小鼠囊胚在胚胎成纤维细胞饲养层上向胚胎干细胞的生长发育

背景：到目前为止已建立了数百个小鼠胚胎干细胞系,一般情况下实验室培养的胚胎干细胞有3个细胞来源,即胚泡内的内细胞群、胚胎生殖嵴的原始生殖细胞和应用克隆技术制造人体胚胎并提取干细胞。 目的：尝试用自制的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层分离培养小鼠胚胎干细胞。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2005-12/2007-09在辽宁医学院完成。 材料：妊娠14.5 d的孕鼠40只,由辽宁医学院实验动物中心提供。 方法：无菌条件下剪开孕鼠子宫壁,取出胚胎,去除头、尾、内脏和四肢后采用胰蛋白酶消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞,经丝裂霉素C处理3.5 h后接种于6孔板中,细胞贴壁后即为成纤维细胞饲养层。收集3.5 d的小鼠囊胚,在显微镜下将囊胚置于上述6孔板的中央,五六天后取隆起生长的内细胞团块,分离后再培养。 主要观察指标：成纤维细胞饲养层的制备情况,胚胎干细胞的生长状态、碱性磷酸酶染色结果及分化趋势。 结果：光镜下小鼠胚胎成纤维细胞呈不规则形,生长较快,传代比例为1∶4,经丝裂霉素C处理后细胞贴壁较慢,失去分裂增殖能力。小鼠囊胚孵出透明带的时间为24~72 h,从胞膜中孵出约为1 d,3~5 d后可形成胚胎干细胞集落,7 d后集落呈“鸟巢”状。组织化学染色后可见细胞内有大量的蓝紫色颗粒沉积,连续培养20 d,期间不换培养液,可见胚胎干细胞团分化为亮度较小、界限清楚的单核细胞。 结论：小鼠囊胚在胚胎成纤维细胞饲养层上可发育成胚胎干细胞,并能进行传代。     

昆明小鼠胚胎干细胞最佳分离方法及培养液选择

背景：到目前为止已经建立数百个小鼠胚胎干细胞系,昆明小鼠是中国应用最多的实验小鼠,其建系成功报道极少。 目的：建立一简单有效的昆明小鼠胚胎干细胞分离培养体系,以提高昆明鼠胚胎干细胞建系成功率。 方法：用添加血清替代物或胎牛血清培养液的小鼠胚胎成纤维细胞制备饲养层。昆明小鼠经孕马血清促性腺激素和人绒毛膜促性腺激素促排卵,交配后3.5 d冲洗子宫取胚胎,将胚胎接种在饲养层中培养,观察胚胎贴壁、内细胞团集落形成率。4~ 6 d后在0.05%trypsin-0.02%EDTA消化液中用切割法处理增殖的内细胞团块,再接种到新的饲养层上。倒置显微镜下观察形成的胚胎干细胞样集落形态。 结果与结论：妊娠3.5 d孕鼠适合胚胎干细胞的分离培养;在0.05%trypsin-0.02%EDTA消化液中采用切割法进行内细胞团集落的分离,集落增殖快、分化低;在含胎牛血清培养液中进行干细胞培养较血清替代物培养液中传代次数多,此培养液更适宜进行分离培养昆明鼠胚胎干细胞。     

人胚胎干细胞饲养层的制备及生物学活性

背景：建立一种既可以大量制备,又能保存并保持较高活性的饲养层是胚胎干细胞培养研究不可缺少的环节。 目的：体外分离培养、冻存复苏ICR小鼠胚胎成纤维细胞,观察其生物学特性。 方法：取ICR小鼠13.5 d胚胎,用胰蛋白酶分步消化法分离培养小鼠成纤维细胞,对冻存复苏后的小鼠胚胎成纤维细胞形态、生长曲线、贴壁率、细胞化学染色及支持人胚胎干细胞生长特性等进行观察。 结果与结论：复苏后的小鼠胚胎成纤维细胞在体外传代30 min时80%以上细胞贴壁,生长曲线显示细胞增殖活跃,细胞化学染色AKP、PAS、POX阴性,能长期支持人胚胎干细胞传代生长。提示此方法所获得的小鼠胚胎成纤维细胞复苏后有较高的生物学活性,可为人胚胎干细胞扩增提供稳定、优质的饲养层细胞。     

