全基因组序列分析——揭示肿瘤发生发展及个体化治疗的新途径

随着全基因组测序技术的发展和测序成本的下降,以及全基因组测序技术与DNA甲基化和组蛋白乙酰化等表观遗传学分析手段的结合,对大量样本进行全面系统的分析已经成为现实,人类已具备了重新认识肿瘤发生发展的能力。从以往的不同个体之间的全基因组序列的比对,到最近大量自身不同组织的横向比对,自身基因组的纵向比对,新思路层出不穷,个体化诊治肿瘤已显露出光明的前景。     

乳腺癌中线粒体基因组D环区基因突变的研究

目的 通过检测乳腺癌基因组D环区体细胞突变和种系性变异,探讨其与乳腺癌发生的关系.方法 提取24例乳腺癌患者癌、癌旁组织及外周血细胞总DNA,PCR扩增各组织线粒体DNA(mitoohondrial DNA,mtDNA)基因组D环(D-loop),基因测序后与线粒体文库中的剑桥序列比对,分析突变类型.结果 在24例乳腺癌组织中,共发现91个种系性变异,11例(45.8%)肿瘤发现体细胞突变共19例次,36.8%位于第一高变区,52.6%位于第二高变区.结论 乳腺癌mtDNA D环区具有高度多态性和高度突变率,该区的碱基改变在乳腺癌的形成中可能起重要作用.     

潮汕食管癌线粒体DNA体细胞突变研究

目的：研究可能与食管癌发生有关的线粒体DNA（mtDNA）体细胞突变,尤其是与D单倍群患者相关联的体细胞突变。方法：收集24例配对的潮汕食管癌患者癌组织和癌旁正常组织,对mtDNA的D环区和决定D单倍群的多态性位点5178邻近区域直接测序。结果：食管癌癌组织的mtDNA体细胞突变主要为D环区的np303~309单个胞嘧啶核苷酸（C）重复序列处的插入或缺失C。癌旁正常组织np303~309的C数目为9的患者,其配对癌组织发生np303~309体细胞突变率明显高于C数目≤8个的患者。D单倍群癌旁正常组织np303~309的C数目为9的频率高于非D单倍群,D单倍群在该位点的体细胞突变率也高于非D单倍群。结论：食管癌癌组织np303~309的体细胞突变率与癌旁正常组织np303~309的C数目有关。np303~309体细胞突变可能是评价潮汕食管癌高危个体尤其是D单倍群个体发生食管癌潜在可能性的有意义分子标记。     

胃癌组织中SOX4基因的突变分析

目的研究胃癌中SOX4基因的碱基及其编码的氨基酸突变情况，探讨其在胃癌发生中的作用。方法提取胃癌肿瘤及癌旁组织的DNA，PCR扩增胃癌SOX4基因的HMG—box框，并对其进行PCR—SSCP分析，对有差异的样本进行DNA测序。将测序结果用ClustalX软件与正常的HMG—box框序列比对，用DNAStar软件将HMG—box框碱基序列转化成氨基酸序列，再用ClustalX软件与正常的氨基酸序列比对。结果经序列测定发现在27例胃癌样本中有12例出现点突变，而在癌旁组织中没有发现突变，晚期胃癌的突变率明显高于早期胃癌。结论SOX4基因突变可能与胃癌的发展和转移有相关性。本研究为探索SOX4基因突变与人类肿瘤发生之间的关系提供了分子资料。     

肾癌患者线粒体基因组D环区基因突变的研究

目的：通过检测肾癌基因组 D 环区体细胞突变及种系性变异情况,探讨其与肾癌发生的关系。方法选取肾癌患者20例,对其癌组织、癌旁组织及外周血细胞总 DNA进行 PCR扩增并测序,相关结果与线粒体文库中剑桥序列进行比对,综合分析基因突变类型。结果在20例肾癌患者各组织中,共有7例检出线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）的D-环区（displancement loop,D-Loop）存在突变,突变发生率为35%,涉及突变位点17个,其中4个属微卫星不稳定序列;20例患者中共发现9个基因库未记载的新的多态性变化。结论肾癌患者mtDNA的D环区具有高度多态性和高度突变率,该区的基因突变在肾癌的形成中可能发挥重要作用。     

