染色体16三体人胚胎干细胞系的建立

背景：研究显示部分人胚胎干细胞系在建系或体外培养过程中出现染色体异常的现象,建立染色体异常的人胚胎干细胞系,可分析染色体对人胚胎干细胞特性的影响。 目的：拟建立染色体异常的人胚胎干细胞系。 设计、时间及地点：细胞学体内外观察,于2006-10/2008-02在南京大学医学院附属鼓楼医院生殖医学中心完成。 材料：冷冻人胚胎由南京大学医学院附属鼓楼医院生殖医学中心提供,4周龄NOD-scid鼠1只及ICR胎鼠成纤维细胞由南京大学医学院附属鼓楼医院实验动物中心提供。 方法：将人冷冻胚胎解冻后,置于囊胚培养基中微滴培养,胚胎发育至扩张囊胚期时分离囊胚中的内细胞团,以ICR胎鼠成纤维细胞作为饲养层,机械法传代,建立的人胚胎干细胞系命名为NJGLChES2。 主要观察指标：对10代以后的细胞进行核型分析,选择核型异常的人胚胎干细胞系鉴定其碱性磷酸酶和特异性标记物的表达,通过体外类胚体形成实验及体内畸胎瘤成瘤实验观察其分化能力。 结果：NJGLChES2人胚胎干细胞系核型分析结果呈16号染色体三体（47,XX,+16）,呈人胚胎干细胞克隆样生长,碱性磷酸酶和胚胎特异性标记物OCT-4,SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81的表达均为阳性。体外悬浮培养的NJGLChES2人胚胎干细胞可形成囊状拟胚体,体内接种至NOD-scid鼠腹股沟皮下后在接种部位可形成畸胎瘤,肿瘤组织含有来源于鳞状上皮、横纹肌和呼吸道黏膜上皮3个胚层的多种细胞类型。 结论：成功建立16号染色体三体人胚胎干细胞系NJGLChES2,可长期稳定增殖并保持未分化状态,且在体内外具有多向分化潜能。     

昆明鼠胚胎干细胞系的建立及其特性

背景：到目前为止,国际上通用的动物胚胎干细胞细胞系大多是从129品系和C57BL/6系小鼠中获得的,少部分来自BALB/C系,来自于中国昆明鼠则鲜有报道。 目的：分离培养昆明系小鼠胚胎干细胞,并对其生物学特性进行初步鉴定。 设计、时间及地点：以细胞为对象的观察性实验,于2006-05/2007-06在南昌大学第一附属医院泌尿外科研究所完成。 材料：昆明小鼠3.5 d胚龄的囊胚。 方法：自昆明系小鼠3.5 d胚龄的囊胚分离内细胞团细胞,接种于小鼠原代胚胎成纤维细胞饲养层上,对分离的内细胞团细胞进行扩增、传代培养。 主要观察指标：观察胚胎干细胞集落的生长情况,对其碱性磷酸酶表达进行染色分析,采用免疫荧光法检测其阶段特异性胚胎抗原1表达,以反转录-聚合酶链反应检测其特异性表达因子c-Myc,Nanog,Oct3/4和Sox2的基因表达情况,并对其体内外分化能力对进行鉴定分析。 结果：分离、培养自内细胞团的细胞呈典型的胚胎干细胞集落样生长,碱性磷酸酶染色及阶段特异性胚胎抗原1荧光染色阳性,细胞表达c-Myc,Nanog,Oct3/4和Sox2等基因,细胞在体内外均能分化成来源于不同胚层的多种细胞类型。 结论：成功从昆明小鼠囊胚中分离并建立一株胚胎干细胞系,其生物学特性与其他胚胎干细胞株相符。     