高效制备昆明鼠胚胎成纤维细胞饲养层

背景：小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层是胚胎干细胞培养最常用的方法,能有效抑制胚胎干细胞分化并促进其增殖,但其制备过程繁琐,工作量大,准备周期长。 目的：探索建立小鼠胚胎成纤维细胞饲养层简单、高效的培养体系。 方法：取13.5 d胎龄胎鼠用改良组织块法及简化酶消化法分离培养原代成纤维细胞,倒置显微镜下观察不同方法培养的原代和传代鼠胚胎成纤维细胞的生长形态、结构及细胞数量变化。收集鼠胚胎成纤维细胞进行冻存,复苏后细胞经不同浓度作用时间的丝裂霉素C处理,制备饲养层。 结果与结论：两种简化方法培养的原代鼠胚胎成纤维细胞生长状态良好,得到高效优质足量细胞,操作过程简单,省去了多次消化、离心、细胞计数等繁琐操作,均适宜于鼠胚胎成纤维细胞的原代培养。简化复苏法复苏后的细胞,按其生长汇合情况,以丝裂霉素C 10 mg/L作用1.5~2.0 h或1 mg/L培养过夜,省时并可获得细胞生长状态最佳的饲养层。     

小鼠胚胎及人包皮成纤维细胞按比例制成混合饲养层上的人胚胎干细胞生长状态★

目的：人胚胎干细胞传代培养的关键是抑制其自发分化、保证细胞的全能性。欲解决以小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞为常规饲养层培养人胚胎干细胞时存在的问题，观察两者按一定比例制成的混合饲养层上人胚胎干细胞的生长状态。 方法：实验于2006-04/2007-07在海南医学院附属医院生殖医学中心完成。①对象：包皮来自于行包皮环切的儿童，由海南医学院附属医院泌尿外科提供，儿童家属对治疗及实验均签署知情同意书，实验经医院医学伦理委员会批准。人胚胎干细胞系HN-1由本实验室从人类囊胚中分离培养并鉴定。清洁级孕12.5~14.5 d的胎鼠11只，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：将去除头、四肢和内脏的胎鼠按常规胰蛋白酶反复消化法获得细胞悬液进行接种培养，待生长汇合后冻存部分原代细胞，用丝裂霉素C处理2.0~3.0 h后，按1×108 L-1密度接种于明胶包被的中心皿内，即小鼠胚胎成纤维细胞饲养层。人包皮成纤维细胞的分离培养与饲养层制备同上。上述两种成纤维细胞分别计数后，按1∶0，3∶1，1∶1， 1∶3，0∶1比例混合，然后以1×108 L-1密度接种于明胶包被的中心皿内，即混合饲养层。③实验评估：观察体外传代培养的人胚胎干细胞在3种不同饲养层上的生长状态。并对生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞进行碱性磷酸酶检测、OCT-4表达免疫组化检测、OCT-4及端粒酶mRNA表达RT-PCR检测。撤除饲养层，观察人胚胎干细胞体外分化情况。 结果：①不同饲养层上人胚胎干细胞的生长状态比较：生长在小鼠胚胎成纤维细胞和人包皮成纤维细胞上的人胚胎干细胞克隆扁平、不饱满，而生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞克隆饱满、厚实，其克隆形态显著好于其他两种饲养层。②人胚胎干细胞在不同比例混合饲养层上的生长状态比较：小鼠胚胎成纤维细胞：人包皮成纤维细胞按1∶1混合时，人胚胎干细胞显著堆积生长，克隆边缘清晰、隆起明显且饱满，按1∶3混合时无明显变化，优于其余3种混合比例。③混合饲养层上人胚胎干细胞未分化状态的检测：碱性磷酸酶染色及OCT-4抗原表达均呈强阳性，分别在200~300 bp和300~400 bp处可见OCT-4和端粒酶 mRNA表达的特异性条带。④体外分化实验：能形成拟胚体，贴壁后人胚胎干细胞可分化为多种形态的细胞。 结论：①与小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞常规饲养层相比，二者混合饲养层能够更好的支持人胚胎干细胞的体外传代培养，获得更佳的克隆形态。②小鼠胚胎成纤维细胞与人包皮成纤维细胞的混合比例为1∶1时效果较好。     