基因组研究和基因组工业的现状及思考

1人类基因组计划和后基因组时代1.1人类基因组测序将提前完成：人类基因组计划（HumanGenomeProject,HGP）旨在阐明人类基因组的全部序列,从整体上破译人类遗传信息,使人类第一次在分子水平上全面地认识自我。主要包括三项任务：人遗传图谱和物理图谱的建立;B．DNA测序;C．基因识别。自1990年实施以来,人类基因组测序已完成测序和正在测序的共计约330Mb,占人基因组的11％左右;已识别出与人类疾病相关的基因200个左右。此外,细菌、支原体等共17种模式生物全基因组序列已测定。随着技术更新和大公司的介入,人类基因组测序将提…     

安徽省人乳头瘤病毒16型全基因组的结构特征

目的克隆安徽省人乳头状瘤病毒16型( HPV16)全基因组,分析HPV16全基因组序列并了解其结构特征。方法收集5例安徽省宫颈癌病理组织标本并提取总DNA,设计4对特异性引物分段克隆HPV16全基因组,测序后进行序列拼接及核苷酸序列分析。结果检测到1个宫颈癌病理样本中含有 HPV16并获得全基因组序列,序列全长7906 nts ( GenBank登录号：KC935953)。序列比对显示,安徽HPV16( HPV16-Anhui )与泰国HPV16和日本HPV16的全基因组核苷酸序列相似性最高,达99.5%。系统关系树分析显示,HPV16-Anhui与其他7个HPV16型聚成1个单独的分支。结论获得安徽省首例HPV16全基因组核苷酸序列,HPV16-Anhui与不同地区 HPV16亲缘关系均较近且基因组变异性较小。     

乳腺肿瘤发生与线粒体DNA体细胞突变的初步探讨

目的 基于线粒体DNA(mtDNA)的全基因组信息研究体细胞突变与乳腺肿瘤发生的相关性.方法 对来自云南省昆明市第一人民医院乳腺科2009年8-12月收治的4例乳腺纤维腺瘤患者的肿瘤组织及外周血mtDNA全基因组序列进行聚合酶链反应(PCR)扩增及DNA测序,比较其突变分布差异,揭示可能存在的肿瘤组织特有的体细胞突变.结果 研究获得了患者肿瘤组织mtDNA全基因组的突变图谱,并构建了系统发育关系树,结果揭示,4例患者的mtDNA分别归属为单倍型类群D4i、G1、R9b及N9a.通过在外周血mtDNA中检测肿瘤样本中发现的私有突变,研究显示仅在单倍型类群归属为R9b的患者中存在16292位置的体细胞变异.结论 基于4例良性乳腺肿瘤患者的肿瘤组织的mtDNA全基因组信息,仅发现1个mtDNA控制区体细胞变异,未能发现存在于mtDNA编码区中的可能具有功能性的体细胞突变.

Abstract：

Objective To investigate the correlation of somatic mutations in whole genome of mitochondrial DNA ( mtDNA ) in patients with breast tumor. Methods The DNA of tumor tissue and peripheral blood in 4 benign breast tumor patients from August 2009 to December 2009 in our hospital were extracted. The mtDNA whole genomes were amplified by polymerase chain reaction (PCR) and the mutations of products screened by sequencing to compare the difference of mutation distribution between tumor tissue and peripheral blood. The likelihood of somatic mutations in tumor tissue was determined. Results The mutation spectrum of mtDNA genomes was obtained by PGR and sequencing. Then a phylogenetic tree was constructed to identify their haplogroups (D4i, G1, R9b, N9a). Their private mutations in peripheral blood were detected and the somatic mutation at 16292 position was found in one patient ( haplogroups: R9b).Conclusion Based on the extensively study on the mtDNA genomes from the tumor issues of 4 patients, our current report observed only a single somatic variation from the control region, no any further mutations with potential function from the coding region were observed.     