人胚胎干细胞在人源和鼠源饲养层上的生长特性比较**☆◆

背景：不同来源饲养层条件下,人胚胎干细胞是否具有相同或相似的生物学特性尚不清楚,该问题的解决有利于建立标准化的饲养层体系。 目的：观察比较人胚胎干细胞在人源和鼠源饲养层上的生长特性是否相同？ 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-09/2009-02在中国科学院昆明动物所完成。 材料：清洁级孕12.5~13.5 d的ICR小鼠2只,由昆明医学院动物中心提供。永生化人成纤维细胞由美国约翰霍普金斯大学医学院建系并赠送,人胚胎干细胞株BG02由中国科学院昆明动物所提供。 方法：无菌条件下取ICR胎鼠,组织块胰酶消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞,永生化人成纤维细胞按常规培养,两种细胞经γ射线处理后,以2.5×104/cm3接种在明胶包被的6孔板中。取人胚胎干细胞,分别接种在小鼠胚胎成纤维细胞或永生化人成纤维细胞饲养层上,加入含β-巯基乙醇的DMEM/F12培养基,使用前添加碱性成纤维细胞生长因子。 主要观察指标：两种饲养层上的人胚胎干细胞的形态、特异性标记表达、Oct-4阳性率、细胞倍增时间。 结果：培养在小鼠胚胎成纤维细胞和永生化人成纤维细胞饲养层上的人胚胎干细胞,其形态相似,呈圆形或椭圆形集落;均表达SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81和Oct-4,但不表达SSEA-1。与小鼠胚胎成纤维细胞饲养层比较,永生化人成纤维细胞饲养层上人胚胎干细胞Oct-4阳性细胞率明显升高(P < 0.05),倍增时间明显延长(P < 0.05)。 结论：人源和鼠源成纤维细胞饲养层上的人胚胎干细胞体外培养生物学特性存在明显差异。     

小鼠囊胚在胚胎成纤维细胞饲养层上向胚胎干细胞的生长发育

背景：到目前为止已建立了数百个小鼠胚胎干细胞系,一般情况下实验室培养的胚胎干细胞有3个细胞来源,即胚泡内的内细胞群、胚胎生殖嵴的原始生殖细胞和应用克隆技术制造人体胚胎并提取干细胞。 目的：尝试用自制的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层分离培养小鼠胚胎干细胞。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2005-12/2007-09在辽宁医学院完成。 材料：妊娠14.5 d的孕鼠40只,由辽宁医学院实验动物中心提供。 方法：无菌条件下剪开孕鼠子宫壁,取出胚胎,去除头、尾、内脏和四肢后采用胰蛋白酶消化法分离培养小鼠胚胎成纤维细胞,经丝裂霉素C处理3.5 h后接种于6孔板中,细胞贴壁后即为成纤维细胞饲养层。收集3.5 d的小鼠囊胚,在显微镜下将囊胚置于上述6孔板的中央,五六天后取隆起生长的内细胞团块,分离后再培养。 主要观察指标：成纤维细胞饲养层的制备情况,胚胎干细胞的生长状态、碱性磷酸酶染色结果及分化趋势。 结果：光镜下小鼠胚胎成纤维细胞呈不规则形,生长较快,传代比例为1∶4,经丝裂霉素C处理后细胞贴壁较慢,失去分裂增殖能力。小鼠囊胚孵出透明带的时间为24~72 h,从胞膜中孵出约为1 d,3~5 d后可形成胚胎干细胞集落,7 d后集落呈“鸟巢”状。组织化学染色后可见细胞内有大量的蓝紫色颗粒沉积,连续培养20 d,期间不换培养液,可见胚胎干细胞团分化为亮度较小、界限清楚的单核细胞。 结论：小鼠囊胚在胚胎成纤维细胞饲养层上可发育成胚胎干细胞,并能进行传代。     

