HBV P基因YMDD变异的检测及临床应用的研究

目的　采用错配PCR扩增方法进行HBVP基因YMDD变异的检测 ,对其临床意义进行初步的研究。方法　应用分子克隆方法 ,构建YMDD、YVDD、YIDD变异的阳性质粒 ,并进行敏感性及特异性试验。对 44例经拉米夫定治疗 1年HBVDNA持续阳性的乙型肝炎患者检测YMDD变异情况。结果　经PCR方法、酶切鉴定及直接测序鉴定出YMDD、YVDD、YIDD质粒构建成功 ,且该方法具有较好的敏感性和特异性。 44例拉米夫定治疗 1年HBVDNA持续阳性的乙型肝炎患者存在YMDD变异 ,半年出现变异 5例 ,变异率为 11 . 3 6%:1年出现变异 7例 ,变异率为 15 . 91%。结论　本检测方法简便、实用 ,抗病毒药物压力是导致HBVYMDD变异的重要因素。     

基因芯片和聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法检测拉米夫定耐药的慢性乙型肝炎患者YMDD变异

目的对基因芯片和聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)两种方法检测YMDD变异进行比较。方法取40例临床考虑拉米夫定耐药的患者血清，分别用基因芯片和PCR-RFLP法检测YMDD基序变异情况。随机抽取8份血清标本进行测序验证两种方法的准确性。结果40例患者血清标本中，用基因芯片法检测出YMDD变异阳性标本27例，其中，YIDD变异4例，YVDD变异16例，YVDD／YMDD共存12例；YIDD与YVDD混合变异7例。用PCR-RFLP法检测出变异阳性标本21例。在变异株中，YIDD变异和YVDD变异各9例，YIDD／YVDD混合变异3例，明显低于基因芯片的检出率。结论1、用基因芯片能快速灵敏地检测YMDD变异情况，并能检测到患者体内变异株与野生株混合存在形式；2、基因芯片能同时检测两种YMDD变异株和YMDD野生株，优于PCR-RFLP法，适用于临床检测乙型肝炎病毒YMDD变异。     

乙型肝炎病毒P基因变异的检测及其意义

目的采用错配PCR扩增方法进行乙型肝炎病毒(HBV)P基因YMDD变异的检测,并对其临床意义进行初步研究.方法应用分子克隆方法,构建YMDD、YVDD、YIDD变异的阳性质粒,并进行敏感性及特异性试验.对44例经拉米夫定治疗1年、HBVDNA持续阳性的乙型肝炎患者检测YMDD变异情况.结果经PCR方法、酶切鉴定及直接测序鉴定出YMDD、YVDD和YIDD质粒构建成功,且该方法具有较好的敏感性和特异性.44例拉米夫定治疗1年、HBVDNA持续阳性的乙型肝炎患者存在YMDD变异,半年出现变异5例,变异率为11.36%;1年出现变异7例,变异率为15.91%.结论本检测方法简便、实用,抗病毒药物压力是导致HBVYMDD变异的重要因素.     

拉米夫定治疗慢性乙型肝炎出现YMDD变异患者的临床意义

目的探讨拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患者YMDD变异株YVDD和/或YIDD的变异情况。方法用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析方法,检测65例慢性乙型肝炎患者血清YMDD变异情况。结果65例血清标本中,检出YMDD变异31例,其中YVDD变异22例(33.8%),YIDD变异8例(12.3%),YVDD与YIDD混合变异1例(1.5%)。31例发生变异者中服用拉米夫定满一年发生YVDD变异4例,YIDD变异2例;服用拉米夫定满二年发生YVDD变异8例,YIDD变异3例,YVDD与YIDD变异1例;服用拉米夫定满三年发生YVDD变异10例,YIDD变异3例。结论YMDD变异与病情变化无关,随着拉米夫定治疗时间延长,发生变异的机会增大。     

拉米夫定治疗中乙型肝炎病毒YMDD野毒株和变异株的变化

目的 观察慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者应用拉米夫定治疗前后,YMDD野毒株及变异株的动态变化,并分析其临床意义。方法 取5例CHB患者治疗前与治疗48周的10份血清标本,先用PCR法扩增包括YMDD基序的乙型肝炎病毒(HBV)部分核苷酸序列,然后进行DNA序列测定,同时分别进行克隆,每份标本随机挑选20～24株单克隆,用实时荧光PCR法检测YMDD野毒株及其变异株。结果 5例CHB患者治疗前PCR产物直接测序结果未检出YMDD变异,治疗48周时有4例检出YMDD变异,但对每株克隆的分别检测显示：治疗前YMDD变异株(YIDD／YvDD)所占比率分别为0％、9．5％、0％、4．5％、5．6％;治疗48周时所占比率分别为100％、100％、65％、100％、0％。其中1例患者治疗前检出YIDD变异株,而治疗48周时YVDD变异株则变成优势株。治疗52周时,4例YMDD变异患者中2例HBVDNA和血清丙氨酸转氨酶(ALT)突破,1例患者ALT突破,但HBVDNA为阴性。结论 YMDD变异株在拉米夫定治疗前的血清中已存在,在服用拉米夫定后,由于选择性抑制了野毒株,使YMDD变异株由弱势株变成优势株,部分患者可导致拉米夫定临床耐药。YVDD变异株可能比YIDD变异株的复制能力强。     