小鼠胰腺干细胞饲养层条件下的连续传代培养

背景：胰腺干细胞具有分裂与高度分化潜能的特性,可以在体外进行成功分离和培养,但体外如何对其进行有效扩增是亟待解决的问题。 目的：在胎鼠成纤维细胞饲养层条件下体外传代培养小鼠胰腺干细胞。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-07/2008-01在广西中医学院基础医学院细胞无菌培养室完成。 材料：SPF级新生昆明小鼠20只,孕14 d昆明小鼠多只,均购自广西中医学院实验动物中心。 方法：取SPF级新生昆明小鼠的胰腺组织,Ⅴ型胶原酶消化,未消化完全的组织块自然沉降后,收集上层的含细胞离散液,离心弃上清,加入含角质细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的无血清低糖DMEM培养基,在经多聚赖氨酸溶液处理的24孔板中培养。取孕14 d昆明小鼠,剖腹取胎鼠,去除头部及内脏,将躯干及四肢采用组织块胰蛋白酶消化法分离培养成纤维细胞,调整密度为5×108 L-1接种于24孔板中,传至第3代经丝裂霉素适当处理制备饲养层细胞。取原代培养5 d的胰腺干细胞,按30个/cm2密度种入铺有饲养层细胞的孔板中,当胰腺干细胞铺满小孔底部面积的80%时继续传代。 主要观察指标：倒置显微镜下观察细胞形态变化,原代培养48 h对细胞进行碱性磷酸酶染色,通过免疫组织化学染色鉴定胰腺干细胞特异分子标志物巢蛋白的表达。分别于传代后2,3,4,5 d检测碱性磷酸酶、巢蛋白和胰十二指肠同源盒基因1的表达。 结果：原代培养的来源于胰腺组织的细胞中,可见一些大、圆、单个核的细胞,胞浆折光性强,核浆比例大,呈附壁生长,碱性磷酸酶染色呈阳性,表达胰腺干细胞特异性分子标志巢蛋白,且具有活跃的分裂增殖能力。在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层条件下对胰腺干细胞进行体外传代培养,可连续传至第3代,各代胰腺干细胞仍保持大、圆、单个核、核浆比例大及增殖能力强等特性,传代后各时间点碱性磷酸酶、巢蛋白染色均呈阳性,胰十二指肠同源盒基因1蛋白染色呈阴性反应,可保持未分化状态。 结论：以小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,经丝裂霉素C处理后可分泌供胰腺干细胞生长所需的因子,并抑制胰腺干细胞的自主分化,体外连续传至第3代仍能够保持较好的生长特性、高度增殖能力及未分化状态。     