小鼠胚胎及人包皮成纤维细胞按比例制成混合饲养层上的人胚胎干细胞生长状态★

目的：人胚胎干细胞传代培养的关键是抑制其自发分化、保证细胞的全能性。欲解决以小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞为常规饲养层培养人胚胎干细胞时存在的问题，观察两者按一定比例制成的混合饲养层上人胚胎干细胞的生长状态。 方法：实验于2006-04/2007-07在海南医学院附属医院生殖医学中心完成。①对象：包皮来自于行包皮环切的儿童，由海南医学院附属医院泌尿外科提供，儿童家属对治疗及实验均签署知情同意书，实验经医院医学伦理委员会批准。人胚胎干细胞系HN-1由本实验室从人类囊胚中分离培养并鉴定。清洁级孕12.5~14.5 d的胎鼠11只，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：将去除头、四肢和内脏的胎鼠按常规胰蛋白酶反复消化法获得细胞悬液进行接种培养，待生长汇合后冻存部分原代细胞，用丝裂霉素C处理2.0~3.0 h后，按1×108 L-1密度接种于明胶包被的中心皿内，即小鼠胚胎成纤维细胞饲养层。人包皮成纤维细胞的分离培养与饲养层制备同上。上述两种成纤维细胞分别计数后，按1∶0，3∶1，1∶1， 1∶3，0∶1比例混合，然后以1×108 L-1密度接种于明胶包被的中心皿内，即混合饲养层。③实验评估：观察体外传代培养的人胚胎干细胞在3种不同饲养层上的生长状态。并对生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞进行碱性磷酸酶检测、OCT-4表达免疫组化检测、OCT-4及端粒酶mRNA表达RT-PCR检测。撤除饲养层，观察人胚胎干细胞体外分化情况。 结果：①不同饲养层上人胚胎干细胞的生长状态比较：生长在小鼠胚胎成纤维细胞和人包皮成纤维细胞上的人胚胎干细胞克隆扁平、不饱满，而生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞克隆饱满、厚实，其克隆形态显著好于其他两种饲养层。②人胚胎干细胞在不同比例混合饲养层上的生长状态比较：小鼠胚胎成纤维细胞：人包皮成纤维细胞按1∶1混合时，人胚胎干细胞显著堆积生长，克隆边缘清晰、隆起明显且饱满，按1∶3混合时无明显变化，优于其余3种混合比例。③混合饲养层上人胚胎干细胞未分化状态的检测：碱性磷酸酶染色及OCT-4抗原表达均呈强阳性，分别在200~300 bp和300~400 bp处可见OCT-4和端粒酶 mRNA表达的特异性条带。④体外分化实验：能形成拟胚体，贴壁后人胚胎干细胞可分化为多种形态的细胞。 结论：①与小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞常规饲养层相比，二者混合饲养层能够更好的支持人胚胎干细胞的体外传代培养，获得更佳的克隆形态。②小鼠胚胎成纤维细胞与人包皮成纤维细胞的混合比例为1∶1时效果较好。     

三种不同饲养层上人胚胎干细胞生长状态的比较★

背景：人胚胎干细胞传代培养的关键是抑制其自发分化、保证细胞的全能性。以小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞作为饲养层尽管能够维持胚胎干细胞的未分化状态，但存在细胞克隆不饱满、平铺情况明显等问题。 目的：制备小鼠胚胎成纤维细胞与人包皮成纤维细胞的混合饲养层，观察人胚胎干细胞在其上面的生长状态。 设计：多样本观察比较。 单位：海南医学院附属医院生殖医学中心。 材料：实验于2006-04/2007-07在海南医学院附属医院生殖医学中心完成。包皮来自于行包皮环切的儿童，由海南医学院附属医院泌尿外科提供，儿童家属对治疗及实验均签署知情同意书，实验经医院医学伦理委员会批准。人胚胎干细胞系HN-1由本实验室从人类囊胚中分离培养并鉴定。清洁级孕12.5~14.5 d的胎鼠11只，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。 方法：胎鼠麻醉后去除头、四肢和内脏，按常规胰蛋白酶反复消化法获得细胞悬液进行接种培养，待生长汇合后冻存部分原代细胞，用丝裂霉素C处理2.0~3.0 h后，按1×108 L-1密度接种于明胶包被的中心皿内，即小鼠胚胎成纤维细胞饲养层。人包皮成纤维细胞的分离培养与饲养层制备同上。上述两种成纤维细胞分别计数后，按1∶0，3∶1，1∶1，1∶3，0∶1比例混合，然后以1×108 L-1密度接种于明胶包被的中心皿内，即混合饲养层。观察体外传代培养的人胚胎干细胞在3种不同饲养层上的生长状态，并对生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞进行碱性磷酸酶检测、OCT-4表达免疫组化检测、OCT-4及端粒酶mRNA表达RT-PCR检测。撤除饲养层，观察人胚胎干细胞体外分化情况。 主要观察指标：①不同饲养层上人胚胎干细胞的生长状态比较。②人胚胎干细胞在不同比例混合饲养层上的生长状态比较。③混合饲养层上人胚胎干细胞未分化状态的检测。④体外分化实验。 结果：①：生长在小鼠胚胎成纤维细胞和人包皮成纤维细胞上的人胚胎干细胞克隆扁平、不饱满，而生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞克隆饱满、厚实，其克隆形态显著好于其他两种饲养层。②：小鼠胚胎成纤维细胞：人包皮成纤维细胞按1∶1混合时，人胚胎干细胞显著堆积生长，克隆边缘清晰、隆起明显且饱满，按1:3混合时无明显变化，优于其余3种混合比例。③：碱性磷酸酶染色及OCT-4抗原表达均呈强阳性，分别在200~300 bp和300~400 bp处可见OCT-4和端粒酶mRNA表达的特异性条带。④：能形成拟胚体，贴壁后人胚胎干细胞可分化为多种形态的细胞。 结论：①与小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维细胞常规饲养层相比，两者混合饲养层能够更好的支持人胚胎干细胞的体外传代培养，获得更佳的克隆形态。②小鼠胚胎成纤维细胞与人包皮成纤维细胞的混合比例为1∶1时效果较好。     

