VNTR位点对结核分枝杆菌基因分型的研究

目的：初步评价15个可变串联重复序列（VNTR）位点对结核分枝杆菌临床分离株的分型能力,寻找适合湖州地区结核分枝杆菌基因分型的位点。方法2011年1-4月连续收集湖州地区结核分枝杆菌临床分离株,采用多位点数目多位点串联系复序列（MLVA）分析方法,对15个VNTR位点进行基因多态性检测,分析单个位点以及15个位点组合的基因分型能力（Hunter-gaston指数,HGDI）。结果分辨率较好的多态性位点有2个：Mtub-21和Mtub -39;分辨率中等的多态性位点共7个：ETR-A,ETR-C,MIRU -10,MIRU -23, MIRU-27,MIRU-40和Mtub-30;分辨率较差的多态性位点有6个：ETR-B,ETR-D,ETR-E,MIRU-16和MIRU-26和MIRU-39。通过计算,本次研究运用15个位点进行基因分型的 HGDI 为0.99,分辨能力好。结论 VNTR位点对结核分枝杆菌基因的分辨力较好,但还需继续寻找其他丰富多态性的VNTR位点,以便快速分型,提高分辨力。     

不同串联重复序列位点组合用于中国结核分枝杆菌基因分型的能力比较分析

目的 初步评价不同串联重复序列(VNTR)位点在中国8省市结核分枝杆菌基因分型中的应用,寻找适合中国地区结核分枝杆菌基因分型的位点组合.方法 从中国8个省(市、自治区)2800余株结核分枝杆菌临床分离菌株中以简单数字表法随机抽取140株,采用多位点数目可变串联重复序列分析方法(MLVA)对27个数目可变VNTR位点进行基因多态性检测,采用BioNumerics数据库软件进行单位点和不同位点组合的分辨率(Hunter-Gaston指数,HGI)分析,并比较分析其对140株菌的基因分型鉴定能力.同时采用间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)将140株菌分为北京家族和非北京家族,评价上述不同VNTR位点组合在北京家族和非北京家族中的分型能力.结果 140株菌主要可分为2个基因群,即北京家族112株,占80%;非北京家族28株,占20%.Spoligotyping分型对140株结核分枝杆菌的HGI为0.4589.MLVA分析结果显示不同位点在不同菌株群存在明显的多态性,不同位点的HGI具有较大差异(0～0.809),对全部菌株、北京家族菌株、非北京家族菌株的HGI达到0.5以上的VNTR位点数分别为8、7和14个.27个VNTR位点进行不同的位点组合:优化筛选的8位点组合、国际推荐的12个、15个和24个位点组合.4个组合的HGl分别为0.9991、0.9882、0.9980和0.9986;在北京家族菌株中,上述组合的HGI依次为0.9987、0.9318、0.9969和0.9975;在非北京家族菌株中分别为1、0.9894、1和1.结论不同的VNTR位点和不同VNTR位点组合在中国8省市结核分枝杆菌中的HGI均存在明显差异;本研究优化的8个位点组合MLVA分型方法在中国结核分枝杆菌流行病学研究可能具有良好的应用前景.     

浙江省宁波地区结核分枝杆菌VNTR基因分型研究

目的初步探讨数目可变串联重复序列(VNTR)技术在宁波地区结核分枝杆菌基因分型中的应用。方法根据文献选取7个分型效果较好的VNTR基因位点,应用聚合酶链反应(PCR)和琼脂糖凝胶电泳,分析结核分枝杆菌DNA多态性。结果本研究组共对138株结核分枝杆菌的7个VNTR位点进行了检测,共产生7个基因簇和123个独立基因型,成簇率为5.80%,VNTR-7位点基因分型技术分辨率指数(HGI)为0.999 1。结论VNTR-7位点基因分型技术对宁波地区结核分枝杆菌的分析有较高的分辨力,操作简便,适用于宁波地区结核病分子流行病学研究。     