三种不同饲养层上人胚胎干细胞生长状态的比较★

背景：人胚胎干细胞传代培养的关键是抑制其自发分化、保证细胞的全能性。以小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞作为饲养层尽管能够维持胚胎干细胞的未分化状态，但存在细胞克隆不饱满、平铺情况明显等问题。 目的：制备小鼠胚胎成纤维细胞与人包皮成纤维细胞的混合饲养层，观察人胚胎干细胞在其上面的生长状态。 设计：多样本观察比较。 单位：海南医学院附属医院生殖医学中心。 材料：实验于2006-04/2007-07在海南医学院附属医院生殖医学中心完成。包皮来自于行包皮环切的儿童，由海南医学院附属医院泌尿外科提供，儿童家属对治疗及实验均签署知情同意书，实验经医院医学伦理委员会批准。人胚胎干细胞系HN-1由本实验室从人类囊胚中分离培养并鉴定。清洁级孕12.5~14.5 d的胎鼠11只，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。 方法：胎鼠麻醉后去除头、四肢和内脏，按常规胰蛋白酶反复消化法获得细胞悬液进行接种培养，待生长汇合后冻存部分原代细胞，用丝裂霉素C处理2.0~3.0 h后，按1×108 L-1密度接种于明胶包被的中心皿内，即小鼠胚胎成纤维细胞饲养层。人包皮成纤维细胞的分离培养与饲养层制备同上。上述两种成纤维细胞分别计数后，按1∶0，3∶1，1∶1，1∶3，0∶1比例混合，然后以1×108 L-1密度接种于明胶包被的中心皿内，即混合饲养层。观察体外传代培养的人胚胎干细胞在3种不同饲养层上的生长状态，并对生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞进行碱性磷酸酶检测、OCT-4表达免疫组化检测、OCT-4及端粒酶mRNA表达RT-PCR检测。撤除饲养层，观察人胚胎干细胞体外分化情况。 主要观察指标：①不同饲养层上人胚胎干细胞的生长状态比较。②人胚胎干细胞在不同比例混合饲养层上的生长状态比较。③混合饲养层上人胚胎干细胞未分化状态的检测。④体外分化实验。 结果：①：生长在小鼠胚胎成纤维细胞和人包皮成纤维细胞上的人胚胎干细胞克隆扁平、不饱满，而生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞克隆饱满、厚实，其克隆形态显著好于其他两种饲养层。②：小鼠胚胎成纤维细胞：人包皮成纤维细胞按1∶1混合时，人胚胎干细胞显著堆积生长，克隆边缘清晰、隆起明显且饱满，按1:3混合时无明显变化，优于其余3种混合比例。③：碱性磷酸酶染色及OCT-4抗原表达均呈强阳性，分别在200~300 bp和300~400 bp处可见OCT-4和端粒酶mRNA表达的特异性条带。④：能形成拟胚体，贴壁后人胚胎干细胞可分化为多种形态的细胞。 结论：①与小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞常规饲养层相比，两者混合饲养层能够更好的支持人胚胎干细胞的体外传代培养，获得更佳的克隆形态。②小鼠胚胎成纤维细胞与人包皮成纤维细胞的混合比例为1∶1时效果较好。     

鸡胚胎干细胞分离方法和培养体系的优化

背景：胚胎干细胞是从动物早期胚胎的内细胞团或原始生殖细胞分离出来的具有发育全能性的一种未分化的无限增殖细胞系。而鸡胚胎干细胞则是从X期鸡胚的胚盘分离而来。 目的：优化鸡胚胎干细胞分离方法和离体培养体系。 方法：采用滤纸纸环-发环的方法从X期鸡胚分离胚盘细胞,并采用STO细胞作为饲养层和大鼠肝细胞(BRL)条件培养基(CM)+细胞因子作为离体培养体系对分离的胚盘细胞进行培养。 结果与结论：滤纸纸环-发环法获得的完整胚盘率为75%~85%,克隆形成率约为50%。BRL-CM+饲养层培养体系,鸡胚胎干细胞可传至7代,而BRL-CM+饲养层+细胞因子培养体系,鸡胚胎干细胞可传至25代。分离到的鸡胚胎干细胞,经碱性磷酸酶染色、SSEA-1染色鉴定,表明鸡胚胎干细胞处于未分化状态。提示,实验不仅优化了鸡胚胎的分离方法,获得完整且杂质少的胚盘,而且进一步优化了鸡胚胎干细胞体外培养体系。     

