大鼠自体静脉移植后增生内膜中α1（Ⅰ）和α1（Ⅲ）前胶原mRNA表在的定位研究

目的 明确静脉移植后内膜增生（IH）过程中分泌细胞外基质（ECM）的间质效应细胞。方法 建立静脉移植后内膜增生动物模型,采用Desmin免疫组织化学及特殊染色明确平滑肌细胞（SMC）的位置,用原位杂交检测细胞外基质的重要成分－Ⅰ、Ⅲ 型胶原α1（Ⅰ）、α1(Ⅲ)前胶原mRNA在静脉移植术后1、2、4、6、8周的定位表达。结果 术后早期,移植静脉增生内膜的SMC中有α1（Ⅰ）、α1(Ⅲ）前胶原mRNA的表达。术后远期α1（Ⅰ）、α1(Ⅲ前胶原mRNA也在增生内膜的SMC中表达。结论 移植静脉内膜增生中的胶原是由SMC合成及分泌的,SMC是ECM堆积的间质效应细胞。     

人 Orail基因真核表达载体的构建及在足细胞中的表达

目的构建重组人 Orail基因真核表达载体,观察其在小鼠肾小球足细胞株（MPC5）中的表达。方法根据GenBank数据库检索到的人 Orail基因序列,人工合成法合成Orail基因编码区（coding sequence,CDS）全长序列,克隆至质粒表达载体PG-CMV-IRES-EGFP,构建重组质粒载体PC-CMV-Orail,通过PCR、双酶切及基因测序等方法进行鉴定;以脂质体转染法将重组质粒转染至MPC5细胞,应用荧光显微镜观察绿色荧光检测转染效率,RT-PCR、Western blot法分别检测Orail基因的转录与翻译。结果PCR扩增的片段长度为906bp,双酶切出现两条带,其中约906bp处可见目的条带。核酸测序结果与GenBank中所报道的人 Orail基因的CDS序列完全一致。转染后48h置荧光显微镜下观察,85％以上的足细胞中可见绿色荧光。RT-PCR及Western blot实验结果分别显示转染后的MPC5细胞在mRNA与蛋白水平表达Orail均有所增强。结论成功构建了重组人 Orail基因真核表达载体PG-CMV-Orail,并建立了过表达Orail基因的肾小球足细胞模型,为深入研究钙库操纵的Ca2’通道与足细胞病之间的关系奠定了良好的实验基础。     

Survivin在胆管癌中的表达

目的　探讨Survivin基因表达与胆管癌发生发展的关系。方法　应用免疫组织化学技术 (SP法 )检测Survivin基因在 3 3例胆管癌标本、2 8例癌旁胆管组织和 5例胆管良性病变标本中的表达。结果　 3 3例胆管癌组织中Survivin阳性表达率为 72 .7% ( 2 4/3 3 ) ;在癌旁胆管组织和胆管良性病变组织中未检测到Survivin的表达 ,胆管癌组织、癌旁胆管组织、胆管良性病变组织之间的Survivin基因的表达差异有非常显著性 (P <0 .0 1)。Survivin基因的表达与患者的性别、年龄、肿瘤的大小、分化及是否转移无关。结论　Survivin在胆管癌中高度表达可能与胆管癌的发生发展有关 ,与预后的关系有待进一步的探讨。     

小鼠成纤维活化蛋白真核表达载体的构建及表达

目的 构建小鼠成纤维活化蛋白(FAP)基因的真核表达载体,并检测其在人胚肾细胞及小鼠体内的表达.方法 根据Gene Bank中mFAP基因(NM_007986)全序列设计聚合酶链反应(PCR)引物,获得其开放式阅读框(ORF).将目的基因片段克隆至真核表达载体pcDNA6/myc-His-B,转化并筛选.将重组质粒注射入小鼠尾静脉,在注射后1、3、5、7 d抽提小鼠腓肠肌组织的总RNA,检测FAP表达.结果 经过酶切鉴定、测序比对,确定所筛选的阳性克隆为pcDNA6-mFAP重组子,其可在真核细胞及小鼠体内正常表达,并产生相应蛋白质产物.在小鼠体内注射后第5天,重组子的基因(0.841±0.040)和蛋白表达量(85.380±4.425)%最高,和空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论 成功构建FAP真核表达载体,为研究该基因产物的功能和进行疫苗抗肿瘤实验提供基础.     