小鼠饲养层细胞制备与小鼠胚胎干细胞SF1-G的培养

背景：小鼠胚胎干细胞系SF1-G是由雌性C57BL/6 小鼠与雄性M. spretus 小鼠交配后,取桑葚胚期胚胎在STO饲养层细胞上分离培养获得,STO细胞较昂贵,而由小鼠胚胎成纤维细胞制备的饲养层细胞不仅取材容易,而且形成胚胎干胞的克隆率、维持胚胎干细胞正常核型的能力均比STO细胞要好一些,因此,建立一种适宜SF1-G细胞扩增的培养体系,保持其未分化状态生长是充分利用胚胎干细胞资源的前提。 目的：建立有效的小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及胚胎干细胞饲养层细胞制备体系;以建立有效的小鼠胚胎干细胞(SF1-G细胞)扩增培养体系。 方法：从孕12.5~14.5 d的ICR小鼠分离培养原代小鼠胚胎成纤维细胞;取 3~5 代的小鼠胚胎成纤维细胞,以丝裂霉素C抑制其增殖能力制备饲养层细胞;在饲养层细胞上增殖培养SF1-G细胞;染色体G显带分析法检测SF1-G细胞核型,SF1-G细胞碱性磷酸酶染色和RT-PCR检测Oct4、Nanog基因表达。 结果与结论：从孕鼠胚胎有效分离到小鼠胚胎成纤维细胞,以3~5代细胞制备的饲养层细胞能够支持胚胎干细胞SF1-G呈边界清晰的克隆样生长。染色体核型检测 SF1-G保持正常核型,碱性磷酸酶、表面标志物检测均呈阳性。实验建立了有效的小鼠胚胎成纤维细胞分离培养体系,并制备供胚胎干细胞进行增殖培养饲养层细胞体系,能够在实验室对 SF1-G细胞保持正常未分化状态培养。     

人胚胎干细胞的保存方法*☆

目的：胚胎干细胞经传代长期培养后会导致核型出现异常、未分化细胞的克隆数减少，因此经低温保存后复苏的胚胎干细胞必须要保持其未分化状态及生物学特性。实验拟比较程序降温法、改良慢速冻存法及传统慢速冻存法对人胚胎干细胞冷冻保存的效率，以及解冻后细胞生长与分化的状态。 方法：实验于2006-07/2007-04在解放军军事医学科学院野战输血研究所完成。①材料：清洁级孕13.5 d的ICR小鼠由军事医学科学院动物中心提供，用于制备鼠成纤维细胞饲养层，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。人胚胎干细胞系PKU由北京大学第三医院生殖中心建立并提供；kryo-550-16程序降温仪为英国planner公司产品，由液氮压力泵、液氮罐、层流冷冻箱、温度传感器组成。 ②实验方法：将人胚胎干细胞系PKU接种在胚胎鼠成纤维细胞饲养层上，胶原酶Ⅳ消化传代，分3组冷冻保存人胚胎干细胞。程序降温法：用吸管将消化后人胚胎干细胞吹成若干团块，取65个团块移入配制的冻存液中，装入麦管进行三段式降温，即22 ℃~-7 ℃，每分钟降温2.5 ℃→-7 ℃置核后停留5 min→-7 ℃~-30 ℃，每分钟降温0.3 ℃→-30 ℃~-150 ℃，每分钟降温10 ℃。降至-150 ℃时置液氮中保存。改良慢速冻存法：A管含人胚胎干细胞培养基和血清替代品，B管含人胚胎干细胞培养基和二甲亚砜，将60个团块置入A管，再将B管液体移入A管，混匀后-70 ℃过夜，第2天移入液氮中保存。传统慢速冻存法：将60个团块直接放入添加二甲亚砜的人胚胎干细胞培养基中混匀，分装入冻存管，-4 ℃放置1 h，-70 ℃过夜，第2天移入液氮长期保存。③实验评估：解冻后，将保持完整形态且细胞未散离的人胚胎干细胞团块回收，比较3组细胞复苏率、复制生长状态、克隆分化程度。鉴定程序降温组人胚胎干细胞的生物学特性。 结果：①复苏率：程序降温组、改良慢速冻存组、传统慢速冻存组的细胞复苏率分别为78.5%、56.7%和23.3%，组间比较差异有显著性意义（x2=6.81~13.89，P < 0.01）。②复制生长与克隆分化程度：解冻后第7天与传统慢速冻存组比较，程序降温组及改良慢速冻存组细胞克隆均明显增大（t=7.36，P < 0.05；t=6.89，P < 0.05），且解冻后克隆不易分化（x2=20.47，P < 0.01；x2=9.69，P < 0.01）。③生物学特性鉴定：程序降温组解冻后第10代人胚胎干细胞染色体核型正常，人胚胎干细胞特异性表面抗原SSEA-4及TRI-1-81表达呈阳性，RT-PCR可检测到nanog基因表达，SSEA-4及OCT-4阳性表达率分别为83.44%、89.38%。 结论：①程序降温法是冷冻保存人胚胎干细胞的有效方法，解冻后的干细胞在继续培养过程中仍可保持其正常核型和生物学特性。②在不具备程序降温仪的条件下，采用改良慢速冻存法保存胚胎干细胞也是可行的。     