利用冷冻胚胎建立人类胚胎干细胞系

背景：目前人胚胎干细胞建系的技术路线主要有囊胚法、核移植法和胚胎单卵裂球法,但由于破坏胚胎,涉及诸多伦理问题。 目的：探讨利用冷冻胚胎建立人类胚胎干细胞系的可行性。 设计、时间及地点：细胞学体内外实验,于2005-01/2006-08在沈阳市妇婴医院生殖中心完成。 材料：妊娠13.5 d的ICR鼠20只用于制备小鼠胚胎成纤维细胞饲养层,10周龄SICD鼠2只用于人胚胎干细胞体内分化实验。行IVF/ICSI助孕患者自愿捐献的冷冻胚胎,由沈阳市妇婴医院生殖中心提供。 方法：复苏冷冻的胚胎,采用序贯培养法进行囊胚培养,用免疫外科方法去除滋养细胞,将得到的胚胎内细胞团接种于丝裂霉素C灭活的小鼠胚胎成纤维细胞上培养并传代。 主要观察指标：取不同代次的培养细胞,分别进行生长特性、碱性磷酸酶染色、转录因子OCT-4、阶段特异性胚胎抗原SSEA-4、SSEA-1、肿瘤排斥抗原TRA-1-60、TAR-1-81、核型及体内分化全能性鉴定。 结果：20个解冻卵裂期胚胎,获得9个囊胚,分离完整的内细胞团共7个,从7个内细胞团培养出2个人胚胎干细胞系,其中一个细胞系连续培养76代(20个月)。所培养的细胞具有人胚胎干细胞的共同生物学特性,即细胞呈扁平或圆形,可见1~3个核仁;碱性磷酸酶以及SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-81,TRA-1-60,OCT-4均呈阳性表达,而SSEA-1呈阴性;核型正常,为46,XX核型;将细胞注射入SCID鼠皮下形成肿瘤,病理切片显示为成熟畸胎瘤;短串联重复分型结果显示所形成的畸胎瘤与人胚胎干细胞为相同的遗传背景。 结论：实施体外受精-胚胎移植的夫妇怀孕后,多余的冷冻保存胚胎所分离培养的细胞具备人胚胎干细胞的所有特性,是建立人胚胎干细胞系很好的材料来源。     

人胚胎干细胞在人源和鼠源饲养层上的生长特性比较**☆◆

背景：不同来源饲养层条件下,人胚胎干细胞是否具有相同或相似的生物学特性尚不清楚,该问题的解决有利于建立标准化的饲养层体系。 目的：观察比较人胚胎干细胞在人源和鼠源饲养层上的生长特性是否相同？ 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-09/2009-02在中国科学院昆明动物所完成。 材料：清洁级孕12.5~13.5 d的ICR小鼠2只,由昆明医学院动物中心提供。永生化人成纤维细胞由美国约翰霍普金斯大学医学院建系并赠送,人胚胎干细胞株BG02由中国科学院昆明动物所提供。 方法：无菌条件下取ICR胎鼠,组织块胰酶消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞,永生化人成纤维细胞按常规培养,两种细胞经γ射线处理后,以2.5×104/cm3接种在明胶包被的6孔板中。取人胚胎干细胞,分别接种在小鼠胚胎成纤维细胞或永生化人成纤维细胞饲养层上,加入含β-巯基乙醇的DMEM/F12培养基,使用前添加碱性成纤维细胞生长因子。 主要观察指标：两种饲养层上的人胚胎干细胞的形态、特异性标记表达、Oct-4阳性率、细胞倍增时间。 结果：培养在小鼠胚胎成纤维细胞和永生化人成纤维细胞饲养层上的人胚胎干细胞,其形态相似,呈圆形或椭圆形集落;均表达SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81和Oct-4,但不表达SSEA-1。与小鼠胚胎成纤维细胞饲养层比较,永生化人成纤维细胞饲养层上人胚胎干细胞Oct-4阳性细胞率明显升高(P < 0.05),倍增时间明显延长(P < 0.05)。 结论：人源和鼠源成纤维细胞饲养层上的人胚胎干细胞体外培养生物学特性存在明显差异。     

