乳头状甲状腺癌TSHR基因转录表达和启动子区甲基化研究

目的观察抑癌基因促甲状腺激素受体(TSHR)在乳头状甲状腺癌(PTC组)中的表达,分析其启动子甲基化与肿瘤发生的关系。方法选择50例PTC和32例良性甲状腺肿瘤(对照组,包括20例结节性甲状腺肿,12例甲状腺腺瘤)患者,对两组患者手术获取的标本提取RNA后,反转录为cDNA,进行PCR检测TSHR基因的表达情况;运用甲基化特异性PCR(MSP)检测上述组织中TSHR基因启动子区甲基化的情况。结果PTC组患者中有34例(68%)TSHR基因启动子发生甲基化,16例(32%)TSHR基因mRNA表达缺失;对照组患者中有7例(21.9%)TSHR基因启动子发生甲基化,4例(12.5%)TSHR基因mRNA表达缺失。PTC组织TSHR基因启动子甲基化率及TSHR基因mRNA表达缺失率均显著高于对照组(χ2值分别为16.61和4.02,P<0.05)。34例发生了TSHR基因启动子甲基化的PTC患者中,有14例(41.2%)TSHR mRNA表达缺失;16例未发生甲基化的PTC患者中,2例(12.5%)发生了mRNA表达缺失,二者mRNA表达缺失率差异有统计学意义(χ2=4.11,P<0.05)。TSHR基因mRNA在...     

促甲状腺激素受体基因启动子区甲基化与乳头状甲状腺癌的关系研究

目的观察促甲状腺激素受体（TSHR）在乳头状甲状腺癌（PTC）中的表达,分析其基因启动子区甲基化与肿瘤发生的关系。方法选择50例PTC和32例良性甲状腺肿瘤患者（对照组,包括20例结节性甲状腺肿和12例甲状腺腺瘤患者）,对两组患者手术获取的标本提取RNA后,逆转录为cDNA,进行PCR,检测鸭HR基因的表达情况;运用甲基化特异性PCR（MSP）法检测上述组织中TSHR基因启动子区甲基化的情况。结果PTC组患者中,有34例（68．0％）TSHR基因启动子发生甲基化,16例（32．0％）TSHR基因mRNA表达缺失;对照组患者中,有7例（21．9％）TSHR基因启动予发生甲基化,4例（12．5％）TSHR基因mRNA表达缺失,PTC组织TSHR基因启动子区甲基化率及TSHR基因mRNA表达缺失率均显著高于对照组,差异有统计学意义（X^2值分别为16．61和4．02,P〈0．05）。34例发生了TSHR基因启动子区甲基化的PTC患者中,有14例（41．2％）TSHRmRNA表达缺失;16例未发生甲基化的PTC患者中,2例（12．5％）发生了mRNA表达缺失,二者mRNA表达缺失率间差异有统计学意义（X^2=4．11,P〈0．05）。结论PTC患者TSHR基因启动子甲基化发生率显著高于良性甲状腺肿瘤患者,而TSHR基因mRNA的表达则较良性甲状腺肿瘤降低;推测TSHR基因启动子区甲基化可能与PTC的发生、发展相关。     

TSHR和RASSF1A基因甲基化与乳头状甲状腺癌的相关性

目的:研究乳头状甲状腺癌TSHR和RASSF1A基因启动子甲基化的状况,分析两种抑癌基因甲基化与临床病理资料间的关系及两种抑癌基因甲基化的相关性,探讨PTC的发生机制。方法:提取50例PTC组织和32例对照组织DNA,使用甲基化PCR检测两种基因启动子区甲基化的情况;对两种基因甲基化和未甲基化的组织测序;采用SPSS13.0软件分析两种抑癌基因甲基化之间的关系及两种抑癌基因启动子甲基化和主要的临床病理参数的关系。结果:50例PTC中,发现34例TSHR基因、30例RASSF1A基因启动子发生甲基化;32例对照组中,7例TSHR基因、10例RASSF1A基因启动子发生了甲基化;PTC组TSHR基因和RASSF1A基因启动子甲基化率均显著高于对照组,差异有统计学意义。DNA测序证实,两种抑癌基因发生甲基化的其CpG岛的碱基仍为CG,未发生甲基化的碱基由CG变为TG。计算TSHR和RASSF1A基因甲基化间的相关系数r=0.490,提示PTC组两个抑癌基因甲基化之间存在显著相关性。RASSF1A和TSHR基因甲基化与患者的年龄、性别、临床分期均未见相关性;RASSF1A基因甲基化与患者是否伴有淋巴结转移无关,TSHR基因甲基化与患者是否伴有淋巴结转移相关。结论:两种抑癌基因启动子甲基化与PTC的发生有关,且可能在甲状腺肿瘤的早期阶段既已存在;TSHR基因甲基化在甲状腺癌的恶性进展中可能发挥一定作用。     