昆明小鼠胚胎干细胞最佳分离方法及培养液选择

背景：到目前为止已经建立数百个小鼠胚胎干细胞系,昆明小鼠是中国应用最多的实验小鼠,其建系成功报道极少。 目的：建立一简单有效的昆明小鼠胚胎干细胞分离培养体系,以提高昆明鼠胚胎干细胞建系成功率。 方法：用添加血清替代物或胎牛血清培养液的小鼠胚胎成纤维细胞制备饲养层。昆明小鼠经孕马血清促性腺激素和人绒毛膜促性腺激素促排卵,交配后3.5 d冲洗子宫取胚胎,将胚胎接种在饲养层中培养,观察胚胎贴壁、内细胞团集落形成率。4~ 6 d后在0.05%trypsin-0.02%EDTA消化液中用切割法处理增殖的内细胞团块,再接种到新的饲养层上。倒置显微镜下观察形成的胚胎干细胞样集落形态。 结果与结论：妊娠3.5 d孕鼠适合胚胎干细胞的分离培养;在0.05%trypsin-0.02%EDTA消化液中采用切割法进行内细胞团集落的分离,集落增殖快、分化低;在含胎牛血清培养液中进行干细胞培养较血清替代物培养液中传代次数多,此培养液更适宜进行分离培养昆明鼠胚胎干细胞。     

鸡胚胎干细胞分离方法和培养体系的优化

背景：胚胎干细胞是从动物早期胚胎的内细胞团或原始生殖细胞分离出来的具有发育全能性的一种未分化的无限增殖细胞系。而鸡胚胎干细胞则是从X期鸡胚的胚盘分离而来。 目的：优化鸡胚胎干细胞分离方法和离体培养体系。 方法：采用滤纸纸环-发环的方法从X期鸡胚分离胚盘细胞,并采用STO细胞作为饲养层和大鼠肝细胞(BRL)条件培养基(CM)+细胞因子作为离体培养体系对分离的胚盘细胞进行培养。 结果与结论：滤纸纸环-发环法获得的完整胚盘率为75%~85%,克隆形成率约为50%。BRL-CM+饲养层培养体系,鸡胚胎干细胞可传至7代,而BRL-CM+饲养层+细胞因子培养体系,鸡胚胎干细胞可传至25代。分离到的鸡胚胎干细胞,经碱性磷酸酶染色、SSEA-1染色鉴定,表明鸡胚胎干细胞处于未分化状态。提示,实验不仅优化了鸡胚胎的分离方法,获得完整且杂质少的胚盘,而且进一步优化了鸡胚胎干细胞体外培养体系。     

Derivation of embryonic stem cell line from frozen human embryos and neural differentiation

We established a human embryonic stem cell line derived from frozen human embryos of Chinese origin. The cell line expressed the pluripotent markers SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, Oct-4, and alkaline phosphatase. The pluripotency of the cell line was also demonstrated in vivo by teratoma formation in severe combined immunodeficiency mice. The embryonic stem cells formed embryoid bodies after culturing in suspension for 7 days. The embryoid bodies were transferred to an adherent culture system in serum-free medium. The differentiating cells derived from the embryoid bodies expressed Nestin and Sox2, markers of neural progenitor cells. After the induction of cyclic AMP for 7 days, the neural progenitor cells had differentiated into neurons and glial cells.     