昆明鼠胚胎干细胞系的建立及其特性

背景：到目前为止,国际上通用的动物胚胎干细胞细胞系大多是从129品系和C57BL/6系小鼠中获得的,少部分来自BALB/C系,来自于中国昆明鼠则鲜有报道。 目的：分离培养昆明系小鼠胚胎干细胞,并对其生物学特性进行初步鉴定。 设计、时间及地点：以细胞为对象的观察性实验,于2006-05/2007-06在南昌大学第一附属医院泌尿外科研究所完成。 材料：昆明小鼠3.5 d胚龄的囊胚。 方法：自昆明系小鼠3.5 d胚龄的囊胚分离内细胞团细胞,接种于小鼠原代胚胎成纤维细胞饲养层上,对分离的内细胞团细胞进行扩增、传代培养。 主要观察指标：观察胚胎干细胞集落的生长情况,对其碱性磷酸酶表达进行染色分析,采用免疫荧光法检测其阶段特异性胚胎抗原1表达,以反转录-聚合酶链反应检测其特异性表达因子c-Myc,Nanog,Oct3/4和Sox2的基因表达情况,并对其体内外分化能力对进行鉴定分析。 结果：分离、培养自内细胞团的细胞呈典型的胚胎干细胞集落样生长,碱性磷酸酶染色及阶段特异性胚胎抗原1荧光染色阳性,细胞表达c-Myc,Nanog,Oct3/4和Sox2等基因,细胞在体内外均能分化成来源于不同胚层的多种细胞类型。 结论：成功从昆明小鼠囊胚中分离并建立一株胚胎干细胞系,其生物学特性与其他胚胎干细胞株相符。     

染色体16三体人胚胎干细胞系的建立

背景：研究显示部分人胚胎干细胞系在建系或体外培养过程中出现染色体异常的现象,建立染色体异常的人胚胎干细胞系,可分析染色体对人胚胎干细胞特性的影响。 目的：拟建立染色体异常的人胚胎干细胞系。 设计、时间及地点：细胞学体内外观察,于2006-10/2008-02在南京大学医学院附属鼓楼医院生殖医学中心完成。 材料：冷冻人胚胎由南京大学医学院附属鼓楼医院生殖医学中心提供,4周龄NOD-scid鼠1只及ICR胎鼠成纤维细胞由南京大学医学院附属鼓楼医院实验动物中心提供。 方法：将人冷冻胚胎解冻后,置于囊胚培养基中微滴培养,胚胎发育至扩张囊胚期时分离囊胚中的内细胞团,以ICR胎鼠成纤维细胞作为饲养层,机械法传代,建立的人胚胎干细胞系命名为NJGLChES2。 主要观察指标：对10代以后的细胞进行核型分析,选择核型异常的人胚胎干细胞系鉴定其碱性磷酸酶和特异性标记物的表达,通过体外类胚体形成实验及体内畸胎瘤成瘤实验观察其分化能力。 结果：NJGLChES2人胚胎干细胞系核型分析结果呈16号染色体三体（47,XX,+16）,呈人胚胎干细胞克隆样生长,碱性磷酸酶和胚胎特异性标记物OCT-4,SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81的表达均为阳性。体外悬浮培养的NJGLChES2人胚胎干细胞可形成囊状拟胚体,体内接种至NOD-scid鼠腹股沟皮下后在接种部位可形成畸胎瘤,肿瘤组织含有来源于鳞状上皮、横纹肌和呼吸道黏膜上皮3个胚层的多种细胞类型。 结论：成功建立16号染色体三体人胚胎干细胞系NJGLChES2,可长期稳定增殖并保持未分化状态,且在体内外具有多向分化潜能。     