甲状腺及乳房多原发癌病人甲状腺癌组织WIF-1基因mRNA表达及其启动子甲基化状态分析

目的探讨甲状腺、乳房多原发癌病人甲状腺癌组织WIF-1基因mRNA表达及其启动子的甲基化状态。方法采用RT-PCR及甲基化特异性PCR(MSP)方法检测33例甲状腺、乳房多原发癌病人甲状腺癌组织WIF-1基因mRNA表达及其启动子甲基化状态,以30例单纯甲状腺乳头状癌和20例甲状腺良性病变组织作为对照。结果多原发癌病人甲状腺癌组织、单纯甲状腺乳头状癌组织和甲状腺良性病变组织WIF-1基因的表达缺失率分别为51.5%(17/33)、36.7%(11/30)、15.0%(3/20),3组比较差异有统计学意义(χ2=7.105,P<0.05)。多原发癌病人甲状腺癌组织、单纯甲状腺乳头状癌组织WIF-1基因的甲基化率分别为45%(15/33)、43%(13/30),高于甲状腺良性病变组织的10%(2/20),差异有显著性(χ2=6.349、7.185,P<0.01),但多原发癌病人甲状腺癌组织与单纯甲状腺乳头状癌组织相比差异无显著性(P>0.05)。结论 WIF-1基因mRNA表达缺失在甲状腺、乳房多原发癌的发生过程中起关键作用;WIF-1基因启动子区的高甲基化状态可能是其mRNA低表达的机制之一。     

乳头状甲状腺癌p16基因蛋白表达及启动子甲基化的研究

目的 研究抑癌基因p16在乳头状甲状腺癌中的表达,分析其启动子区甲基化与肿瘤发生的关系.方法 对50例乳头状甲状腺癌组织和32例对照组织(20例结节性甲状腺肿,12例甲状腺腺瘤)提取RNA后,反转录为cDNA,进行PCR,检测p16基因的表达情况,运用巢氏MSP(nMSP)检测上述组织中p16基因启动子区甲基化的情况.结果 p16基因启动子在50例乳头状甲状腺癌中有27例发生甲基化,甲基化率为54%,在32例对照组中有5例发生甲基化,甲基化率为15.6%,两组甲基化率差异有统计学意义(x2=12.08,P<0.01),经DNA测序后证实发生了启动子区甲基化的存在.p16基因在50例乳头状甲状腺癌组织中17例(34%)存在表达缺失,在32例对照组中有6例(18.8%)存在表达缺失,两组差异无统计学意义(x2=2.29, P>0.05),乳头状甲状腺癌mRNA的半定量的值为0.51±0.17,对照组mRNA半定量的值为0.72±0.22,乳头状甲状腺癌mRAN的表达明显低于对照组织,两者差异有统计学意义(t=3.66,P<0.01).结论 p16基因启动子甲基化与乳头状甲状腺癌的发生和发展相关.     

