阿司匹林通过抑制大鼠破骨细胞 RANK 表达抑制骨质吸收

目的：研究不同浓度阿司匹林对体外培养大鼠破骨细胞（Osteoclast, OC）RANK（receptor activator of nuclear factor-κB,核因子κB受体活化因子）表达的影响。方法采用RANKL和M-CSF诱导大鼠骨髓单核巨噬细胞破骨分化模型,给予不同浓度的阿司匹林（0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、1.5 mmol/L）和雌激素（雌二醇10-6 mmol/L）处理,而后进行抗酒石酸酸性磷酸酶（ The tartrate-resistant acid phosphatase ,TRAP）染色观察细胞形态特征,扫描电镜观察骨磨片破骨细胞骨吸收陷窝,RT-PCR技术检测破骨细胞表面RANK基因的表达,ELISA法检测RANK蛋白的表达。结果阿司匹林和雌激素都可以使大鼠破骨细胞成熟分化程度和骨吸收活性降低,抑制破骨细胞RANK基因和蛋白的表达,且阿司匹林的抑制作用具有剂量依赖性。结论阿司匹林对大鼠破骨细胞RANK的表达有抑制作用且呈剂量依赖性,从而抑制破骨细胞的成熟分化及骨吸收功能。     

降钙素基因相关肽对大鼠骨髓单核巨噬细胞破骨分化作用的实验研究

目的 通过体外实验研究外源性降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide,CGRP)对大鼠骨髓单核巨噬细胞 (BMMs)破骨分化能力的影响,为CGRP在抗骨质疏松治疗方面的应用提供理论依据。方法 采用差速贴壁的方法分离出SD大鼠髓腔内单核巨噬细胞,原代培养并传代,在培养体系中添加含不同浓度CGRP (实验组：10–7 mol/L、10–8 mol/L、10–9 mol/ L;对照组：无CGRP)的破骨诱导液,对前体细胞进行破骨诱导7天后进行相关实验检测,分别采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP染色）观察破骨细胞的生成能力;用RT-PCR方法检测破骨细胞系特征性基因（RANK、TRAP、NFATc1); Western-blot检测破骨特征性TRAP和RANK蛋白的表达;骨磨片甲苯胺蓝染色检测诱导的破骨细胞的骨吸收功能。结果TRAP染色显示 CGRP各浓度组镜下成熟破骨细胞的个数显著低于对照组,有统计学差异(P <0.05)并随CGRP浓度的增高成熟破骨细胞数减少,CGRP组间亦差异明显(P <0. 05);RT-PCR检测破骨特征性RANK、TRAP、NFATc1 mRNA和Westem-blot测破骨特征性TRAP、RANK蛋白的表达各CGRP组均低于对照组(P < 0. 05);骨磨片破骨细胞甲苯胺蓝染色后单倍视野下CGRP组破骨陷窝数量也明显少于对照组(P < 0. 05),且与药物组浓度与陷窝数量呈负相关性。结论 CGRP能够抑制BMMs向破骨方向的分化,为CGRP抗骨质疏松的治疗提供理论支持。     

骨水泥颗粒促进肿瘤坏死因子α诱导的破骨细胞形成及其骨吸收作用

目的:验证骨水泥颗粒对肿瘤坏死因子α(TNFα)诱导的破骨细胞形成及其生物学活性的影响。方法:体外培养外周血单核细胞,对照组加入TNFα和白细胞介素-1α(IL-1α)及巨噬细胞克隆集落刺激因子(M-CSF),实验组并分别加入含有或不含有硫酸钙的骨水泥(PMMA±BaSO4)颗粒。对培养终末细胞作组织化学染色检测破骨细胞标志物抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的表达,并以象牙磨片上虫蚀样骨吸收陷窝的形成为指标检测破骨细胞的生物学活性;并比较各实验组中TRAP阳性多核细胞(multinucleatedcells,MNCs)及虫蚀样骨吸收陷窝形成时间的早晚。结果:各组TRAP阳性MNCs的数量无明显差异;PMMA±BaSO4组象牙磨片上骨吸收陷窝的面积均较对照组大,差异具有显著性(P<0.01);并且PMMA±BaSO4组TRAP阳性的MNCs及虫蚀样骨吸收陷窝的形成均较对照组早。结论:PMMA±BaSO4颗粒能够促进TNFα诱导的破骨细胞分化提早发生并促进其骨吸收活性。     