应用VNTR技术对绵阳地区结核分枝杆菌进行基因分型

目的应用数目可变串联重复序列(variable number of tandem repeats,VNTRs)分析技术探讨绵阳地区结核分枝杆菌的基因分型,为结核病的防治提供科学依据。方法选取绵阳地区结核分枝杆菌临床分离菌株,采用聚合酶链反应(PCR)分别对VNTR位点进行检测分析,应用BioNumerics 5.0软件进行聚类分析。结果共对79株结核分枝杆菌的15个VNTR位点进行了检测,结果显示明显的基因多态性。各个位点的分辨能力不同,QUB-11b位点的分辨指数(Hunter-Gaston index,HGI)最高,为0.880;ETR C的HGI最低,为0.234;总HGI达到1。经聚类分析,79株菌可分为7个基因群、79个基因型,以Ⅲ群和Ⅴ群所占比例较大,Ⅲ群含37株菌,占46.8%;Ⅴ群含33株菌,占41.8%,其他菌株呈散在分布。结论绵阳地区结核分枝杆菌VNTRs基因存在明显的多态性,主要流行菌群为Ⅲ群和Ⅴ群,应加强此两群菌株的监控。     

仙居县80株结核分枝杆菌临床分离株VNTR基因分型研究

目的了解仙居县结核分枝杆菌临床分离株不同基因型的分布情况,探讨该县结核病分子流行病学特征。方法收集2011年4月-2012年3月仙居县分离的80株结核分枝杆菌,采用15位点VNTR方法进行基因分型,用Bio Numerics 5.0软件对结果进行聚类分析。结果 15个VNTR位点中,MIRU26和Mtub21(HGI=0.827)多态性较高,ETRC(HGI=0.165)和ETRB(HGI=0.292)多态性较差;15位点VNTR分型方法的HGI指数为0.998。经Bio Numberics5.0软件聚类分析,可将检测到的78个基因型分为8个基因群(Ⅰ群~Ⅷ群),各群所含基因型分别为Ⅰ群7个,占8.97%;Ⅱ群8个,占10.26%;Ⅲ群43个,占55.13%;Ⅳ群5个,占6.41%;Ⅴ群2个,占2.56%;Ⅵ群7个,占8.97%;Ⅶ群4个,占5.13%;Ⅷ群2个,占2.56%。结论仙居县流行的结核分枝杆菌VNTR基因存在明显多态性,至少有8个VNTR基因群,主要流行群为Ⅲ群。     

青海省结核分枝杆菌临床分离株可变数目串联重复序列基因多态性研究

目的 初步了解青海省结核分枝杆菌临床分离株基因多态性和基因分型特征。方法 2009-2012年收集青海省疾病预防控制中心分离的结核分枝杆菌临床分离株,提取DNA,对15个可变数目串联重复序列(VNTR)位点进行PCR扩增和产物电泳分析,使用BioNumerics软件对菌株进行聚类分析。结果 共检测251株结核分枝杆菌临床分离株的15个VNTR位点,显示这些菌株有明显的基因多态性,15个VNTR位点中Hunter-Gaston指数>0.6的VNTR位点有6个,位点分辨能力最高的是MIRU26,经聚类分析,可分为4个基因群,238个基因型。4个基因群分别占4.9%、91.9%、1.6%和1.6%。结论 青海省流行的结核分枝杆菌菌株存在明显的VNTR基因多态性。     