肾脏基因表达数据库的建立与肾脏衰老相关基因表达谱研究

目的：运用基因芯片技术及公共数据库,首次建立大鼠肾脏基因表达谱数据库,比较成年及老年大鼠肾脏基因表达变化,筛选肾衰老相关基因,方法：将代表8192条基因的PCR产物中CartesianPixsys7500点样仪按微矩阵排列点样于Dako玻璃片,将等量的成年大鼠肾脏组织和衰老大鼠肾组织mRNA分别用cy-3,cy-5逆转录荧光标记,制作cDNA探针,混合后与上述表达谱芯片进行杂文,Scan Array3000扫描仪扫描杂交信号荧光强度,ImaGENE3.0软件分析扫描结果,与公共数据库比较,建立大鼠肾脏表达谱数据库,结果：在进入研究的8192条基因中,1245条基因（1．5％）在衰霉素 大鼠肾脏组织中有表达差异（1．7倍以上）,在老年大鼠肾组织中表达增加的基因有71条,其中16条（22．5％为应激反应相关或炎症相关基因,17条（23．9％）为细胞外基质代谢／细胞骨架／肿瘤相关基因,在衰老大鼠肾组织表达下降的基因有53条,其中9条（16．9％）为能量代谢相关基因,12条（22．6％）为蛋白质合成／代谢相关基因,6条（11．3％）为细胞周期／有丝分裂相关基因,4条（7．5％）为DNA／RNA损伤修复基因,3条（5．6％）为离子转运相关基因,结论：肾脏衰老的基因表达特征表现为应激与炎症反应讥进,细胞外基质代谢失调及肿瘤相关基因表达活跃,另一方面,有丝分裂调节下降,DNA／RNA修复能力,蛋白合成及肾脏离子转运能力下降,上述转录水平的变化与衰老肾脏的病理生理特征相符合。     

Tip30真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的：探讨人Tip30全长基因的真核表达载体pAAV-TIP30的构建,并观察其转染肝癌细胞株HepG2后的表达。方法：以正常人肝组织mRNA为模板,用RT-PCR方法扩增Tip30,利用限制性内切酶BamH I和Xba I,将Tip30基因克隆到真核表达载体pAAV-MCS中,并经酶切和测序鉴定。重组质粒转染HepG2细胞,运用Western blot法检测Tip30蛋白表达。结果：RT-PCR方法正确地扩增出全长Tip30基因。限制性内切酶酶切和测序结果证实Tip30基因克隆完全正确。重组质粒转染肝癌细胞系HepG2后,Western blot证实Tip30蛋白表达增高。结论：成功构建了真核表达重组质粒pAAV-TIP30并转染HepG2细胞,为进一步研究Tip30基因对肝癌的影响及其机制打下了基础。     

WWOX基因真核表达载体的构建及其在SMMC-7721中的表达

目的克隆人WWOX基因及构建WWOX基因真核表达载体并研究其表达。方法取人新鲜正常肝组织，提取总RNA，采用逆转录-聚合酶联链反应（RT—PCR）扩增WWOX基因，将该基因定向克隆到真核表达载体pEGFP—N1中，构建真核细胞表达载体pEGFP—N1-WWOX，用限制性内切酶酶切分析，DNA序列分析鉴定重组质粒；将测序正确的WWOX基因通过脂质体介导下转染肝癌细胞SMMC-7721。结果重组质粒pEGFP—N1-WWOX经HindⅢ和BamHI双酶切后，获得4700bp片断和1234bp插入片断，序列分析表明插入的片段与Gene Bank发布的序列一致；荧光显微镜下可见转染的SMMC-7721细胞有绿色荧光蛋白的表达。结论成功构建了真核表达载体pEGFP—N1-WWOX，WWOX基因在SMMC-7721细胞内成功表达。     

小鼠白细胞介素5真核表达质粒pVAX-1mIL-5的构建及其体外表达

目的构建能表达小鼠白细胞介素5(mIL-5)的质粒并鉴定其蛋白的体外瞬时表达。方法以含有mIL-5cDNA序列的质粒为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增获得小鼠IL-5基因片段后,定向插入真核表达载体pVAX1中,获得重组表达质粒pVAX1mIL-5。通过双酶切、PCR及插入片段序列测定对质粒进行鉴定。采用间接免疫荧光技术检测pVAX1mIL-5在HeLa细胞的瞬时表达。结果酶切、PCR及测序鉴定证实,插入片段正确,间接免疫荧光检测表明其可以在HeLa细胞中瞬时表达。结论构建的真核表达质粒pVAX1mIL-5可以在HeLa细胞中瞬时表达小鼠IL-5的蛋白,为下一步利用IL-5作为DNA疫苗黏膜免疫佐剂研究奠定了基础。     

