星状病毒70mer探针寡核苷酸芯片制备及杂交条件的优化

目的探讨有利于制备多种病毒长探针平行检测芯片的最佳制备及杂交条件。方法通过引物直接标记方法,对70mer探针寡核苷酸芯片的点样浓度、点样后固定方案、杂交温度、杂交时间进行优化。结果70mer寡核苷酸探针点样浓度在10μmol／L时就可获得较高的的荧光强度,探针点样干燥后在3600mJ条件下紫外交联固定效果最好,在65℃条件下杂交8h能获得最优杂交结果,所用杂交液是5×SSC（0．5％SDS、50％甲酰胺、1％鲑鱼精DNA）。结论本实验优化了70mer探针寡核苷酸芯片制备及杂交条件;此为进一步研制多种海洋环境人致病性病毒检测芯片奠定了基础。     

性传播疾病

几种性传播疾病病原体检测芯片的制备——石岗等(北京军事医学科学院放射医学研究所100850)；《军事医学科学院院刊》，2004，28(5)：405-409[目的：为了同时多样本检测和鉴别淋病奈瑟球菌、沙眼衣原体和解脲脲支原体3种重要的性传播疾病病原体，制备了寡核苷酸检测芯片。方法：针对3种病原体和荧光素酶基因设计特异的引物和寡核苷酸探针，采用硫代和氨基双功能探针修饰技术制备寡核苷酸芯片，     

同时进行HBV、HCV检测60-mer长链寡核苷酸芯片的研制

基因芯片主要有cDNA芯片和寡核苷酸(Oligo)芯片两种。我们已经对cDNA芯片用于病毒性肝炎联合诊断进行了研究[1-3],而对于Oligo芯片,其探针的制备更为简化,直接通过分子生物学软件设计好探针序列后,人工合成相应的Oligo探针,调整浓度后,将其打印并固定在芯片上即可。本文研制乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)联合检测芯片,探讨其应用于临床检测的可能性。材料与方法一、实验材料HBV全长质粒p3.8Ⅱ由基因工程研究所保存;HCV全长质粒pCV-J4L6S[4]由美国国立卫生研究院(NIH)的Jens Bukh博士馈赠;HBV、HCV阳性血清由广州军区…     

莪术油对HSC-T6细胞基因表达的影响

目的:研究莪术油对HSC-T6细胞基因表达的影响.方法:从基因库中查询50种肝纤维化相关基因的mRNA序列,用寡核苷酸探针设计软件设计探针,在PE8909DNA合成仪上合成寡核苷酸,用OGR-04点样仪及醛基化玻片制备成基因芯片.以莪术油不同浓度含药培养液培养HSC-T6细胞.根据细胞毒性实验,确定细胞存活率在50%以上的药物浓度作为实验所用浓度,每组设空白对照,分别按1小时、6小时、12小时、24小时4个时间段收集细胞,按操作步骤提取细胞总RNA,经反转录荧光标记,杂交和洗涤,用Genepix 4000B扫描仪扫描芯片,ImaGene 4.2软件进行数据分析和归一化处理,使用看家基因和阳性对照对Cy3和Cy5扫描结果进行校正.结果:莪术油78.125μg/ml作用HSC-T6细胞24小时,可使基因TIMP-2、IL-6表达分别下调2.3、2.2倍.结论:从分子水平揭示了莪术有效成分莪术油的抗肝纤维化机制.     

寡核苷酸芯片技术在甲型流感及登革病毒检测分型中的初步应用

目的 建立寡核苷酸芯片检测技术,对甲型流感病毒及登革病毒进行早期检测及分型.方法 根据Genebank中病毒基因组序列的保守区域,设计病毒的特异性检测探针,制备病毒检测芯片;利用限制性显示技术标记样品中的病毒靶序列,将标记产物与芯片杂交、清洗、扫描及结果分析.结果 该方法可以正确检测到细胞培养所获得的甲型(H1N1,H3N2)流感病毒和登革四型病毒.结论 寡核苷酸芯片技术可应用于多种病毒及其亚型的早期检测.     