MIUR-VNTR在乌鲁木齐市耐药结核分枝杆菌基因分型中位点稳定性的研究

目的 通过对MIRU-VNTR分型技术在新疆乌鲁木齐市耐药结核病基因分型的研究,明确乌鲁木齐市12个标准VNTR分型位点的稳定性,为结核病耐药菌株演变、病源追踪、暴发调查及快速诊断等方面提供理论依据.方法 采用间隔重复单元的可变数目串联重复序列(Mycobacteral interspersed repetive units-Variable number tandem repeat,MIRU-VNTR)分型方法,选择标准12位点VNTR,对65例耐药结核分枝杆菌进行DNA检测,使用MIRU-VNTR数据分析网站进行聚类分析,并进行分辨率指数(HGI)及VNTR等位基因多态性分析.结果 12个VNTR位点等位基因多态性存在差异;除MIRU26位点分辨率较低(h =0.3381)外,其余各位点分辨率均较高(h＞0.6);65株菌株可分4大群、3种基因型,成5簇,成簇率为29.231％;结论 乌鲁木齐市耐药结核分枝杆菌12个标准VNTR位点等位基因多态性保持较为稳定;采用标准12位点MIRU-VNTR技术对耐药结核病进行基因分型、成簇性分析等分子流行病研究,所得结果可靠.     

15位点重复单元-可变数目串联重复序列技术在河南地区结核分枝杆菌的基因分辨率的对比分析研究

目的 比较15位点分枝杆菌散在重复单元-可变数目串联重复序列(MIRU-VNTR)对河南省结核分枝杆菌的分辨力与其他地区的区别。方法 使用Spoligotyping和MIRU-VNTR对菌株进行分型,分析北京家族基因型在性别、年龄和地区间的分布情况。将15个位点对本省菌株的分辨率与其他地区结果相比较。结果 本省东部地区患者感染北京家族结核的比例高于其他地区,尤其高于西部地区。本省55岁以上的人群更易感染北京型菌株。7个位点(Mtub04、MIRU10、MIRU39、MIRU31、Mtub21、MIRU26和Qub26)对河南菌株的分辨能力优于其他地区。15位点MIRU-VNTR结合Spoligotyping的分辨力高于我国其他大部分地区,但略低于上海和黑龙江。结论 北京基因型在本省的分布存在地区和年龄的差异。15个位点MIRU-VNTR的分辨力在本省和其他地区间存在明显不同,因此需针对本省菌株指定合适的分型方案。     

344株结核分枝杆菌的基因分型研究

目的研究间隔区寡核苷酸序列基因分型技术、结核分枝杆菌散在分布重复单位(MIRU),以及多位点串联重复序列(VNTR)在河南省结核病分枝杆菌基因分型中的应用,了解河南省局部地区MIRU-VNTR基因型种类与分布,以及北京家族基因型在河南省的分布特征。方法应用2007年在河南省的嵩县、新密县、扶沟县、中牟县等4个县及南阳市的结核病防治机构实验室分离培养的344株结核分枝杆菌,设计引物,应用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术及间隔区寡核苷酸分型技术对结核分枝杆菌进行VNTR分型检测分析,基因分型聚类分析采用Bio-Numerics软件。结果对344株结核分枝杆菌临床分离株的间隔区寡核苷酸分型结果显示,有299株为北京家族基因型,占86.9%;12个MIRU位点检测结果显示明显的基因多态性;经基因聚类分析,可分5个基因群(Ⅰ~Ⅴ群),292个基因型,Ⅰ~Ⅴ群分别占5.1%、67.8%、21.9%、1.4%、2.8%。结论河南省结核分枝杆菌MIRUs基因存在明显的多态性,存在≥5个MIRU型,主要流行型为Ⅱ型;北京家族基因型占主导地位,北京家族基因型与耐药无明显相关性。     

武汉市耐多药结核分枝杆菌的MIRU-VNTR分子特征

目的 描述武汉市耐多药结核分枝杆菌基因型分布及成簇特征。方法 选取15个结核分枝杆菌重复序列（mycobacterial interspersed repetitive unit,MIRU）,对98株耐多药结核分枝杆菌进行多位点数目可变串联重复序列分析（mycobacterial interspersed repetitive unit-variable number tandem repeat typing,MIRU-VNTR）分型,计算差异遗传值、Hunter-Gaston指数（Hunter-Gaston discriminatory index,HGDI）、成簇率以及近期感染率最小估计值。结果 MIRU位点组合的多态性差异遗传值为0.960 4、HGDI为0.970 8,多态性和分辨指数最高的位点为Mtub 21及MIRU 26。共产生7个基因簇和65个独立基因型,成簇率为33.67%,近期感染率最小估计为26.53%。结论 15位点MIRU-VNTR分型法分辨指数较高,适合于武汉地区耐多药结核分枝杆菌的基因分型。尽管武汉市耐多药肺结核病的流行多半归因于内源性复燃,但仍有较高比例的近期传播。     