促进甲状腺激素受体和p16抑癌基因甲基化与乳头状甲状腺癌临床病理的关系

目的通过对乳头状甲状腺癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)两种抑癌基因:促甲状腺激素受体(thyroid stimulatinghormone receptor,tshr)和p16启动子甲基化的研究,分析其启动子甲基化与患者临床病理参数之间的关系,寻找PTC的发生机制,并探讨2个抑癌基因在PTC的发生中有无关联性。方法提取50例PTC组织和32例对照组织DNA,进行甲基化修饰,采用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)检测两种抑癌基因启动子区甲基化的情况;用测序方法证实甲基化的存在;采用SPSS13.0软件分析两种抑癌基因甲基化之间的关联性及两种抑癌基因启动子甲基化和主要的临床病理参数的关系。结果50例PTC中,有34例(68%)tshr基因、27例(54%)的p16基因启动子发生了甲基化;32例对照组中,2个抑癌基因的甲基化分别为7例(21.9%)和5例(15.6%),PTC组2个抑癌基因启动子甲基化率均显著高于对照组,差异有统计学意义(χ2值分别为16.61和12.08,P<0.05);2个抑癌基因相关性分析,tshr和p16之间不存在关联性(r=0.23,P>0.05);两种基因启动子在有淋巴结转移的PTC的甲基化率高于无淋巴结转移的病例(χ2值分别为5.82和5.10,P<0.05)。结论两种抑癌基因启动子甲基化与PTC的发生有关,两种基因启动子甲基化在PTC的发生中可能没有相关性,但在恶性进展中可能发挥一定作用。     

甲状腺乳头状癌miR-34b基因表达及其启动子区甲基化的临床意义研究

目的:探讨miR-34b基因表达及其启动子区甲基化(MSP)在甲状腺乳头状癌(PTC)中的临床意义。方法:收集2008年10月-2013年1月本院治疗的42例甲状腺乳头状癌患者癌组织标本(实验组)和42例甲状腺腺瘤患者瘤旁组织标本(对照组),检测两组miR-34bmRNA表达(实时定量PCR法)及miR-34b基因启动子区甲基化(甲基化特异性PCR法),并对结果进行分析。结果:实验组miR-34b mRNA相对平均表达量(0.84±0.04),miR-34b基因启动子甲基化阳性率71.4%,与对照组比较,差异有统计学意义(P0.05);实验组中不同性别、年龄、肿瘤直径、分期和包膜浸润之间,甲基化阳性率比较差异无统计学意义(P0.05);而存在淋巴结转移甲基化率(88.5%)显著高于不存在淋巴结转移(43.8%),差异有统计学意义(P0.05)。结论:miR-34b基因表达及其启动子区甲基化与PTC发生发展具有密切关系,建议临床深入研究。     

甲状腺乳头状癌组织中NIS和RASSF1A基因启动子区CpG岛甲基化状态的研究

目的 探讨甲状腺乳头状癌及癌旁组织中,甲状腺功能基因钠碘转运体基因(NIS)和甲状腺抑癌基因RAS相关区域家族1A基因(RASSF1A)基因启动子甲基化改变的特点及其相关性.方法 采用甲基化特异性PCR方法分别检测NIS和RASSF1A基因启动子的甲基化状况.结果 ①甲状腺乳头状癌组织中NIS基因启动子甲基化显著高于癌旁组织(P＜0.05).②甲状腺乳头状癌组织中RASSF1A基因启动子甲基化显著高于癌旁组织(P＜0.05).③功能基因NIS启动子甲基化发生显著高于抑癌基因RASSF1A基因启动子的甲基化(P＜0.05):功能基因NIS和抑癌基因RASSF1A的启动子的甲基化呈正相关(rs=0.41,P＜0.05).结论 RASSF1A基因和NIS基因启动子异常甲基化是甲状腺乳头状癌发生或发展过程中的分子事件,两者的基因甲基化提示呈一定正相关,可能相互影响共同参与了甲状腺乳头状癌发生、发展过程.     

PTEN异常表达及甲基化与PTC的关系

目的探讨PTEN异常表达及其基因启动子区异常甲基化与甲状腺乳头状癌发生、发展及转移的关系。方法采用免疫组化、western-blot、甲基化特异性PCR(MSP)分析正常甲状腺与甲状腺乳头状癌组织中PTEN蛋白表达差异及PTEN基因启动子区甲基化情况。结果与正常甲状腺组织相比,甲状腺乳头状癌组织中PTEN蛋白表达明显下调(P<0.01),同时笔者发现PTEN基因蛋白的下调与肿瘤的淋巴结转移状况呈负相关(P<0.005),且甲状腺乳头状癌组织中PTEN基因启动子区甲基化程度显著增高。结论 PTEN蛋白低表达是甲状腺乳头状癌的发生、转移的重要原因之一,其低表达与基因启动子区过度甲基化有关。     