莪术醇对肝星状细胞-T6细胞基因表达的影响

[目的]研究莪术醇对肝星状细胞(HSC)-T6细胞基因表达的影响.[方法]从基因库中查询50种肝纤维化相关基因的mRNA序列,用寡核苷酸探针设计软件设计探针,在PE8909DNA合成仪上合成寡核苷酸,用OGR-04点样仪及醛基化玻片制备成基因芯片.以莪术醇不同浓度含药培养液培养HSC-T6细胞,根据细胞毒性实验,确定细胞存活率在50%以上的药物浓度作为实验所用浓度,每组设空白对照,分别按1、6、12、24 h 4个时间段收集细胞.按操作步骤提取细胞总RNA,经反转录荧光标记,杂交和洗涤,用Genepix 4000B扫描仪扫描芯片,ImaGene 4.2软件进行数据分析和归一化处理,使用看家基因和阳性对照对Cy3和Cy5扫描结果进行校正.[结果]莪术醇1.562 5 μg/ml作用HSC-T6细胞12 h,可使基因转化生长因子β1、细胞色素P450a表达下调2.3、2.1倍.[结论]从分子水平揭示了莪术有效成分莪术醇的抗肝纤维化机制.     

寡核苷酸芯片技术检测5种临床肠道病原菌的研究

背景：寡核苷酸芯片是一种检测病原菌的新技术，具有高通量、特异性等特点。目的：采用寡核苷酸芯片技术建立对5种临床常见肠道病原菌（霍乱弧菌、空肠弯曲杆菌、志贺菌、耶尔森菌、单核细胞增生利斯特菌）进行快速、准确鉴定和检测的方法。方法：选取16SrDNA作为检测靶基因，设计通用引物和寡核苷酸探针。病原菌基因组DNA通过16SrDNA通用引物行聚合酶链反应（PCR），扩增后与芯片上的探针杂交。结果：霍乱弧菌、空肠弯曲杆菌、志贺菌、耶尔森菌、单核细胞增生利斯特菌的杂交信号均很强，其他细菌无杂交信号。寡核苷酸芯片的检测时间约5h，其敏感性可达10^3CFU／ml。寡核苷酸芯片对23例临床腹泻样本的检测结果与传统细菌学培养结果完全一致。结论：寡核苷酸芯片的特异性、稳定性、重复性均较好，是检测临床肠道病原菌准确、可靠、实用性强的方法。     

基因芯片技术及其在结核分支杆菌研究中的应用

一、基因芯片技术概述基因芯片 (又称ＤＮＡ芯片 )始创于 90年代初 ,首先由美国Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ公司的Ｆｏｄｏｒ博士提出并开始基因芯片技术的研究。它是目前分子生物学最前沿的方法 ,是物理学、微电子学与生命科学交叉综合的高新技术 ,是近年来发展起来的进行大规模遗传多态性检测的新方法[1 ] 。基因芯片以其基片的不同分为无机基片和有机合成物基片 ,前者包括半导体硅片和玻璃片 ,其上的探针主要以原位聚合的方法合成 ;而后者的探针是预先合成后通过特殊的微量点样装置或仪器滴加到基片上去[2 ] 。基因芯片的基本原理是将多种探针…     

先天性心脏病有关的风疹病毒Oligo探针与功能基因芯片的设计

目的风疹病毒（Rubella virus,RV）是先天性风疹综合征（先天性心脏病、先天性白内障和耳聋的三联综合征）的致病因素,本研究针对RV全基因组序列的生物信息学特点,设计RV 60-m er长链寡核苷酸探针,探讨寡核苷酸探针和功能基因芯片的设计方法。方法利用生物信息学软件Array Designer 2.0针对RV全基因组设计Tm值相近、长度均一的60-m er探针,利用其BLAST功能将所得探针在GenBank数据库进行序列比对分析,筛选得到RV特异性O ligo探针并设计成功能基因芯片。结果获得11条60-m er O ligo探针,用于打印成DNA芯片,拟用于RV检测与病毒基因表达功能分析。结论利用Array Designer 2.0软件设计芯片探针比常见其他方法更有效,尤其适合于病毒检测和病毒基因功能分析复合型芯片的设计。     