MIRU-VNTR和Spoligotyping用于重庆地区210株儿童结核分枝杆菌临床分离株的基因分型

目的 评价间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)和基于结核分枝杆菌散在分布数目可变串联重复序列分析(MIRU-VNTR)方法在重庆地区儿童结核病分子流行病学中的应用.方法 收集重庆地区210株儿童结核分枝杆菌(MTB)临床分离株,应用上述两种分型方法进行比较分析.结果 采用Spoligotyping分型方法,210株菌可分为2个基因群44种基因型,其中最大的1个基因群即北京家族(北京基因型)含有130株菌(61.90%).采用MIRU-VNTR分析发现24个位点的多态性差异较大,不同MIRU位点组合(12、15和24位点)的分辨率指数依次升高,后两个组合的差异是由位点ETR-B引起.各位点和各位点组合在北京家族菌株中的分辨率指数均高于非北京家族菌株.结论 重庆地区儿童MTB具有明显的基因多态性,其主要流行型为北京家族.在结核病原学监测中,可先采用Spoligotyping,再对成簇菌株进行15位点与ETR-B组合二次分型的联合分型策略,可提高分子流行病学调查效果.

Abstract：

Objective To evaluate the application of spacer oligonucleotide typing (Spoligotyping) and mycobaeterial interspersed repetitive unit-variable-number tandem repeat (MIRU-VNTR) analysis in the molecular-epidemiological study of tuberculosis and to discuss the characteristics of pediatric Mycobacterium (M.) tuberculosis strains in Chongqing. Methods M. tuberculosis strains isolated and typed by Spoligotyping and MIRU-VNTR respectively, from the children patients in Chongqing and to compare the results from both methods, epidemiologically. Results By means of Spoligotyping, 210 clinical isolates were divided into 2 gene groups, displaying 44 genotypes. Among them, the biggest group was M. tuberculosis Beijing family, including 130 strains (61.90%) ,using the Spoligotyping. From the results of MIRU-VNTR, 24 loci showed different polymorphism and the HGI of different loci set (12 old loci, 15 basic loci and 24-loci set) increased accordingly. The subtle difference in HGI was originated from one locus ETR-B, which was included in the 24-locus system. The diversity of each loci and MIRU-VNTR set for non-Beijing genotype strains was higher than that of the Beijing genotype strains. Conclusion In this study, it was preliminarily confirmed the existence of high polymorphism of M. tuberculosis while the Beijing Family was the main genotype and main prevalent strain in children of Chongqing area. Spoligotyping prior to 15-locus with ETR-B combination seemed more suitable for the massive epidemiological investigation of pediatric tuberculosis patients.     

13个VNTR位点用于113株结核分支杆菌的基因分型研究

目的 应用数目可变串联重复序列（VNTR）分子分型技术，对北京地区113株肺结核临床分离菌株进行分型研究，探讨北京地区菌株DNA多态性和基因型特征。方法 采用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术对结核分支杆菌13个VNTR位点进行检测，并应用Gel-Pro analyzer 3．1软件和BioNumerics3．0软件进行结果分析。结果 113株结核分支杆菌可分为4个基因型（分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ型），其中Ⅰ型占92．0％（104/113），其他3型所占比例很小，分别为Ⅱ型占4．4％（5／113），Ⅳ和Ⅴ型均为1．8％（2／113），而标准菌株H37Rv在分型中为独立的一个基因型，即Ⅲ型。结论 北京地区的结核分支杆菌存在基因多态性，其主要流行型为Ⅰ型。     

Genotyping of the Mycobacterium tuberculosis complex using MIRUs: association with VNTR and spoligotyping for molecular epidemiology and evolutionary genetics.