Clonal neural stem cells from human embryonic stem cell colonies

Clonal cell culture is crucial for experimental protocols that require growth or selection of pure populations of cells. High-density derivation of neural progenitors from human embryonic stem cells (hESCs) can lead to incomplete differentiation, and transplantation of resulting heterogeneous cell mixtures can cause proliferation of tumorigenic clusters in vivo. We have identified the neural precursor that resides among normal hESC colonies as a TRA-1-60(-)/SSEA4(-)/SOX1(+) cell and developed a method that allows for the clonal expansion of these FACS-selected progenitors to neural stem cells (NSCs) in serum-free conditions. Single TRA-1-60(-)/SSEA4(-)/SOX1(+) cells grown in serum-free media give rise to multipotent NSCs with an efficiency of 0.7%. The fate of the TRA-1-60(-)/SSEA4(-)/SOX1(+) neural precursor becomes specified in maintenance conditions by inhibition of BMP signaling. This clonal culture method can be scaled up to produce NSCs for differentiation and use in cell therapies.     

人羊膜上皮细胞的干细胞特性***☆

背景：研究发现人羊膜上皮细胞具有类似胚胎干细胞或多能干细胞的多向分化潜能,说明其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞。 目的：研究体外培养的人羊膜上皮细胞的干细胞特性。 方法：取足月剖宫产的人羊膜组织,经酶消化法和差异黏附法获得纯度高的人羊膜上皮细胞,接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中进行原代和传代培养,用免疫荧光法和流式细胞仪检测法检测人羊膜上皮细胞表面胚胎干细胞的表面标记蛋白OCT-4和干细胞表面分子标记CD29、CD34、CD44、CD45、CD105的表达。 结果与结论：人羊膜上皮细胞在体外培养条件下呈上皮细胞特有的铺路石样外观,其胞浆中有OCT-4免疫荧光表达,其干细胞标记分子CD29、CD34的表达是阳性,但干细胞标记分子CD44、CD45、CD105的表达为阴性。结果表明人羊膜上皮细胞具有干细胞的某些特性,其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞。     

Isolation and differentiation of embryonic stem cells from BALB/c mouse

Objective To invest the efficient method which can culture and induce embryonic stem cells to neurocyte in vitro. Methods Isolate the blastula of 3.5 d from BALB/c species mouse. Culture the cells from inner cell mass (inner cell mass, ICM) which were isolated by mechanical method on the mouse embryonic fibroblaste cell (MEF) feeder layer or 0.1% gelatin coated dishes. The stem cells were identified by characterized morphology, alkaline phosphatase stain, differential potency in vivo and immunochemistry stain. The isolated cells were differentiated by serial induction method that mimicking the intrinsic developmental process of the neural system. Results The isolated cells were positive for alkaline phosphatatse and SSEA-1 (stage specific embryonic antigen 1). Moreover they were identified pluripotent by differentiation in vivo. Therefore the isolated cells presented the characters of ESCs. Then the isolated cells were able to differentiate into neurocytes in vitro. Conclusion Mouse embryonic stem cells isolation, culture and differentiation system has been established.     

Isolation and differentiation of embryonic stem cells from BALB/c mouse

Objective To invest the efficient method which can culture and induce embryonic stem cells to neuroeyte in vitro. Methods Isolate the blastula o f 3.5 d from BALB/c species mouse. Culture the cells from inner cell mass （inner cell mass, ICM） which were isolated by mechanical method on the mouse embryonic fibroblaste cell （MEF） feeder layer or 0.1% gelatin coated dishes. The stem ceils were identified by characterized morphology, alkaline phosphatase stain, differential potency in vivo and immunoehemistry stain. The isolated cells were differentiated by serial induction method that mimicking the intrinsic developmental process of the neural system. Results The isolated cells were positive for alkaline phosphatatse and SSEA-1 （ stage specific embryonic antigen 1 ）. Moreover they were identified pluripotent by differentiation in vivo. Therefore the isolated ceils presented the characters of ESCs. Then the isolated cells were able to differentiate into neuroeytes in vitro. Conclusion Mouse embryonic stem ceils isolation, culture and differentiation system has been established.     