碱性成纤维细胞生长因子对胚胎干细胞来源集落形成细胞的作用*

背景：有研究表明,在卵黄囊造血、胎肝造血和在胚胎干细胞向造血干细胞分化过程中,碱性成纤维细胞生长因子可强烈表达。 目的：在拟胚体培养阶段施加碱性成纤维细胞生长因子,验证碱性成纤维细胞生长因子对集落形成细胞产生的调控作用。 方法：购买小鼠胚胎干细胞D3细胞系,取第3~5代小鼠原代胚胎成纤维细胞,加入新配制含丝裂霉素C的DMEM生长培养基孵育2.5 h,使饲养层细胞失去增殖能力;加入胰酶消化适度,离心后制成单细胞悬液,以10×104个/cm2的密度种至用明胶包被的培养瓶中,放入孵箱内培养24 h之后使用。复苏胚胎干细胞D3细胞并将其接种于饲养层细胞之上。在拟胚体培养阶段按培养基成分不同分为2组：对照组(标准培养基+血管内皮生长因子+干细胞因子组)、实验组(标准培养基+血管内皮生长因子+干细胞因子+碱性成纤维细胞生长因子组)。各组于培养3,6d时分别计数克隆形成数,通过免疫荧光法检测Flk-1+细胞表达情况,并用IMAGE-PRO PLUS图像分析系统统计阳性细胞数及平均吸光度值。 结果与结论：与对照组比较,在拟胚体培养阶段加入碱性成纤维细胞生长因子可显著增加集落形成细胞的数量(P < 0.01), Flk-1阳性细胞数及平均吸光度值也显著增加(P < 0.01)。证明碱性成纤维细胞生长因子能够有效地促进胚胎体的扩增以及成血管血液干细胞的产生与增殖。     

Isolation and differentiation of embryonic stem cells from BALB/c mouse

Objective To invest the efficient method which can culture and induce embryonic stem cells to neurocyte in vitro. Methods Isolate the blastula of 3.5 d from BALB/c species mouse. Culture the cells from inner cell mass (inner cell mass, ICM) which were isolated by mechanical method on the mouse embryonic fibroblaste cell (MEF) feeder layer or 0.1% gelatin coated dishes. The stem cells were identified by characterized morphology, alkaline phosphatase stain, differential potency in vivo and immunochemistry stain. The isolated cells were differentiated by serial induction method that mimicking the intrinsic developmental process of the neural system. Results The isolated cells were positive for alkaline phosphatatse and SSEA-1 (stage specific embryonic antigen 1). Moreover they were identified pluripotent by differentiation in vivo. Therefore the isolated cells presented the characters of ESCs. Then the isolated cells were able to differentiate into neurocytes in vitro. Conclusion Mouse embryonic stem cells isolation, culture and differentiation system has been established.     

Isolation and differentiation of embryonic stem cells from BALB/c mouse

Objective To invest the efficient method which can culture and induce embryonic stem cells to neuroeyte in vitro. Methods Isolate the blastula o f 3.5 d from BALB/c species mouse. Culture the cells from inner cell mass （inner cell mass, ICM） which were isolated by mechanical method on the mouse embryonic fibroblaste cell （MEF） feeder layer or 0.1% gelatin coated dishes. The stem ceils were identified by characterized morphology, alkaline phosphatase stain, differential potency in vivo and immunoehemistry stain. The isolated cells were differentiated by serial induction method that mimicking the intrinsic developmental process of the neural system. Results The isolated cells were positive for alkaline phosphatatse and SSEA-1 （ stage specific embryonic antigen 1 ）. Moreover they were identified pluripotent by differentiation in vivo. Therefore the isolated ceils presented the characters of ESCs. Then the isolated cells were able to differentiate into neuroeytes in vitro. Conclusion Mouse embryonic stem ceils isolation, culture and differentiation system has been established.     

胶质母细胞瘤肿瘤干细胞体外分离培养鉴定及生物学特性的研究

目的:探讨人脑胶质母细胞瘤(GBM)肿瘤干细胞的培养方法,观察其体外增殖、分化等生物学特性。方法:应用改良神经干细胞培养基,11例人脑GBM标本中悬浮培养GBM的肿瘤细胞。采用有限稀释法筛选分离具有连续克隆能力的单细胞。通过免疫组化及电镜观察的方法,确定其干细胞特征;通过核型分析探讨该细胞的肿瘤性质;将确定的脑肿瘤干细胞(BTSCs)接种于不含生长因子的干细胞培养基,观察其在体外条件下分化的特点。结果:本组样本中10例(1例污染)获得具有连续克隆和增殖能力及干细胞特征的肿瘤细胞。结论:人脑GBM中存在具有自我更新和增殖潜能的BTSCs,在体外可将其分离、培养和纯化。