发现肝癌组织中癌细胞分化程度与HCV的检出率有关。上述结果提示HCV感染与肝癌发生有密切关系,HCV的持续复制可能在癌肿形成中起作用。     

用DNA分子克隆技术对RNA病毒的研究

由于产生重组体DNA的技术,有可能制得RNA病毒基因组的DNA复制品,已使对RNA病毒的研究有了革命性的变化,这样制得的DNA复制品就可用来进行限制性内切酶分析与序列分析。因而可以获得对RNA病毒基因组结构方面研究的详细资料。本文作者采用了重组体DNA方法对脊髓灰质炎病毒和逆转录病毒的基因组进行了研究。为了制备一种脊髓灰白质炎病毒RNA基因组的DNA复制品,作者利用寡聚脱氧胸苷酸作引物,逆转录RNA为一负链DNA,再让此单链DNA折回     

复制器：促进病毒在感染细胞内复制的一种“细胞器”

某些正链RNA病毒感染细胞之后,重塑了宿主的细胞内膜,使内膜环境发生改变,形成了专门促进病毒复制的细胞器称为复制器。它是由病毒的非结构蛋白招募特定的细胞蛋白在细胞内膜上形成病毒复制复合物,并在复制器的膜表面作为复制结合位点进行病毒的复制、组装等。文章主要从复制器的结构,病毒复制过程中的功能及其作用机制进行讲述,为进一步研究病毒感染机制提供了参考。     

HBV感染者外周血白细胞中HBVcccDNA检测的临床价值

在HBV感染的肝细胞核内可检测到一种不同形式的病毒DNA——共价闭合环状DNA（HBVcccDNA），不与蛋白共价结合，是乙肝病毒基因组的复制中间体，是病毒mRNA和前基因组RNA转录的模板，它的存在是病毒复制的一个重要指标，也是评价HBV感染状态及药物疗效最重要的指标，但取材困难。文献报道，乙肝患者外周血单个核细胞（PB-MC）中存在HBV—DNA及乙肝病毒复制中间产物RNA，但感染PBMC的HBV是否可在其内进行复制尚有争议。外周血单个核细胞中是否存在HBVcccDNA亦存在争议，临床价值并不确定。我们对105例HBV感染者进行了外周血白细胞HBVcccDNA的检测，现将结果报告如下。     

乙型肝炎病毒正链转录及调节的研究进展

乙型肝炎病毒正链转录体(HBV asRNA),通过与HBV负链转录产生的mRNA互补结合成双链RNA(dsRNA),在核内或胞质中下调病毒的转录与表达,是病毒复制表达的重要自身调节分子。HBV通过抑制正链的转录,保护负链的转录产物作为逆转录及翻译相应病毒蛋白的模板,促进自身的复制与表达。因此,研究HBV正链的转录与调节,能深入对HBV分子病毒学机制的探索,为今后的抗病毒治疗提供新的思路。     

应用逆转录依赖性PCR从微小RNA病毒中合成全长cDNA

微小RNA病毒基因组由长于7kb的正性单键RNA组成、由于其复制的机制，核着酸交换的不同将新合成的基因组区分开来，因此，微小RNA病毒又被称为难种。核苷酸序列的改变可以引起复制速度、抗原性或生化性的改变，而且引起这些变化的突变须通过各自的全长感染性cDNA的修饰进行鉴定。通常全长病毒cDNA的合成包括分子克隆．对是否可以通过体外逆转录依赖性PCR（RT-PCR）产生这样的cDNA很感兴趣．在这一实验中，选用分离的猪水疱病毒UKG27／72，因为它的基因组序列不包含poly（c）序列而其他一些微小RNA病毒基因组中则含有这样的序列…     