实时荧光定量PCR法检测EG-1在甲状腺乳头状癌组织中的表达及其临床意义

目的：通过实时荧光定量PCR法检测内皮衍生基因-1(EG-1)的基因在甲状腺癌组织中的表达,探讨EG-1与甲状腺癌发生、发展的关系。 方法：选取38例甲状腺乳头状癌患者（病例组）和15例良性甲状腺疾病患者的甲状腺组织(对照组）,采用实时荧光定量PCR法检测甲状腺组织中EG-1基因的表达,同时应用免疫组化学法检测EG-1的表达水平。结果：免疫组织化学结果显示, EG-1主要定位于癌细胞的细胞质,甲状腺乳头状癌组织中EG-1 mRNA和蛋白表达水平明显高于良性甲状腺疾病患者 (P<0.05)。EG-1 mRNA表达与组织学分级有关(P<0.05),与性别、年龄无明显关联性(
P>0.05)。结论：EG-1基因在甲状腺乳头状癌组织中表达明显增高,EG-1基因可能在甲状腺癌的发生、发展中起重要作用。     

PTEN mRNA和Smad4 mRNA在甲状腺乳头状癌中的表达及意义

目的:探讨PTEN mRNA、Smad4 mRNA在甲状腺乳头状癌(PTC)中的表达及意义。方法:采用FQ-PCR法检测94例PTC及癌旁组织,29例甲状腺腺瘤组织中PTEN mRNA和Smad4 mRNA的表达情况。结果:PTC高、中、低转移变型组PTEN mRNA和Smad4 mRNA的表达明显低于甲状腺腺瘤组及癌旁组,差异具有统计学意义(P0.05);且PTEN mRNA表达与Smad4 mRNA表达呈正相关(P0.05)。结论:PTEN和Smad4在PTC的发生发展过程中存在协调关系,二者的低表达可作为判断PTC预后不良的指标。     

WWOX和p73基因在急性髓细胞白血病中的表达

目的研究WWOX(WW domain-containing oxidoreductase)和p73基因在急性髓细胞白血病(AML)中异常表达的临床意义及其机制。方法收集AML患者骨髓58例,非白血病患者骨髓31例作为对照组,采用RT-PCR检测WWOX和p73基因mRNA的表达情况、甲基化特异性PCR检测WWOX基因启动子区和p73基因第一外显子区的甲基化情况。结果 58例AML患者中,28例WWOX基因mRNA阳性表达,30例p73基因mRNA阳性表达;23例WWOX基因启动子区存在甲基化,21例p73基因第一外显子区存在甲基化。对照组中WWOX与p73基因mRNA均有表达29例,均未见甲基化现象。WWOX和p73基因在AML中mRNA的表达以及甲基化状态与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 WWOX与p73基因的甲基化可能导致其基因的沉默,使其mRNA表达减少或缺失,在AML的发病机制中起一定作用,WWOX与p73基因甲基化的检测对AML的诊断和疗效有一定意义。     

侵袭性乳腺癌ASPH基因表达与启动子甲基化的临床意义

目的 探讨侵袭性癌（IBC）癌组织中天冬氨酰-β-羟化酶基因(ASPH) mRNA的表达和基因启动子区域甲基化与临床病理参数的关系。方法 收集91例IBC患者癌组织与配对的癌旁正常组织（MNT）,使用逆转录实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测ASPH基因mRNA在组织中的表达,使用甲基化特异性PCR（ＭＳＰ）法检测ASPH基因启动子区CpG 岛甲基化状态,进一步分别分析其表达与乳腺癌临床病理特征的关系。结果 在IBC中ASPH mRNA的表达量高于MNT（P<0.001）,ASPH mRNA的表达与乳腺癌中的标志物E-cadherin阳性表达有关（r=0.195,P=0.041）。ASPH基因在癌组织与MNT中的启动子甲基化阳性率分别为47.3%（43/91）和89.0%（81/91）,差异有统计学意义（P<0.05)。基因启动子甲基化率与E-cadherin和肿瘤大小相关（P<0.05）。结论 ASPH基因的表达及启动子甲基化率可能参与了乳腺癌的发生发展。     