肝炎病毒诊断分型寡核苷酸芯片的制备与应用

目的研制联合诊断HBV、HDV、HCV及HCV分型的寡核苷酸（Oligo）芯片，并进行系列优化及临床应用性研究。方法从GenBank数据库获取HBV全长DNA序列，HDV及HCV4个基因型全长cDNA序列，根据BLAST分析结果获得HBV、HDV种属保守序列及HCV各型特异性序列，以作为设计Oligo探针的备选序列。用Array designer 3．0分别对BLAST检索所得的HBV、HDV种属保守序列和HCV型特异性序列逐一进行分析，设计长度均一的60mer Oligo探针。从HBV、HDV、HCV种属保守序列和HCV型特异性序列中分别挑选出16、8、68条60 mer Oligo探针。Oligo探针合成和纯化后，用芯片打印仪固定在玻片上。为便于研究，先后制备了2种芯片，包括HBV、HDV诊断芯片、HCV分型芯片。采用限制性显示PCR技术进行样品荧光标记后与芯片杂交，并根据杂交结果筛除了有非特异杂交和信噪比低于4．0的探针，选取高特异的探针制备了HBV、HDV、HCV联合诊断分型芯片。结果从杂交效果来看，研制的Oligo芯片特异性较高，可有效用于HBV、HDV、HCV的联合诊断及HCV的分型。为了适应临床诊断的要求，对芯片进行了实验条件摸索和一些优化，均取得较好的效果。结论制备的肝炎病毒诊断分型芯片检测敏感性、特异性均佳，具有较为广阔的应用前景，为下一阶段进行中试规模的临床血清样品检测做好了准备。     

基因芯片技术检测恙虫病东方体DNA的方法建立

目的　研制用于东方体检测的基因芯片 ,建立快速、灵敏、特异的恙虫病诊断方法。方法　根据东方体 5 6kD外膜蛋白基因序列 ,设计群特异性引物及探针 ,制备寡核苷酸芯片。用Cy3标记的引物 ,利用不对称PCR技术扩增DNA片段 ,将扩增的DNA片段与芯片上的探针杂交 ,用荧光扫描仪检测并分析信号。结果　建立的基因芯片能够检测恙虫病东方体标准株DNA的特异性荧光信号。具有特异、灵敏、快速的优点。结论　成功制备的基因芯片有望应用于恙虫病东方体多种样本的检测 ,为恙虫病提供最为理想的诊断方法。     

高灵敏度薄膜生物传感器基因芯片系统的研制

目的: 在传统基因芯片技术基础上, 应用生物传感器技术, 研制一种能将基因芯片信号原位放大后达肉眼判读灵敏度, 无需专用基因芯片检测仪器就可使用, 易于在基层医疗单位推广的薄膜生物传感器基因芯片诊断系统.方法:在薄膜生物传感器基片基础上, 经过表面化学处理, 使特定的基因捕获探针在传感器表面固定, 形成特定检测目的生物传感器基因芯片. 并以乙肝病毒YMDD区的特异序列设计为例, 通过特定的YMDD区的捕获探针, 以矩阵的形式点样于传感器芯片表面来实现本系统. 同时, 纳米金标记的检测探针取代了传统芯片中的荧光标记探针. 扩增后的目的PCR片段与捕获探针、生物素标记探针、链亲蛋白纳米金探针进行反应, 最后得到探针-生物素-链亲蛋白-纳米金复合物, 并在芯片表面经生物传感器芯片将信号原位放大, 获得肉眼观的芯片信号并进行分析, 完成芯片诊断. 以乙型肝炎病毒YMDD突变为例, 观察该芯片系统对临床诊断标本诊断的可靠性.结果: 基因芯片的检测信号经生物传感器原位放大后能肉眼判读或借助普通数码照像机或计算机扫描, 根据信号出现的特定位置即可确定突变的类型. 且该生物传感器基因芯片系统信噪比高, 在人工合成的寡核苷酸及临床血清的检测中, 均可实现生物芯片阴阳性信号完全的有或无的判读; 临床血清标本检测证实, 使用该传感器芯片系统对前期经过测序确定为YMDD突变的23份临床血清结果与测序结果完全一致. 结论:薄膜生物传感器基因芯片集纳米材料、生物传感器技术及原位放大技术为一体, 实现了信号的肉眼判读, 具有通用性高, 准确可靠, 无需大型设备, 易于在基层医疗单位推广使用.     