The recent introduction of molecular methods has gained increased acceptance as a powerful tool for epidemiology and phylogeny of tuberculosis (TB). In this investigation, the efficiency of molecular typing using mycobacterial interspersed repetitive units (MIRUs) was assessed on a set of 116 Mycobacterium tuberculosis complex clinical isolates from 11 different geographic origins. The results obtained were compared with spoligotyping and variable number of tandem DNA repeats (VNTRs) typing data. Eighty-nine different MIRU profiles were obtained on the sample studied. Spoligotyping- or VNTR-defined clusters were split into subclusters by MIRU typing. Conversely, almost all of the clinical isolates clustered by MIRUs were shown to belong to spoligotyping-based defined clusters. The calculation of the discriminative power by the Hunter-Gaston index (HGI) for VNTR, spoligotyping and MIRU typing gave the values of, respectively, 0.959, 0.965 and 0.988, showing the high discriminative power of the MIRUs. The allelic diversity of the sample was calculated for each of the MIRU-VNTR loci; five MIRU loci (MIRU nos. 10, 23, 26, 31 and 40) were "highly discriminant", four (MIRU nos. 4, 16, 24 and 39) were "moderately discriminant", and three (MIRU nos. 2, 20 and 27) were "poorly discriminant". Among the three complementary VNTRs (exact tandem repeats ETR-A, ETR-B and ETR-C), ETR-A was the most discriminant locus. A combined numerical analysis of spoligotyping, VNTR and MIRU typing results partly corroborated a recently hypothesized evolutionary scenario for the M. tuberculosis complex. M. canettii would be the first branch to have diverged from a common M. tuberculosis complex ancestor. The East-African Indian (EAI) clade could be the first family to have diverged thereafter. A third branching separated a M. africanum-M. bovis clade, followed by a node separating Beijing versus non-Beijing M. tuberculosis. The Beijing clade was distinct from the Central Asian 1 (CAS1) family. Among non-Beijing strains, branches such as the Latin-American and Mediterranean (LAM), X and Haarlem clades diverged later. In conclusion, the results obtained show the congruence between clades defined by spoligotyping, and MIRU-VNTR, and underline the potential of these methods for M. tuberculosis phylogeny reconstruction. We also conclude that MIRU typing is a very promising method that may be used in a "two PCR-based" genotyping strategy, in conjunction to conventional epidemiological investigations.     

杭州地区结核分枝杆菌氧氟沙星耐药株的MIRU-VNTR基因分型研究

目的：探讨MIRU-VNTR技术在杭州地区结核分枝杆菌氧氟沙星耐药株基因分型中的应用。方法收集杭州市2010年4月-2012年6月各结核病定点医院分离培养的临床菌株,进行药物敏感性检测。分别采用RD105缺失基因检测法和MIRU-VNTR技术对氧氟沙星耐药株进行菌株鉴定和基因分型。结果筛选出的52株氧氟沙星耐药株中,43株（82.69%）为北京家族菌株。经12个MIRU-VNTR位点组合分析,52株氧氟沙星耐药株呈52种MIRU-VNTR基因型,总Hunter-Gaston指数（ HGI）为0.999。除MIRU40和ETR-F外,其他10个MIRU-VNTR位点对北京家族菌株和非北京家族菌株均显示较高或中等程度的分辨率。结论筛选到的10个MIRU-VNTR位点具有较高分辨率,适用于杭州地区结核分枝杆菌氧氟沙星耐药株分型。     