兔骨髓基质细胞核移植的初步研究

目的 通过建立骨髓基质细胞核移植的方法，为进一步从克隆囊胚的内细胞团细胞分离培养出全能性的胚胎干细胞并用于治疗性克隆等研究奠定基础。方法 超排获得的兔成熟卵母细胞去核后，将同种的单个骨髓基质细胞核注入其内；电融合后，经离子霉素（ionomycin）和6-甲氨基嘌呤（6-DMAP）激活，用10％胎牛血清（FBS）的TCM-199进行体外培养直至囊胚阶段。结果 实验对147个卵母细胞去核，去核成功率为70．75％（104／147）；注核后有82．69％（86／104）的卵细胞保持形态完整；重构后的体细胞-卵母细胞质复合体经电融合后的融合率为56．79％（46／81）；激活后的重构胚于体外培养后分裂率为65．22％（30／46），囊胚率为17．39％（8／46），获得的囊胚有62．5％（5／8）进入孵化阶段；孵化出来的细胞贴壁生长并向周围扩展，显示了具有向下一阶段发育的潜能，为从囊胚内细胞团细胞中分离并培养出胚胎干细胞提供了可能。结论 实验结果表明，以兔成体体细胞的骨髓基质细胞为核供体，经克隆技术生产出囊胚并从中分离内细胞团细胞具有可行性。     

羊水来源OCT-4阳性胎儿间充质干细胞向血管内皮细胞的体外诱导分化

背景：已证实将血管内皮细胞与具有良好组织相容性的生物材料复合,并移入体内后可增殖分化形成血管。但由于获取内皮细胞时创伤较大,所以细胞来源是一个急需解决的问题。 目的：探讨羊水来源OCT-4阳性胎儿间充质干细胞分化为内皮细胞的可行性。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-06/2009-03在上海交通大学医学院附属新华医院科研中心完成。 材料：羊水标本来自孕16~22周行产前诊断的孕妇,在超声引导下行羊膜腔穿刺取得60 mL羊水。 方法：采用免疫磁珠细胞分选法去除人羊水细胞中CD44和SSEA-4阳性细胞,使OCT-4阳性胎儿间充质干细胞间接得到分离,并在体外进行培养扩增。取第3代羊水来源OCT-4阳性胎儿间充质干细胞,诱导组换用含体积分数为15%胎牛血清的内皮细胞生长培养液,对照组持续用原培养液培养细胞。 主要观察指标：倒置相差显微镜观察诱导过程中细胞形态变化,采用间接细胞免疫荧光法、内皮细胞吞噬DiI-acLDL法检测诱导效果。 结果：诱导30 d后,镜下观察细胞集落相互连接,呈典型的“鹅卵石”样外观,经诱导的羊水来源OCT-4阳性胎儿间充质干细胞可在体外保持良好的增殖活力。诱导后的贴壁细胞eNOS和vWF呈阳性表达,细胞胞浆内可见发出红色荧光的DiI阳性细胞;对照组细胞免疫荧光染色eNOS和vWF均呈阴性,且无红色荧光细胞出现。 结论：羊水来源的OCT-4阳性的胎儿间充质干细胞在适当的体外微环境下,可诱导分化为血管内皮细胞。     

Multipotency of human neural stem cells from fetal striatum

We had reported that neural stem cells from human fetal striatum (hsNSCs) expressed neural stem cell markers, and were capable of differentiation into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes in vitro. To examine multipotency of hsNSCs, some experiments of transgerm layer differentiation in vitro were carried out. Our data indicated that hsNSCs could also generate osteocytes, adipocytes, and hepatocyte-like cells in vitro. Meanwhile, we injected hsNSCs into murine blastocysts at embryonic day 3.5 of gestation. Microinjection of hsNSCs led to the generation of chimeric embryos. Embryos at embryonic day 3.5 of gestation were shown to contribute to the hsNSC-derived cells by PCR-southern blot of 17alphamod, a special method to discover human cells from animals. Analysis of the donor distribution in different tissues showed that donor-derived cells seeded to various tissues. The cellular nature of the human donor cells in chimeric tissues is, however, currently unknown, and further work will be done to identify what differentiated phenotypes have developed from the human cells.