辛伐他汀抑制甲状旁腺素相关肽诱导的破骨细胞生成和功能

目的:探讨辛伐他汀对骨髓来源的破骨细胞形成和功能的影响。方法:取Balb/C雄性小鼠双侧股骨和胫骨的骨髓,以不含血清的α-MEM培养液洗涤并收集骨髓细胞,再将细胞重新悬浮于含100 m l/L胎牛血清的α-MEM培养液中,细胞计数后,配成1.5×109/L的细胞悬液,同时加入甲状旁腺素相关肽(PTHrP)和不同剂量的辛伐他汀(10-7、10-6、10-5mol/L)于24孔培养板进行培养,并设阳性对照(只加PTHrP)和阴性对照(PTHrP和辛伐他汀都不加)组,每组均有1孔放置骨磨片1片,培养6 d后;去除上清,抗酒石酸(TRAP)染色检测培养板底部破骨细胞形成;骨磨片用甲苯胺蓝染色,电镜检测骨磨片的吸收陷窝。结果:小鼠骨髓细胞在PTHrP的诱导下获得大量的TRAP染色阳性的破骨细胞,骨磨片有吸收陷窝形成;用辛伐他汀(10-7、10-6mol/L)和PTHrP共同培养下TRAP染色阳性的破骨细胞形成数量均明显减少(P<0.01),辛伐他汀在10-5mol/L时则无TRAP染色阳性的破骨细胞形成;辛伐他汀在10-7mol/L时骨磨片有吸收陷窝的形成但少于阳性对照组(P<0.01),在10-6、10-5mol/L时骨磨片则无吸收陷窝的形成。结论:辛伐他汀对小鼠骨髓来源的破骨细胞的形成有着明显的抑制作用,并且呈剂量依赖关系。     

淫羊藿苷对破骨细胞活性的影响

目的:观察淫羊藿苷对破骨细胞骨吸收及凋亡的影响,探讨淫羊藿苷的抗骨质疏松作用机制。方法:体外分离、培养兔破骨细胞,与玻片及骨磨片共同培养,用10-7、10-6、5×10-6、10-5mol/L浓度的淫羊藿苷刺激破骨细胞,倒置相差显微镜下观察活体细胞、HE染色、TRAP染色及骨吸收陷窝甲苯胺蓝染色,鉴定破骨细胞,并进行骨吸收陷窝计数和面积测量,吖啶橙染色观察凋亡破骨细胞所占的比例。结果:与空白对照组比较,10-6、5×10-6、10-5mol/L浓度的淫羊藿苷组破骨细胞凋亡率均明显增高,骨吸收陷窝数目、面积明显减少,随浓度增加抑制作用增强,差异有显著性意义(P<0.05)。结论:淫羊藿苷可诱导破骨细胞凋亡,抑制骨吸收,并随浓度增加抑制作用增强。     

1，25-二羟基维生素D3对小鼠骨髓细胞形成破骨细胞样细胞及其骨吸收效应的影响

目的动态观察1,25-二羟基维生素D3[1,25-(OH)2D3]对NH小鼠骨髓细胞培养在体外形成破骨细胞及其骨吸收的剂量效应和作用时象.方法收集NH小鼠骨髓细胞于含10%胎牛血清的α-MEM培养基中行体外培养,设置不同的1,25-(OH)2D3浓度组和给药时间组,并于培养第3、6、9、12天观察记录抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)阳性多核巨细胞[或破骨细胞样细胞(osteroblast-like cell,OLC)]以及骨磨片上骨吸收陷窝的数目.结果高于10-9mmol/L的1,25-(OH)2D3单一刺激可于培养第6天诱导TRAP阳性OLC形成,并且可在骨磨片上观察到骨吸收陷窝;随1,25-(OH)2D3浓度的增高,OLC和骨吸收陷窝数目均随之增加;各浓度组OLC数目于培养第9天达最高值,随后则趋于减少,而骨吸收陷窝数于培养第9和第12天均有所增加;采用单一1,25-(OH)2D3浓度(10-8mmol/L),TRAP阳性OLC和骨吸收陷窝见于培养3 d后用药和全程用药组,而仅在培养前3 d用药则不能诱导OLC和骨吸收陷窝的形成.结论 1,25-(OH)2D3可在体外诱导骨髓单核细胞分化形成OLC并使其具有破骨活性,诱导作用的强弱与1,25-(OH)2D3的浓度相关,而且其作用时象可能是在培养3 d以后.     