骨髓增生异常综合征患者骨髓p15基因的表达缺失与启动子甲基化

目的检测骨髓增生异常综合征（MDS）患者骨髓p15基因的表达水平及其启动子区甲基化情况,探讨p15基因异常甲基化在MDS发生、发展中的作用。方法应用甲基化特异性PCR（MS PCR）、逆转录PCR（RT PCR）检测32例MDS患者骨髓p15基因mRNA表达水平及启动子区甲基化状态。结果32例MDS患者骨髓有14例检测到p15基因启动子甲基化（阳性率为43.8%）,且多为高危患者。32例MDS患者中22例骨髓p15mRNA表达水平明显降低（P＜0.05）。MDS患者p15基因启动子甲基化与p15mRNA表达缺失具有明显相关性（P＜0.05）。结论MDS患者骨髓p15基因启动子异常甲基化与基因表达失活密切相关,p15基因启动子区异常甲基化可能与MDS的发生、发展有关。     

甲状腺乳头状癌与基质金属蛋白酶抑制因子3（TIMP3）基因启动子甲基化的关系研究

目的 研究基质金属蛋白酶抑制因子3（TIMP3）基因启动子甲基化水平与甲状腺乳头状癌发生的内在联系,建立基于启动子高甲基化抑癌基因的甲状腺乳头状癌早期诊断方法 。方法 收集甲状腺手术切除的组织标本共46例,其中甲状腺乳头状癌（Papillary thyroid carcinoma,PTC）29例,结节性甲状腺肿（nodular goiter）17例。经提取DNA,设计并合成BSP引物,PCR扩增,采用亚硫酸氢盐法克隆测序（bisulfite sequencing）和Sequenom Mass ARRAY甲基化DNA定量分析法检测甲状腺乳头状癌组织TIMP3基因启动子CpG片段的甲基化水平。结果 亚硫酸盐修饰测序结果 显示TIMP3基因在甲状腺乳头状癌组织中的高甲基化克隆百分比为70％,显著高于结节性甲状腺肿的0％（P〈0．05）。TIMP3基因启动子区5个CpG位点在甲状腺乳头状癌组织中的甲基化有呈较高的甲状腺乳头状癌特异性。Sequenom Mass ARRAY提供的单一CpG位点甲基化定量数据显示TIMP3基因在甲状腺乳头状癌组织的甲基化率均值（0．28）高于结节性甲状腺肿的甲基化率均值（0．15）,差异有统计学意义（P〈0．05）。TIMP3基因启动子3个CpG位点在甲状腺乳头状癌组织中的甲基化率均值高于结节性甲状腺肿甲基化率,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 TIMP3基因CpG-16及CpG-17位点可能为甲状腺乳头状癌的启动子甲基化检测的关键位点,有望成为甲状腺癌早期诊断的分子标志物。     

雷公藤甲素对乳腺癌细胞P53、P73基因甲基化的影响以及对细胞增殖的抑制作用

摘要 目的：研究雷公藤甲素（triptolide,TP）对人乳腺癌MCF-7细胞系增殖的影响及其与P53、P73基因表达和甲基化状态的关系。方法：用不同浓度（10、20、40ng/ml）TP处理MCF-7细胞,采用MTT法检测TP对MCF-7细胞增殖的作用;RT-PCR检测MCF-7细胞甲基转移酶1（DNMT1）、DNMT3a、DNMT3b mRNA的表达;甲基特异性PCR检测TP对MCF-7细胞P53/P73基因甲基化的影响; 蛋白质印迹分析检测MCF-7细胞中P53/P73蛋白的表达。结果：TP剂量依赖性地抑制MCF-7细胞的增殖（P<0.05, P<0.01）,其半数抑制浓度（IC50）约为20ng/ml（P<0.01）,高浓度（40ng/ml）时抑制率达（70.13.52）%。TP可明显抑制MCF-7细胞中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA（P<0.05,P<0.01）的表达。TP处理MCF-7细胞后P53启动子区的甲基化降低,TP(20ng/ml)处理后P53 mRNA的表达升高,而在高浓度(40ng/ml) TP作用下表达明显上调(P<0.0501);TP处理MCF-7细胞后P73基因启动子区的甲基化则明显降低,并呈剂量依赖性,且TP(20ng10ng/ml)处理后P73 mRNA的表达亦明显增强(P<0.0105) ,并呈剂量依赖性。蛋白质印迹分析检测TP(20ng/ml)处理MCF-7细胞后,P53、P73蛋白的表达均增强。结论：TP可通过抑制甲基转移酶活性、抑制P53特别是P73基因启动子区甲基化,促进P53/P73的表达,从而抑制MCF-7细胞的增殖。