基因芯片检测乙型肝炎病毒YMDD变异的临床应用

目的　评估基因芯片法检测乙型肝炎病毒 (HBV)YMDD变异的临床应用。方法　用基因芯片法检测 60份乙型肝炎病人的血清 ,其中 2 0份同时用基因测序法和快速PCR法检测 ,用Ridit方法分析检测结果。结果　拉米夫定治疗 5 2周的 2 0个标本中 ,用基因芯片法检测出 14份有YMDD变异株 ,与快速PCR法检出结果一致 ,测序法仅检出9例有变异株。结论　基因芯片法检测YMDD变异是临床有用的方法     

拉米夫定耐药患者乙型肝炎病毒的基因突变

目的了解在拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的过程中出现拉米夫定耐药患者的HBV YMDD突变模式及其特性。方法回顾性分析444例在拉米夫定治疗过程中出现耐药突变的慢性乙型肝炎病例，用基因芯片法检测YMDD突变类型，并分析不同突变类型的特点。结果444例拉米夫定耐药患者的YMDD突变类型分别为：YVDD突变185例，其中合并L180M突变94例；YIDD突变216例．其中合并L180M突变34例；YVDD突变＋YIDD突变43例，其中合并L180M突变18例。相对于YVDD突变株，YIDD突变株检出率高，较易出现于相对年长患者，发生突变时间晚，病毒复制水平高，肝炎复发程度相对较重。合并L180M突变较单纯YMDD突变发生早，病毒复制水平高。结论拉米夫定耐药的YMDD突变模式主要为点突变和联合突变两种，点突变以YIDD突变为主，联合突变以YVDD突变合并L180M突变为主，YMDD突变模式不同者的临床表现不同，YMDD突变模式可能与预后及治疗的应答相关。     

乙型肝炎病毒YMDD变异后果及原因分析

目的分析乙型肝炎病毒YMDD变异的原因及后果,探讨YMDD变异后应采取的措施,为变异后临床治疗提供依据。方法对乙型肝炎病毒YMDD变异的79例患者变异前后的临床及实验室资料进行回顾性分析。结果在拉米夫定抗病毒治疗者YMDD变异中,YVDD较YIDD变异多见;无拉米夫定治疗史者与有拉米夫定治疗史者YMDD变异后拉米夫定抗病毒治疗结果有显著性差异;YMDD变异前后肝功能损害有显著性差异;YVDD变异和YIDD变异比较,肝功能损害无显著性差异。结论未使用拉米夫定抗病毒者出现YMDD变异后,拉米夫定治疗有效;拉米夫定抗病毒治疗者,YMDD变异后患者肝功能损害明显;肝功能损害与YMDD变异的亚型无关。     

拉米夫定抗乙型肝炎病毒感染中YMDD变异类型及时间研究

目的 研究拉米夫定抗乙型肝炎病毒(HBV)感染中P基因发生YMDD变异的类型和出现时间。方法 取拉米夫定治疗过程中HBV DNA由阴性再次转为阳性33例患者及HBV DNA始终保持阳性达一年或一年以上2例患者的血清,经PCR扩增HBV的P基因,对扩增产物进行测序及用3个限制性内切酶分析HBVP基因的YMDD变异。 结果 14例出现YMDD变异,其中6例YVDD变异,4例YIDD变异,3例YI/VDD混合变异,1例YI/MDD变异。变异出现时间平均为(11.07±3.65)个月,最短5个月,最长7个月。其中YIDD为(10.00±1.41)个月,YVDD为(11.67±4.41)个月,YI/VDD为(13.33±3.31)个月,三种变异类型的出现时间差异无显著性(F=0.543,P>0.05)。3例YMDD变异后拉米夫定加量至200mg/d,未能消除变异病毒。 结论 拉米夫定抗HBV感染后变异有多种形式,包括YIDD、YVDD、YI/VDD、YI/MDD。变异发生时间一般在治疗后(11.07±3.65)个月。变异类型与用药时间无关。     