DNA甲基化转移酶3B在脑胶质母细胞瘤中的差异表达

目的 脑胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)中存在广泛的基因组低甲基化,本研究检查了DNA甲基化转移酶3B (DNA methyltransferase 3B,DMNT3B)是否在这种肿瘤中的表达和突变情况,以期寻找肿瘤基因组低甲基化发生的原因。方法用RNA抽提试剂盒从 25例人脑胶质母细胞瘤组织中提取总RNA,用反转录聚合酶链反应方法扩增 DNMT3B 的cDNA,然后测序,所得序列经DNASTAR软件与NCBI发表的正常序列进行比对。结果 从25例脑胶质母细胞瘤样本中的成功扩增了全长 DNMT3B cDNA,测序分析结果显示 DNMT3B 基因在该肿瘤样本中差异性存在多种剪接变异体,以 DNMT3B-V1、DNMT3B-V3、DNMT3B-V7 为主。没有发现改变氨基酸序列的点突变。结论 DNMT3B 基因在脑胶质母细胞瘤中没有点突变,但存在多种剪接变异体(以 DNMT3B-V3、DNMT3B-V7 为主),其是否为脑胶质母细胞瘤的广泛基因组低甲基化的原因尚有待进一步研究。     

多重PCR靶向富集结合高通量测序筛查结直肠癌中MMR基因的突变

 目的  探讨多重PCR靶向富集结合高通量测序技术在结直肠癌 (colorectal cancer,CRC)中检测错配修复 (mismatch repair,MMR)基因种系突变的应用。方法  收集17例CRC患者和14例正常人的血液并提取基因组DNA;设计和优化寡聚核苷酸探针,使其能对5个基因MLHl、MSH2、PMS1、PMS2和MSH6的73个外显子序列进行有效的PCR扩增和富集;应用多重PCR技术靶向富集样本MMR基因的外显子序列;扩增产物进行文库构建和高通量测序,检测MLHl、MSH2、PMS1、PMS2和MSH6基因的突变情况。结果  31个样本共得到2.7Gb的数据,平均reads数为287 048,测序数据中平均82.18%可与参考序列进行比对,外显子序列平均覆盖度为99.9%,平均测序深度为2 282。在MMR基因的外显子区域共发现13种非同义单核苷酸变异 (single nucleotide variation,SNV)、2种同义 SNV,其中MSH6的c.G3205C:p.G1069R为未见报道SNV。检测结果经Sanger法测序验证,结果一致。结论  多重PCR靶向富集结合高通量测序技术是一套通量高、速度快、费用低、准确性高的MMR基因突变筛查方法。     

全基因组测序用于宁夏羊种3型布鲁氏菌毒力基因筛选的研究

目的 从3株布鲁氏菌分离株的全基因组序列中筛选出可能导致脑损害的关键毒力基因,为后续筛选布鲁氏菌致脑损害毒力基因的研究奠定基础.方法 通过BCSP31PCR、传统生化实验对3株分离于布鲁氏菌病患者外周血中的布鲁氏菌进行鉴定分型.利用Illumina Hiseq2000平台对3株布鲁氏菌进行全基因组测序与比较基因组学分析,根据文献报道分析筛选出布鲁氏菌的经典毒力基因,通过检索NCBI核酸数据库查找出所选毒力基因的参考序列,利用所选参考序列分别与3株布鲁氏菌全基因组序列做BLAT比对分析.结果 3株布鲁氏菌经BCSP31PCR、传统生化实验鉴定为羊种3型;比较基因组分析显示3株布鲁氏菌与标准株参考序列的同源性比例均达到99.02％.BLAT比对分析发现所选毒力基因wbkA、pgm、hemolysin、hemolysin Ⅲ和Omp25在这3株布鲁氏菌全基因组序列中的比对分数均达到99％以上.结论 本研究所选取的3株羊种3型布鲁氏菌的全基因组中存在经典的毒力基因序列.     