猪链球菌基因芯片检测方法的研究

目的建立猪链球菌基因芯片检测方法,实现对猪链球菌种、致病血清型及毒力相关基因的同步检测和鉴定。方法根据GenBank中猪链球菌的相关序列,设计并合成探针,采用点样法制备芯片;检测样本基因组DNA标记后与基因芯片杂交,激光扫描检测信号。结果检测结果显示,针对猪链球菌种、主要致病血清型及主要毒力相关基因设计的寡核苷酸探针可特异地识别对应靶基因,重复性好;而针对不同菌株设计的株特异性探针未获得预期检测效果。结论初步建立猪链球菌基因芯片检测体系,敏感性与特异性高,对于高通量鉴定猪链球菌菌种及其毒力有重要价值。     

肝癌发生过程中的差异基因表达

目的:应用寡核苷酸芯片研究正常肝脏、慢性乙型肝炎、肝硬化及肝癌的基因表达谱,筛选肝癌相关基因.方法:分别对正常肝组织及肝炎、肝硬化和肝癌组织进行总RNA抽提并纯化,反转录得到cDNA,生物素标记cRNA探针,分别与含有19378个已知基因的寡核苷酸芯片进行杂交,Gene Scanner 3000激光系统扫描,GenePix Pro3.0分析软件读取处理杂交信号.结果:在慢性乙型肝炎、肝硬化及肝癌组织中,筛选出共同差异表达基因81个,其中持续上调表达基因53个,持续下调表达基因数28个.结论:寡核苷酸基因表达谱芯片能够快速筛选出肝癌相关基因,有多种基因共同参与肝癌发生的整个过程.     

HCMV 60-mer寡核苷酸诊断芯片的探针与微阵列设计

目的设计用于人巨细胞病毒（HCMV）诊断的60-mer长链寡核苷酸探针及微阵列。方法利用生物学软件Array Designer2．0，针对HCMV特异且保守的序列设计60-mer探针，利用BLAST功能将设计探针在GenBank数据库进行序列比对分析，筛选得到HCMV特异性Oligo探针，根据各探针的属性特点设计芯片阵列。结果设计得到24条解链温度（Tm值）相近、长度均一的60-mer Oligo探针及其芯片阵列，拟打印成DNA芯片用于HCMV检测。结论利用病原体的生物信息学资料及Array Designer2．0生物软件．能有效的进行病毒检测芯片的设计。     

恶性疟原虫膜蛋白基因的过度多态性

作者用高密度寡核苷酸探针芯片技术检测恶性疟原虫第 2染色体全长基因组中的单核苷酸多态性 ( SNPs) ,以荷兰分离株 3D7为参照 ,并依照其基因组 DNA设计了 4 1 6 7种长为 2 5nt的寡核苷酸探针 ,用于检测洪都拉斯、东南亚、塞拉利昂和巴西 4个地区的不同分离株 ,在 4种虫株中检测到 SNPs数目分别为 32 4 ,32 0 ,1 0 7和 2 30 ,至少在一个虫株中有 585种探针显示差异。研究发现变异基因的功能分布不是随机的。变异最多的是膜蛋白基因 ,该区探针占全部探针的 2 2 %,占可变探针的 6 9%。这些膜蛋白中有几种性能优良的疫苗靶位 ,包括传播阻断…     