拉米夫定耐药突变相关慢性重型乙型肝炎27例分析

目的 研究在拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的过程中出现拉米夫定耐药突变相关的慢性重型乙型肝炎的临床特点.方法 回顾性分析27例在拉米夫定治疗过程中出现耐药突变的慢性重型乙型肝炎病例,分析其临床特征,用基因芯片法或基因测序法检测YMDD突变类型,对8例施行肝移植术后的离体肝组织分析其病理特点.采用χ2检验进行统计学分析.结果 27例拉米夫定耐药患者的YMDD突变类型分别为:YVDD突变5例,YVDD突变+L180M突变2例,YIDD突变13例,YIDD+L180M突变4例,YVDD突变+YIDD突变1例,YVDD突变+Y1DD突变+L180M突变2例,单独L180M突变未检出.根据治疗前是否存在肝硬化,分为肝硬化组和非肝硬化组.与肝硬化组相比,非肝硬化组慢性重型乙型肝炎的发生率低,预后好,年龄小,HBeAg阳性率高.8例离体肝组织病理分析显示两种主要病理类型,一种主要表现为活动性肝硬化,另一种为大块或亚大块坏死,肝脏显著萎缩.结论 肝硬化为拉米夫定耐药突变相关的慢性重型乙型肝炎的高危因素.拉米夫定耐药突变相关的慢性重型乙型肝炎可能存在两种发病机制.     

慢性乙型肝炎患者拉米夫定治疗24周时YMDD变异对疗效的影响

目的 使用基因芯片方法检测乙型肝炎病毒(HBV)YMDD变异的发生情况,研究YMDD变异发生与肝功能损伤和HBV复制水平指标之间的关系。方法 120例以常规剂量(100mg/d)口服拉米夫定的慢性乙型肝炎患者,治疗前和治疗第24周抽取血清检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、HBV DNA(定量)水平,对24周HBV DNA阳性的17例患者血清样本,以基因芯片方法检测其治疗前和治疗24周时血清中YMDD变异是否存在,并分析该变异发生和ALT、HBV DNA的关系。结果 (1)120例入选患者治疗24周时有17例患者HBV DNA仍为阳性,除外治疗前已存在的1例感染变异病毒,基因芯片共检出7例变异,变异率为5.8％。其中纯变异2例,YIDD变异1例,YVDD变异1例,混合变异5例,其中YMDD/YVDD变异3例,YVDD/YMDD变异2例。(2)变异组在治疗前和治疗24周时ALT定量水平与非变异组相比,差异无显著性,P>0.05。(3)变异组在治疗前和治疗24周时HBV DNA定量水平与非变异组相比,差异无显著性,P>0.05。结论 在拉米夫定治疗过程中,YMDD基因变异发生对肝脏炎症活动度和病毒复制的抑制作用无显著影响。     

YMDD motif in hepatitis B virus DNA polymerase influences on replication and lamivudine resistance: A study by in vitro full-length viral DNA transfection

Recently, lamivudine used to treat patients with hepatitis B virus (HBV) infection was revealed to have potent antiviral activity. However, HBV resistance to lamivudine has been reported and shown to have amino acid substitutions in the methionine residue of the conserved tyrosine (Y), methionine (M), aspartate (D), aspartate (D) motif of RNA-dependent DNA polymerase. To explore the consequences of substitutions in this motif (YMDD), we made 7 variants by substituting the methionine of the YMDD motif with isoleucine (I), valine (V), alanine (A), leucine (L), lysine (K), arginine (R), and threonine (T). Replication ability of these variants was evaluated by transfection into human hepatoma cells. Sensitivity to lamivudine was tested for replication-competent variants. Four variants with hydrophobic substitutions (I, V, A, and L) remained replication-competent, whereas 3 others with hydrophilic substitutions (K, R, and T) exhibited impaired replication. Of the 4 replication-competent variants, 2 (I and V) were resistant, and 2 (A and L) were sensitive to lamivudine. Because the polymerase and the surface gene overlap, the introduction of these mutations affected the secretion of hepatitis B surface antigen (HBsAg), namely 4 variants (I, V, L, and R) secreted HBsAg, whereas 3 variants (A, K, and T) did not. Our study elucidated that only one amino acid substitution in the YMDD motif was sufficient to cause lamivudine resistance in vitro. As a result of replication competence and lamivudine sensitivity, only viruses having YIDD or YVDD sequences may appear during treatment with lamivudine. This in vitro system could be used to study HBV mutations, replication competence, and their susceptibility to antivirals.     