磷酸酶PP2CB 抑制RNA 病毒VSV 或SeV 介导的天然免疫应答

目的:研究蛋白磷酸酶PP2CB 在抗RNA 病毒天然免疫应答中的调控作用及其机制。方法:在小鼠腹腔巨噬 细胞中转染PP2CB 的特异siRNA,干扰其表达后通过Q-PCR 和ELISA 观察RNA 病毒诱导的玉型干扰素的产生变化、病毒在 细胞内的复制变化,Western blot 检测TBK1 和IRF3 的磷酸化水平的改变。结果:VSV 感染诱导巨噬细胞中PP2CB 的表达发 生显著改变。过表达PP2CB 抑制HEK293 细胞中IFN-β的转录活化。干扰PP2CB 表达显著升高RNA 病毒VSV 或SeV 诱导 的Ⅰ型干扰素的mRNA 和蛋白表达水平,并抑制VSV 复制。此外,RNA 病毒诱导PP2CB 和TBK1 结合。干扰PP2CB 的表达 能够增强TBK1 和IRF3 的磷酸化。结论:RNA 病毒VSV 或SeV 使蛋白磷酸酶PP2CB 能够结合TBK1 并抑制其磷酸化,下调 玉型干扰素信号通路的活化,从而负向调控RNA 病毒VSV 或SeV 诱导的Ⅰ型干扰素的产生。     

Ty3的离体定点整合需要RNA聚合酶Ⅲ的转录因子

Ty3是酵母中的反转录病毒样因子,定点整合在由Pol Ⅲ转录的基因的上游靠近转录起始位点1～3个核苷酸内。Ty3病毒样颗粒(VLPs),包括Ty3RNA,复制的DNA,以及成熟蛋白质包括整合酶(integrase,IN)。利用VLPs和SUP2 tRNA~(TYr)目标基因建立了一个离体整合检测法。质粒pDLC374含有tRNA~(Tyr)基因,酵母中HIS3基因和一个复制起     

乙型肝炎病毒正链转录及调节的研究进展

乙型肝炎病毒正链转录体（HBV asRNA），通过与HBV负链转录产生的mRNA互补结合成双链RNA（dsRNA），在核内或胞质中下调病毒的转录与表达，是病毒复制表达的重要自身调节分子。HBV通过抑制正链的转录，保护负链的转录产物作为逆转录及翻译相应病毒蛋白的模板，促进自身的复制与表达。因此，研究HBV正链的转录与调节，能深人对HBV分子病毒学机制的探索，为今后的抗病毒治疗提供新的思路。     

脯氨酰羟化酶RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

背景：慢病毒载体可稳定介导基因沉默且具有较高的转染效率。 目的：构建并鉴定脯氨酰羟化酶 RNA干扰慢病毒载体。 方法：针对脯氨酰羟化酶2基因序列设计RNA干扰靶序列,合成靶序列的寡聚DNA,退火形成双链DNA,与经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切的pGCSIL-GFP连接、转化大肠杆菌感受态细胞,产生重组RNA干扰慢病毒表达载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。 结果与结论：PCR和DNA测序证实合成的含脯氨酰羟化酶短发卡RNA慢病毒载体寡核苷酸链正确插入pGCSIL-GFP载体。说明实验成功构建脯氨酰羟化酶基因RNA干扰慢病毒载体。     

反向遗传学技术在负链RNA病毒研究中的建立及应用

反向遗传学技术作为一种新兴的分子生物学实验操作技术,在生命科学研究的诸多领域均有广泛应用,它通过构建RNA病毒的感染性分子克隆,在DNA分子水平上对其进行体外操作,从而达到研究病毒结构与功能的目的。本文就反向遗传学操作技术在负链RNA病毒研究中的建立及应用作一综述。     

反向遗传学技术在负链RNA病毒研究中的建立及应用

反向遗传学技术作为一种新兴的分子生物学实验操作技术，在生命科学研究的诸多领域均有广泛应用，它通过构建RNA病毒的感染性分子克隆，在DNA分子水平上对其进行体外操作，从而达到研究病毒结构与功能的目的。本文就反向遗传学操作技术在负链RNA病毒研究中的建立及应用作一综述。