两种不同降钙素对体外培养破骨细胞影响的实验研究

目的 观察不同浓度鳗鱼降钙素与鲑鱼降钙素对体外分离培养的破骨细胞数量和活力的影响.方法 从新生幼兔四肢长骨中机械分离出破骨细胞,分别接种于盖玻片及骨薄片上,加入两种不同种类的降钙素,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察盖玻片上破骨细胞的数量和形态,JD801图像分析软件分析骨片上骨吸收陷窝的面积.结果 两种降钙素的各个浓度组(分别是10-12 mol/L、10-10 mol/L、10-8 mol/L)均对贴壁生长的破骨细胞数量有明显抑制作用,并呈剂量相关性.骨吸收陷窝面积分析结果显示,两类降钙素均对破骨细胞吸收功能有明显抑制作用,呈剂量相关性.无论是盖玻片培养还是骨薄片培养,益钙宁和密盖息各相同浓度组间两两对照比较差异均无显著性 (P>0.05).结论 两种不同种类降钙素对体外培养的破骨细胞数量和骨吸收活性的抑制能力相仿.     

唑来膦酸钠在抑制钛颗粒诱导骨溶解中作用的体外实验研究

目的：研究唑来膦酸钠（ ZOL）对钛颗粒诱导的骨溶解的影响。方法分离6～8周C57BL/6J小鼠长骨中的前体破骨细胞（ OCP）并分为6组,A组：OCP＋细胞培养液,B组：OCP＋巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）＋NF-κB 受体活化因子配体（RANKL）＋细胞培养液,C组：OCP＋钛颗粒＋细胞培养液,D组：OCP＋上清液（钛颗粒刺激巨噬细胞24 h后上清液）＋细胞培养液,E组：OCP＋M-CSF＋RANKL＋ZOL＋细胞培养液,F组：OCP＋上清液＋ZOL＋细胞培养液。每组细胞分别接种在玻璃盖玻片、皮质骨磨片和含骨检测表面的96孔板上,10 d后检测玻璃盖玻片上细胞抗酒石酸磷酸酶（ TRAP）的表达及皮质骨磨片上骨吸收陷窝的形成,并以骨检测表面的骨吸收面积为指标比较各组破骨细胞的骨吸收活性。结果 B组、D组、E组和F组的OCP均能分化为能被TRAP染色成阳性的破骨细胞并形成骨吸收陷窝,其余组均未发现TRAP染色阳性的破骨细胞和骨陷窝。加入ZOL的F组骨吸收面积（5.54％±1.25％）较D组（10.34％±1.69％）明显减少,差异具有统计学意义（t＝5.61,P＜0.01）。结论在体外实验中钛颗粒并不能直接刺激前体破骨细胞向破骨细胞转化;唑来膦酸钠可以抑制钛颗粒诱导的骨溶解作用。     

重组人骨保护素与重组核因子κb活化因子受体蛋白对破骨前体细胞分化的影响

目的:对比重组人骨保护素(rhOPG-Fc)与重组核因子κb活化因子受体蛋白(rhRANK)对破骨前体细胞分化的影响.方法:采用成骨细胞与破骨前体细胞RAW264.7混合培养,在地塞米松、1,25 (OH) 2VitD3诱导下生成破骨细胞的方法.研究分3组:rhRANK组:10-5 g/L;rhOPG-Fc组:10-5 g/L;空白对照组.作用9d后观察破骨细胞数目和形态,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色阳性细胞个数,骨磨片吸收陷窝计数.结果:在空白对照组,小鼠成骨细胞与破骨前体细胞RAW264.7混合培养6d后,开始出现多核细胞,9d时可见大量成熟多核细胞,经TRAP染色证实为成熟破骨细胞,而rhRANK组及rhOPG-Fc组TRAP染色阳性多核细胞数较对照组均减少,特别是rhRANK组减少更明显.骨片吸收陷窝计数显示rhRANK组及rhOPG-Fc组较对照组也明显减少,而相对来说,rhRANK组较rhOPG-Fc组更少.结论:rhOPG-Fc与rhRANK均可以有效抑制破骨前体细胞分化成为成熟破骨细胞,且rhRANK较rhOPG-Fc抑制效果更明显.     

阿伦膦酸钠对骨髓生成破骨细胞及骨吸收作用的影响

[目的]研究阿伦膦酸钠对体外培养的小鼠骨髓生成破骨细胞及其骨吸收作用的影响。[方法]收集小鼠骨髓细胞于含有10^-8mol／L的1，25二羟基维生素D3[1，25-（OH）2D3]的α-MEM完全培养基中体外培养，设置不同浓度的阿伦膦酸钠给药，并于培养的第6、9、12d观察记录抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acidphosphatase，TRAP）阳性多核巨细胞[破骨样细胞（osteoclast-like cell，OLC）]生成数，反映破骨细胞生成情况。记数培养12d骨磨片上骨吸收陷窝数及吸收面积，反映骨吸收情况。[结果]随着阿伦膦酸钠浓度的增高，TRAP阳性的细胞数减少，骨吸收陷窝数及面积均减少。[结论]阿伦膦酸钠可抑制骨髓细胞体外培养中破骨样细胞的形成，体外可抑制破骨细胞骨吸收作用。