拉米夫定耐药突变相关慢性重型乙型肝炎27例分析

目的 研究在拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的过程中出现拉米夫定耐药突变相关的慢性重型乙型肝炎的临床特点.方法 回顾性分析27例在拉米夫定治疗过程中出现耐药突变的慢性重型乙型肝炎病例,分析其临床特征,用基因芯片法或基因测序法检测YMDD突变类型,对8例施行肝移植术后的离体肝组织分析其病理特点.采用χ2检验进行统计学分析.结果 27例拉米夫定耐药患者的YMDD突变类型分别为:YVDD突变5例,YVDD突变+L180M突变2例,YIDD突变13例,YIDD+L180M突变4例,YVDD突变+YIDD突变1例,YVDD突变+Y1DD突变+L180M突变2例,单独L180M突变未检出.根据治疗前是否存在肝硬化,分为肝硬化组和非肝硬化组.与肝硬化组相比,非肝硬化组慢性重型乙型肝炎的发生率低,预后好,年龄小,HBeAg阳性率高.8例离体肝组织病理分析显示两种主要病理类型,一种主要表现为活动性肝硬化,另一种为大块或亚大块坏死,肝脏显著萎缩.结论 肝硬化为拉米夫定耐药突变相关的慢性重型乙型肝炎的高危因素.拉米夫定耐药突变相关的慢性重型乙型肝炎可能存在两种发病机制.     

拉米夫定耐药突变相关慢性重型乙型肝炎27例分析

目的 研究在拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的过程中出现拉米夫定耐药突变相关的慢性重型乙型肝炎的临床特点.方法 回顾性分析27例在拉米夫定治疗过程中出现耐药突变的慢性重型乙型肝炎病例,分析其临床特征,用基因芯片法或基因测序法检测YMDD突变类型,对8例施行肝移植术后的离体肝组织分析其病理特点.采用χ2检验进行统计学分析.结果 27例拉米夫定耐药患者的YMDD突变类型分别为:YVDD突变5例,YVDD突变+L180M突变2例,YIDD突变13例,YIDD+L180M突变4例,YVDD突变+YIDD突变1例,YVDD突变+Y1DD突变+L180M突变2例,单独L180M突变未检出.根据治疗前是否存在肝硬化,分为肝硬化组和非肝硬化组.与肝硬化组相比,非肝硬化组慢性重型乙型肝炎的发生率低,预后好,年龄小,HBeAg阳性率高.8例离体肝组织病理分析显示两种主要病理类型,一种主要表现为活动性肝硬化,另一种为大块或亚大块坏死,肝脏显著萎缩.结论 肝硬化为拉米夫定耐药突变相关的慢性重型乙型肝炎的高危因素.拉米夫定耐药突变相关的慢性重型乙型肝炎可能存在两种发病机制.     

拉米夫定耐药突变相关慢性重型乙型肝炎27例分析

目的 研究在拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的过程中出现拉米夫定耐药突变相关的慢性重型乙型肝炎的临床特点.方法 回顾性分析27例在拉米夫定治疗过程中出现耐药突变的慢性重型乙型肝炎病例,分析其临床特征,用基因芯片法或基因测序法检测YMDD突变类型,对8例施行肝移植术后的离体肝组织分析其病理特点.采用χ2检验进行统计学分析.结果 27例拉米夫定耐药患者的YMDD突变类型分别为:YVDD突变5例,YVDD突变+L180M突变2例,YIDD突变13例,YIDD+L180M突变4例,YVDD突变+YIDD突变1例,YVDD突变+Y1DD突变+L180M突变2例,单独L180M突变未检出.根据治疗前是否存在肝硬化,分为肝硬化组和非肝硬化组.与肝硬化组相比,非肝硬化组慢性重型乙型肝炎的发生率低,预后好,年龄小,HBeAg阳性率高.8例离体肝组织病理分析显示两种主要病理类型,一种主要表现为活动性肝硬化,另一种为大块或亚大块坏死,肝脏显著萎缩.结论 肝硬化为拉米夫定耐药突变相关的慢性重型乙型肝炎的高危因素.拉米夫定耐药突变相关的慢性重型乙型肝炎可能存在两种发病机制.     

拉米夫定耐药患者乙型肝炎病毒聚合酶基因G743C和G743A点突变的检测及分析

目的 探讨拉米夫定耐药患者乙型肝炎病毒聚合酶(HBVP)基因点突变。方法 聚合酶链反应(PCR)扩增拉米夫定耐药患者的HBVP基因，产物经直接测序检测其YMDD变异；同时，用PCR-限制性片段长度多态性(PCR—RFLP)分析测序后的17例YIDD变异样本，先用3对引物扩增HBVP基因，再分别用3个限制性内切酶FokⅠ、SspⅠ、Alw441酶切扩增产物，酶切产物用8．0％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。结果 拉米夫定耐药患者HBVP基因PCR产物序列分析结果与GenBank的HBV标准株相比，发现16例存在HBVP基因G743C点突变和1例存在G743A点突变。其核苷酸序列由ATG变为ATC和ATA，YMDD基因序列发生变异，即由YMDD变异为YIDD；但是，PCRRFLP不能确定这17例样本存在YIDD变异。结论拉米夫定耐药患者存在HBVP基因G743C和G743A的点突变，同样引起YIDD变异；而PCR—RFLP法不能准确地检测出G743C和G743A的点突变；该发现对HBVP基因YMDD变异检测和临床均有指导意义。