Differential gene expression in non-adherent heart transplant survivors: Implications for regulatory T-cell expression

Survival despite prolonged non-adherence with immunosuppression is rare but has been reported in kidney, lung, and liver transplantation. Its occurrence in heart transplantation is quite rare. Our study was prompted by an index patient who survived despite prolonged medication non-adherence. Prospective consent and blood collection were conducted for seven additional patients who presented in a similar fashion. The blood of patients who were diagnosed with rejection, stable early post-transplant, and stable more than 5 years post-transplant were all compared with a custom gene array focusing on T-regulatory cell processes. The two genes that were differentially expressed in every comparison were TGF beta and RNASEN with very low expression in the rejector group. The prolonged non-adherent group had the maximum expression for TGF beta but average RNASEN expression as compared to the low expression for rejectors and high for post-5 years patients. The patients presented survived for varying lengths of time without immunosuppression. The gene array analysis showed intriguing differences between these rare patients and important patient cohorts. Further efforts should be directed to finding and studying more patients who survive despite lack of prescribed immunosuppression. The mechanisms underlying this phenomenon may inform future advances in transplant immunosuppression.     

癌胚抗原启动子正调控白细胞介素-15表达质粒载体的构建及其在肿瘤细胞中的靶向表达

目的 构建癌胚抗原(CEA)启动子正调控人白细胞介素-15(IL-15)真核表达质粒载体,观察其在肿瘤细胞内的靶向性表达.方法 基因克隆技术构建巨细胞病毒(CMV)启动子正调控质粒pHi2-IL-15-CMV-TAT和CEA启动子正调控质粒pHi2-IL-15-CEA-TAT;再以IL-2信号肽(SP)置换IL-15SP构建质粒pHi2-IL-2SP-IL-15-CMV-TAT和pHi2-IL-2SP-IL-15-CEA-TAT;阳离子脂质体介导法体外转染CEA阳性结肠癌SW480细胞和CEA阴性乳腺癌MCF-7细胞,酶联免疫吸附方法(ELISA)检测转染后48h细胞培养上清液中IL-15表达.结果 质粒均成功构建.ELISA检测结果:(1)以IL-2SP置换IL-15SP可提高转染细胞的IL-15表达4.8～5.9倍(P＜0.01);(2)转染SW480细胞后,CEA启动子正调控的两质粒(pHi2-IL-15-CEA-TAT和pHi2-IL-2SP-IL-15-CEA-TAT)与相对应的CMV启动子正调控质粒(pHi2-IL-15-CMV-TAT和pHi2-IL-2SP-IL-15-CMV-TAT)之间的IL-15表达无统计学意义(P＞0.05),其效应等同于CMV启动子正调控质粒;(3)转染MCF-7细胞后,CEA启动子正调控的两质粒IL-15表达显著低于CMV启动子正调控质粒(P＜0.01).结论 CEA启动子正调控IL-15质粒,尤其是质粒pHi2-IL-2SP-IL-15-CEA-TAT在CEA阳性细胞中高表达IL-15,CEA阴性细胞中低表达IL-15,实现了IL-15基因高效、靶向性表达.     

人源化绿色荧光蛋白基因真核表达载体的构建与表达检测

目的: 构建人源化绿色荧光蛋白(humanized greenfluorescent protein,hGFP)基因的真核表达栽体pcDNA3GFP,并观察其在MDCK细胞中的表达情况. 方法: 以Not I切取GFP后插入真核表达载体pcDNA3,以BamH I为鉴定方向,以Lipofect AMINE PLUSTM将pcDNA3GFP转染至培养的MDCK,经G418筛选GFP阳性克隆,于荧光显微镜下观察. 结果: 成功构建了含hGFP cDNA的真核表达载体 pcDNA3GFP,并成功转染MDCK细胞,在荧光显微镜下阳性克隆呈绿色. 结论: GFP基因可在MDCK细胞中成功表达,并发出绿色荧光,是一良好的报告基因和筛选标记.