拉米夫定治疗慢性乙型肝炎过程中HBV YMDD变异及基因芯片检测

建立乙型肝炎病毒变异基因诊断芯片对拉米夫定治疗慢性乙型肝炎过程中出现的肝炎病毒P基因区YMDD变异进行快速准确的检测方法。设计特异性寡核苷酸探针数组 ,特殊处理芯片载体。用点样法制备乙型肝炎病毒变异基因诊断芯片。在本院住院治疗病人中选择 3 0例服用拉米夫定后 ,可能出现YMDD变异的病人进行基因芯片杂交检测分析 ;同时用PCR直接测序法对上述 3 0例病人血清标本进行双盲HBVDNA聚合酶活性区域测序对照。 3 0例服药后HBVDNA反跳病人中 ,基因芯片测得HBVYMDD变异 2 1例 ,其中YVDD变异 11例。YIDD变异 10例。HBVDNAPCR直接序列测定结果与基因芯片检测结果完全一致。乙型肝炎病毒变异基因诊断芯片可以同时检测YVDD、YIDD变异 ,同PCR直接测序法比较 ,准确率达 10 0 % ,无假阳性     

Barrett食管基因差异表达谱初步探讨

病变组织差异表达基因的分析有助于寻找与疾病发生、发展和临床治疗有关的关键分子。目的：应用寡核苷酸芯片对Barrett食管与正常食管黏膜组织的差异表达基因进行高通量分析．以期筛选与Barrett食管发生、发展相关的分子标记物。方法：取6例Barrett食管患者病变食管黏膜和相应正常食管黏膜组织。Trizol一步法抽提总RNA．纯化后合成cRNA探针；探针荧光标记和纯化后，将两种组织探针分别与Agilent全基因组寡核苷酸芯片（含30968个基因组探针）进行杂交；获取芯片扫描图谱，以特征提取软件行定量分析、处理。结果：Barrett食管与正常食管黏膜组织的2倍差异表达（Ratio值≥2或≤0．5）基因中，上调基因142个，下调基因284个，涉及细胞周期相关基因、信号转导相关基因、黏蛋白相关基因、癌基因和抑癌基因、骨形态蛋白基因、凋亡抑制基因、bcl-2家族相关基因等。结论：高通量的基因芯片技术可筛选出大量Barrett食管相关基因，对这些相关基因的功能进行验证将有助于找到Barrett食管发生、发展的关键基因或通路。     

鼠疫诊断芯片的探针制备

目的 探索制备鼠疫诊断芯片特异性探针的新方法。方法 直接采用限制性核酸内切酶Sau3A Ⅰ消化鼠疫耶尔森菌3个致病性质粒，克隆在T载体上，再经巢式PCR扩增制备成打印芯片的探针。结果 该法收集到250条探针用于打印芯片。分别与鼠疫耶尔森菌，同属的假结核耶尔森菌和小肠结肠炎耶尔森菌杂交，可筛选出杂交信号强阳性的特异点阵。结论 该法简便可行，适于制备鼠疫诊断芯片的探针。     

麻疹病毒属病毒检测基因芯片的建立

目的建立主要麻疹病毒属病毒(麻疹病毒、犬瘟热病毒、小反刍兽疫病毒、牛瘟病毒、海豹瘟热病毒、海豚瘟热病毒等)种特异性检测基因芯片。方法应用生物信息学方法从GenBank获得麻疹病毒属病毒的全部基因组序列,以Primer Premier5.0软件设计针对上述病毒的寡核苷酸探针并制备基因芯片,以上述6种病毒及犬副流感病毒、VERO细胞及健康犬组织等验证寡核苷酸芯片的特异性,以细胞毒和临床病料检测基因芯片的灵敏度、特异性和重复性,芯片制备后低温放置3、6、12个月后检验其检测稳定性。结果基因芯片检测到麻疹病毒属病毒种特异性信号,无杂信号及交叉信号,芯片方法的灵敏度为10-2TCID50,是PCR的100倍,病料检测与PCR相符率为100%。结论初步建立了麻疹病毒属病毒种特异性基因芯片,该方法灵敏度高,特异性强,适用于麻疹病毒属的流行病学调查和种特异性鉴定。