联合运用肝脏三维容积超快速多期动态增强技术及扩散加权成像

目的 探讨联合运用3D-LAVA和DWI技术在胰腺癌的诊断中的价值.方法 回顾性分析经手术病理证实的 24例胰腺癌的MRI图像.扫描序列为:平扫压脂序列(T1WI,T2WI)、LAVA动态增强序列、DWI,分析其MRI表现.包括:对各序列图像质量进行评分;测量胰腺癌与正常胰腺组织的信号强度比SIR;比较胰腺癌 、非癌胰腺组织的 ADC值是否有差异;比较不同序列及LAVA联合DWI序列对胰腺癌的检出率和准确性;利用LAVA动态增强评估胰周血管受侵情况并将MRI评价结果与手术病理对照.结果 LAVA动态增强扫描图像质量最好(P<0.05); LAVA动态增强扫描动脉期和DWI的SIR高于其他序列(P<0.05);胰腺癌与非癌胰腺组织ADC值的±s具有显著性差异;LAVA多期动态增强扫描结合DWI序列对胰腺癌的检出率和准确性与单一序列相比差异具有统计学意义;16例LAVA动态增强判断血管受侵的患者,与手术中所见误诊3条血管,准确率为87.5%.结论 LAVA动态增强序列能够比较完美地实现胰腺的多期动态增强扫描,结合DWI序列对胰腺癌的显示、定性诊断与及术前可切除性的评价具有重要意义.     

抗大肠癌噬菌体人单链抗体的初步鉴定及序列分析

目的 :对抗大肠癌细胞的单克隆噬菌体单链抗体进行初步鉴定和测序分析。方法 :采用细胞ELISA ,免疫组化 ,DNA序列测定和计算机分析方法 ,对 5个单克隆噬菌体抗体 (CH2 73,CH2 0 5 ,CH2 0 9,CHA12 ,CH72 3)进行初步鉴定和序列分析。结果 :5个抗体均对人大肠癌细胞、人胚肾上皮细胞和其它某些人肿瘤细胞反应 ,也与人正常肝细胞有弱阳性反应 ,但不与鼠源性的癌细胞和正常细胞反应。细胞免疫组化进一步证实了ELISA结果的正确性。大肠癌免疫组化对大肠癌组织有特异性的结合反应 ,而不与正常大肠组织反应。测序结果为CH2 73ScFv全长 732bp ;V ,D ,J分别属于VH3 30 D1 2 6 JH3 linker V1 13 JL2 ,GenBank序号为AY0 2 8777和AY0 2 8996 ;CH2 0 5全长 36 6bp ,V ,D ,J分别VH1 4 6 D6 13 JH3,GenBank序号为AF35 936 5 ;CH2 0 9,CHA12和CH72 3的ScFv基因完全相同 ,全长 72 3bp ,其VH DH JH与CH2 73ScFv基因中的VH DH JH 完全一致 ,V ,D ,J分别属于VH3 30 D1 2 6 JH3 linker L2 Jκ2 ,GenBank序号为AF36 3774。结论 :噬菌体抗体具有结合人大肠癌组织和细胞的活性 ,为进一步开发临床应用人源抗肿瘤抗体和小分子抗体片段奠定基础     

人胰腺癌组织中R—ras的表达及其临床意义

目的检测人类胰腺癌组织中R-ras的表达情况并探讨其临床意义。方法用免疫组织化学方法检测65例胰腺癌组织及癌旁组织中R-ras、P21ras和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达,并对检测结果作统计学分析。结果胰腺癌组织中R-ras、P21ras和PCNA的阳性表达率均显著高于癌旁组织中的表达率(均P<0.01);R-ras阳性表达率与胰腺癌组织的病理分化程度无关(P>0.05);R-ras阳性表达率与P21ras和PCNA的阳性表达率均相一致(均P<0.01)。结论R-ras在原发性胰腺癌组织中表达增加,可能参与了胰腺癌的发病过程。     

Surgical strategy for mild ischemic mitral insufficiency

Background Accurate identification of bacterial isolates is an essential task in clinical microbiology. This study compared culturing to analyzing 16S rRNA gene sequences as methods to identify bacteria in clinical samples. We developed a key technique to directly identify bacteria in clinical samples via nucleic acid sequences, thus improving the ability to confirm pathogens.Methods We obtained 225 samples from Beijing Tongran Hospital and examined them by conventional culture and 16S rDNA sequencing to identify pathogens. This study made use of a modified sample pre-treatment technique which came from our laboratory to extract DNA. 16S rDNA was amplified by PCR. The amplified product was sequenced on a CEQ8000 capillary sequencer. Sequences were uploaded to the GenBank BLAST database for comparison.Results Among the positively cultivated bacterial strains, seven strains were identified differently by Vitek32 and by 16S rDNA sequencing. Twelve samples that were negative by standard culturing were determined to have pathogens by sequence analysis.Conclusion The use of 16S rRNA gene sequencing can improve clinical microbiology by providing better identification of unidentified bacteria or providing reference identification of unusual strains.     