不同可变数目串联重复序列组合对中国流行结核分枝杆菌分辨力的评价研究

目的 在规范化的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）可变数目串联重复序列（variable number of tandem repeats,VNTR）基因分型的基础上,构建我国31个省（自治区、直辖市）VNTR数据库,每个省优化一套VNTR位点组合,为我国结核病预防控制策略的制定提供科学依据。方法 对2007－2008年全国结核病耐药性基线调查的4 116株MTB15位点VNTR（15-VNTR）基因分型。汉高指数（Hunter-Gaston Index,HGI）分析每个位点的分辨率。依据谱系流行特征,以分辨率高和稳定性强为原则,为各省设计一套VNTR优化组合（12-VNTR、10-VNTR、8-VNTR和5-VNTR）,采用HGI和成簇率进行评价。结果 完成了涵盖率为96.36%（3 966/4 116）MTB完整15-VNTR图谱。发现QUB11b、MIRU26等7个高分辨率位点;QUB26、MIRU16、Mtub21、QUB11b在部分地区遗传稳定性差。内蒙古自治区、重庆市、黑龙江省的最优组合为10-VNTR,其他各省的最佳组合为8-VNTR。结论 VNTR数据库的建立将推动全国范围MTB传染源的追踪;各省优化VNTR组合的推出有助于当地结核病疫情的监测和群体遗传学的研究。     

Differentiation of tuberculosis strains in a population with mainly Beijing-family strains

A high prevalence of tuberculosis (TB) isolates that are genetically homogenous and from the Beijing family has been reported in Russia. To map TB transmission caused by these strains, new genotyping systems are needed. Mycobacterial interspersed repetitive units (MIRUs) offer the possibility of rapid PCR-based typing with comparable discrimination to IS6110 restriction fragment length polymorphism techniques. Spoligotyping and detection of IS6110 insertion in the dnaA-dnaN region were used to identify Beijing strains in 187 Mycobacterium tuberculosis isolates from Samara, Russia. The Beijing isolates were analyzed by using 12-MIRU and 3-exact tandem repeats (ETR) loci and by an expanded set of 10 additional variable number tandem repeats loci. The expanded set of 25 MIRUs provided better discrimination than the original set of 15 (Hunter-Gaston diversity index 0.870 vs. 0.625). Loci MIRU 26, 1982, and 3232 were the most polymorphic in Beijing isolates.     

三种不同的DNA分型技术在158株结核杆菌研究中的应用

目的评价IS6110限制性片段长度多态性(RFLP)、间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)及分枝杆菌散在重复单位(MIRU)三种分型方法在结核病流行病学研究中的应用。方法对158株结核分枝杆菌临床分离株应用IS6110RFLP、Spoligotyping及MIRU三种分型方法进行鉴定。结果应用三种分型方法产生的类型数分别为118、20和105个。IS6110RFLP的分辨率大于Spoligotyping,MIRU的分辨能力与IS6110RFLP接近。在MIRU的12个区中,重复区4、10、26、40具有较高的多态性。广东地区与其他地区成簇率和北京基因型所占比例差异有统计学意义(P<0.05),广东地区成簇率和北京基因型所占比例均显著低于其他地区。结论应用IS6110RFLP、Spoligotyping及MIRU三种分型方法进行结核病流行病学研究具有重要意义且非常有效,可以发现中国不同地区菌株的不同特点。     

71株浙江省结核分枝杆菌临床分离株MLVA基因分型研究

目的初步探讨浙江省结核分枝杆菌的数目可变串联重复序列（VNTR）的分型及分布特征。方法随机选取浙江省结核分枝杆菌临床分离菌株，常规培养，收集菌体，提取基因组DNA，采用聚合酶链反应（PCR）分别对VNTR位点进行检测分析，基因分型聚类分析采用BioNumerics软件。结果对71株结核分枝杆菌临床分离株的15个VNTR位点进行检测。结果显示明显的基因多态性。经基因聚类分析，可分4个基因群（I群、Ⅱ群、Ⅲ群、Ⅳ群），58个基因型。分别为I群占8．5％，含5个基因型，Ⅱ群占18．3％，含13个基因型，Ⅲ群占70．4％，含38个基因型，Ⅳ群占2．8％，含2个基因型。结论初步证实浙江省结核分枝杆菌VNTRs基因存在明显的多态性，至少存在4个VNTR型，主要流行型为Ⅲ型。