分泌型卷曲相关蛋白1、β联蛋白、上皮钙黏着蛋白在结直肠癌中的表达及意义

目的： 探讨Wnt信号通路抑制因子分泌型卷曲相关蛋白1（SFRP1）在结直肠癌组织中的表达,及其与β联蛋白（β-catenin）和上皮钙黏着蛋白（E-cadherin）蛋白表达的关系,并探讨其临床意义。 方法：应用逆转录PCR检测60份结直肠癌及其癌旁正常黏膜中SFRP1、β-catenin和E-cadherin基因mRNA表达水平;同时应用免疫组织化学染色法（Elivision法）检测相同组织中SFRP1、β-catenin和E-cadherin蛋白的表达,并探讨其相关性及与临床病理因素的关系。 结果：60份组织中,52份结直肠癌组织及其癌旁正常黏膜中RNA提取成功;SFRP1 mRNA相对表达量分别为0.4837±0.1532和0.7170±0.1830;β-catenin mRNA相对表达量分别为0.9293±0.3705和0.6469±0.3166;E-cadherin mRNA相对表达量分别为0.5556±0.2535和0.9422±0.2372,两组比较差异均有统计学意义（均P<0.01）;SFRP1 mRNA表达与肿瘤淋巴结转移有关（P<0.05）。SFRP1蛋白在结直肠癌中的阳性表达率为31.67%（19/60）,显著低于癌旁正常结直肠黏膜组织75.00%（45/60）的阳性表达率;SFRP1 蛋白表达与临床病理各因素无关。β-catenin、E-cadherin在结直肠癌中的异常表达率分别为75.00%（45/60）、58.33%（35/60）,显著高于癌旁正常结直肠黏膜组织1.67%（1/60）、6.67%（4/60）的异常表达率;β-catenin和E-cadherin异常表达与肿瘤的分化程度、淋巴结转移和Dukes分类有关。结直肠癌中SFRP1蛋白的表达与β-catenin和E-cadherin的异常表达呈负相关（r=－0.517,r=－0.442, 均P＜0.01）。 结论：结直肠癌中SFRP1的表达下调导致Wnt信号通路出现异常活化,并引起β-catenin和E-cadherin异常表达增加。提示SFRP1失活及水平下调是结直肠癌启动及促进的重要因素。     

中国大陆柯萨奇病毒A组16型全基因参照序列的初步建立和分析

目的建立中国大陆柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)流行株的全基因参照序列。方法从GenBank中获得CoxA16中国大陆分离株的所有全基因序列和氨基酸序列,用DNAstar/MegAlign软件对所得序列进行多序列比对和进化分析,按照参照序列标准拟定CoxA16的全基因参照序列和氨基酸序列,并与参考序列进行比对分析。结果中国大陆分离的CoxA16毒株全基因序列共8株,分离于2005-2009年,其中2008年5株,广东省5株;通过序列比对获得了大陆CoxA16全基因和氨基酸参照序列;参考毒株间核苷酸序列同源性介于79.0%～98.8%,氨基酸序列同源性为94.3%～99.9%,与参照序列的核苷酸同源性为79.7%～97.0%,氨基酸同源性介于95.1%～99.5%之间,同源性最低的为2008年安徽阜阳的FY18株。结论比对分析了中国大陆CoxA16毒株全序列,成功建立了中国大陆CoxA16全基因和氨基酸参照序列。     

用原位 PCR 研究石蜡包埋肝组织中微量 HCV RNA

为定位分析石蜡包埋肝组织中微量ＨＣＶＲＮＡ，改良建立了原位ＰＣＲ检测技术，并对１７例丙型肝炎相关的肝细胞癌患者癌组织和癌周肝组织石蜡包埋切片进行检测。结果显示：该技术的特异性可靠，敏感性高于原位杂交法；两种组织切片ＨＣＶＲＮＡ阳性率分别为４１．２％和７０．６％，阳性信号主要呈胞浆型分布；在癌细胞中核型和核膜型分布比例较癌周肝组织明显增高，提示ＨＣＶ可能与宿主细胞基因存在着相互作用。